CN101698837B - 丙酮酸激酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丙酮酸激酶，其氨基酸序列为(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者(2)对(1)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其丙酮酸激酶的功能不变的氨基酸序列。本发明还公开了编码所述丙酮酸激酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，以及包括上述丙酮酸激酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。本发明的丙酮酸激酶耐热性好、对于底物丙酮酸的Km值小，并且在宽的pH值范围内稳定性和活性(比活力)都很高。

Description

丙酮酸激酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种激酶，编码该酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，以及包括上述激酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。更具体地，本发明涉及一种丙酮酸激酶，编码该丙酮酸激酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，以及包括上述丙酮酸激酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。

背景技术

磷酸烯醇丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)和二磷酸腺苷(ADP)在钾离子依赖性丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)(EC 2.7.1.40)作用下生成丙酮酸(Pyruvate)和三磷酸腺苷(ATP)，生成的丙酮酸和还原型辅酶I(NADH)在乳酸脱氢酶的作用下生成L-乳酸和氧化型辅酶I。具体反应如以下的式一和式二所示：

(式一)

(式二)

由以上反应式可知，NADH的下降速率与钾离子浓度成正比，因此可以利用分光光度计，通过在340nm波长处监测NADH吸光度的变化，来计算出被测标本(例如，血清等体液)中的钾离子的含量。

现已经开发出符合以上原理的测定血清中钾离子浓度的试剂盒，例如东洋纺(TOYOBO)生产的血清钾离子浓度检测试剂盒。从上述式一可以看出，试剂盒中最重要的组份是丙酮酸激酶，它的活性直接决定了试剂盒能否正常使用以及由试剂盒所测得的测量结果是否准确。

但是目前的试剂盒所用的丙酮酸激酶存在着耐热性差(参见图7和图8)，使试剂盒的运输、保存和使用过程对环境温度要求较高，容易由于丙酮酸激酶的变性而影响到试剂盒测定的有效性和准确性。此外，目前的试剂盒所用的丙酮酸激酶只能在窄的pH值范围内保持较高的稳定性和活性(参见图5和图6)，大大局限了试剂盒能够测定的被测标本的范围，对测定的pH条件要求较高，从而对使用试剂盒的人员的操作技术水平要求也很高。

发明内容

本发明的一个目的是克服现有的丙酮酸激酶耐热性差、仅能在窄的pH值范围内保持较高的稳定性和活性的缺点，提供一种耐热性好、能在宽的pH值范围内保持较高的稳定性和活性的丙酮酸激酶。

本发明的第二个目的是提供编码所述丙酮酸激酶的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供包括所述核苷酸序列的重组载体。

本发明的第四个目的是提供包括所述重组载体的重组宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供包括上述丙酮酸激酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。

丙酮酸激酶作为酵解途径中的重要调节酶，广泛存在于多种生物体中，并且具有多种同功酶。但是不同生物体(比如哺乳动物、细菌等)来源的丙酮酸激酶的性质差别很大。本发明的发明人付出了大量地创造性劳动，利用对多种生物体设计引物钓取目的基因的方法，最终从干酪乳杆菌(Lactobacillus caseiATCC 334)中得到本发明具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的丙酮酸激酶。并且本发明的发明人意外地发现，所得丙酮酸激酶及其变异体耐热性好、对于底物丙酮酸的Km值小，并且在宽的pH值范围内稳定性和活性都很高。

本发明提供了一种丙酮酸激酶，其中，所述丙酮酸激酶的氨基酸序列为

(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者

(2)对(1)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其丙酮酸激酶的功能不变的氨基酸序列。

本发明还提供了编码本发明所述丙酮酸激酶的核苷酸序列。

本发明还提供了包括本发明所述核苷酸序列的重组载体。

本发明还提供了包括本发明所述重组载体的重组宿主细胞。

本发明还提供了包括本发明所述的丙酮酸激酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。

本发明提供的丙酮酸激酶具有如下优点：

第一，耐热性好。参见图3和图4可知，本发明的丙酮酸激酶在60℃加热10分钟条件下都具有50％以上的相对活性，明显高于在相同条件下的对比例1(参见图7和图8)的丙酮酸激酶的相对活性。

第二，在宽的pH值范围内稳定性和活性都很高。参见图1和图2可知，本发明的丙酮酸激酶在pH4至11条件下都具有50％以上的相对活性，明显高于在相同条件下的对比例1(参见图5和图6)的丙酮酸激酶的相对活性。

第三，对于底物丙酮酸的Km值小。本发明的丙酮酸激酶在37℃条件下对于底物丙酮酸的Km值仅为0.8×10^-3，而在相同条件下对比例1的丙酮酸激酶对于底物丙酮酸的Km值达1.0×10^-2。

附图说明

图1制备实施例1的丙酮酸激酶pH稳定性曲线图；

图2制备实施例1的丙酮酸激酶pH活性曲线图；

图3制备实施例1的丙酮酸激酶温度稳定性曲线图；

图4制备实施例1的丙酮酸激酶温度活性曲线图；

图5对比例1的丙酮酸激酶pH稳定性曲线图；

图6对比例1的丙酮酸激酶pH活性曲线图；

图7对比例1的丙酮酸激酶温度稳定性曲线图；

图8对比例1的丙酮酸激酶温度活性曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种丙酮酸激酶，其中，所述丙酮酸激酶的氨基酸序列为

(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者

(2)对(1)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其丙酮酸激酶的功能不变的氨基酸序列。

本领域人员公知，组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：

1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；

2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；

3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；

4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。例如，本领域技术人员公知，Ala和Ser、Val和Ile、Asp和Glu、Ser和Thr、Ala和Gly、Ala和Thr、Ser和Asn、Ala和Val、Ser和Gly、Tyr和Phe、Ala和Pro、Lys和Arg、Asp和Asn、Leu和Ile、Leu和Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，两两之间相互取代，不会影响蛋白的立体结构和功能。例如本发明制备实施例3中记载的氨基酸序列在SEQ ID NO：1的第327位上丝氨酸被丙氨酸取代，或者本发明制备实施例4中记载的氨基酸序列在SEQ ID NO：1的第391位上异亮氨酸被缬氨酸取代，具有所得氨基酸序列的丙酮酸激酶在结构和功能上没有差异。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在丙酮酸激酶上的任意一个氨基酸残基位置上。相反，不同类别的氨基酸残基发生取代，或者氨基酸的取代不符合上述列举的取代规律，很可能会使蛋白的结构发生变化，功能出现差异。

本发明提供的丙酮酸激酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的丙酮酸激酶存在氨基酸序列上的差异，或者有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他己知分子生物学的技术获得。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

优选情况下，所述丙酮酸激酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者为第327位丝氨酸被丙氨酸取代的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者为第391位异亮氨酸被缬氨酸取代的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本发明还提供了编码本发明所述丙酮酸激酶的核苷酸序列。

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的丙酮酸激酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述丙酮酸酶活性一致的氨基酸序列。

优选情况下，本发明所述核苷酸序列为

(1)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者

(2)SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；或者

(3)对SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或增加而得到的核苷酸序列，该核苷酸序列编码的丙酮酸激酶功能不变。(3)所述的核苷酸序列指在高严谨条件下可以与SEQ IDNO：2或者SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，所述高严谨条件是指在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。所述核苷酸序列更优选为SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。所述核苷酸序列最优选为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。本发明的发明人通过大量的实验最终确定的SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，由于可能更符合例如大肠杆菌的基因工程菌的密码子偏好性，因而更有利于基因工程菌表达蛋白产物。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列和重组工程菌，可以很容易获得模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增，然后将所得片段按正确次序拼接。一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。

本发明还提供了包括本发明所述核苷酸序列的重组载体。本领域公知，所述重组载体一般包括空载体和插入该空载体的目的基因，所述目的基因为本发明所述的丙酮酸激酶的核苷酸序列。

在本发明中，所述“空载体”(或称“载体”)可选用本领域己知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选pET28b质粒或其他大肠杆菌表达载体如pKK223-3，pEX1/2/3、pUC18等。所述空载体可以包括多种常用的检测标记(例如荧光标记、抗生素标记等报告基因)和酶切位点。重组载体构建可采用空载体本身多克隆位点的各种核酸内切酶(如对于pUC18，可用SalI、BamHI、EcoRI等，对于pET28a，可用Ndel、Nhel、EcoRI、BamH、HindIII等，对于pET28b可用EcoRI、NdeI、BamH、HindIII等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。优选所述重组载体为pET28b-PK或pKK223-3-PK，pEX1/2/3-PK等。本发明优选采用EcoR I和Nde I双酶切pET28b及与其连接的PCR产物片段，经连接酶连接，构建本发明的重组载体pET28b-PK。

本发明还提供了包括本发明所述重组载体的重组宿主细胞。

可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化；所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母(如毕赤酵母)或各种动植物细胞，更优选所述宿主细胞为本领域常用的基因工程菌，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母。最优选所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

可以使用本领域常用的方法从重组宿主细胞中分离和纯化丙酮酸激酶。例如，离心分离培养基和重组宿主细胞，高压匀浆破碎细胞、离心过滤去除细胞碎片，亲和层析纯化丙酮酸激酶。对于分离纯化所得的丙酮酸激酶的产物，可以使用本领域常用的方法进行纯度鉴定。例如，考马斯亮蓝法、凯氏定氮法、双缩脲法、lowry法、紫外吸收法、亲和层析、酶活性、抗原抗体法、电泳分析(例如十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)、沉降分析、扩散分析、恒溶度法、蛋白质谱等。

本发明还提供了包括本发明所述的丙酮酸激酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。优选情况下，本发明的试剂盒包括丙酮酸激酶，而不包括核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞。更优选本发明的试剂盒包括丙酮酸激酶的干粉，而不包括核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞。可以用本领域常用的方法制备丙酮酸激酶的干粉，只要该方法能够得到丙酮酸激酶的干粉，并且不破坏丙酮酸激酶的干粉的活性即可。例如使用真空减压浓缩器得到浓缩的酶液，然后使用冷冻干燥机干燥浓缩的酶液；或者使用真空减压干燥器等设备。由于本发明的丙酮酸激酶耐热性好，还可以使用喷雾干燥的技术得到该酶的干粉。丙酮酸脱氢酶的干粉在使用时可以通过溶解于pH7.5-10的缓冲液体系(例如三乙醇胺缓冲液、磷酸盐缓冲液，优选pH为7.6-8)中而转化为液体形式。

本发明的试剂盒还可以包括本领域常用于丙酮酸激酶试剂盒的成分。对应于本发明的试剂盒中的丙酮酸激酶可以是液体形式和/或固体干粉形式，本发明的试剂盒中的其他成分也可以是液体形式和/或固体干粉形式。例如，当本发明的试剂盒为液体形式时，一般可以含有试剂一(R1)和试剂二(R2)；其中，所述试剂一可以包括溶于pH7.5-10的三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液中的10-50U/mL的谷氨酸脱氢酶(GLDH)、1.0-20U/mL的丙酮酸激酶、1.0-10mmol/L的α-酮戊二酸、3-15mmol/L的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、3.15-15.5mmol/L的ADP和0.3-1.5mmol/L的NADH；所述试剂二可以含有溶于pH 9-12的三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液中的50-100U/mL的乳酸脱氢酶(LDH)、以及5-25mmol/L的α-硝基酚半乳糖苷。优选情况下，所述试剂一可以包括溶于pH8-9的三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液中的10-30U/mL的谷氨酸脱氢酶、1.0-10U/mL的丙酮酸激酶、1.0-5mmol/L的α-酮戊二酸、3-10mmol/L的磷酸烯醇式丙酮酸、3.15-10mmol/L的ADP和0.3-1.0mmol/L的NADH；所述试剂二可以含有溶于pH 9-11的三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液中的60-85U/mL的乳酸脱氢酶、以及5-15mmol/L的α-硝基酚半乳糖苷。更优选的情况下，所述试剂一可以包括溶于pH8.0-8.5的三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液中的10-15U/mL的谷氨酸脱氢酶、1.0-5U/mL的丙酮酸激酶、1.0-3mmol/L的α-酮戊二酸、3-6mmol/L的磷酸烯醇式丙酮酸、3.15-6.5mmol/L的ADP和0.3-0.8mmol/L的NADH；所述试剂二可以含有溶于pH 9-10的三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液中的60-80U/mL的乳酸脱氢酶、以及5-10mmol/L的α-硝基酚半乳糖苷。

以上所述的试剂一和试剂二分别都可以通过冷冻干燥技术，结合减压蒸馏技术、反渗透技术及超滤技术等，制备成试剂一干粉(其中包含本发明的丙酮酸激酶干粉)和试剂二干粉。所述干粉可以在检测待测标本前用选自去离子水、蒸馏水和双蒸水的溶剂复溶至所述试剂的原有体积。因此本发明的试剂盒可以包括液体形式的试剂一和试剂二，或者可以包括试剂一干粉和液体形式的试剂二，或者可以包括液体形式的试剂一和试剂二干粉，或者可以包括固体形式的试剂一干粉和试剂二干粉。

在检测待测标本中的钾离子时，先将体积比为1∶100至1∶10的待测标本(或钾离子校准液)与试剂一混合，在37℃下保温300秒后，向混合物中加入试剂二。所述钾离子校准液可以是含有钾离子的水溶液，例如，已知浓度的KCl水溶液、K₂CO₃水溶液。将所得试剂一、试剂二和待测标本(或钾离子校准液)的混合液在37℃下保温60秒时，在340nm下通过分光光度计记录吸光度数值A1，在测定A1后的第180秒记录吸光度数值A2。按照以下式三计算钾离子的浓度：

其中，ΔA＝A2-A1，即ΔA_标本＝A2_标本-A1_标本，ΔA_校准＝A2_校准-A1_校准。通常采用两种校准液即钾离子浓度为2.55mmol/L的低值校准液和钾离子浓度为6.15mmol/L的高值校准液。所述校准液可以使其他具有4-5mmol/L差值的钾离子溶液，但校准液的最低值不得低于0.5mmol最高值不得高于10mmol否则会超出分光光度计的量程。使用本发明的试剂盒时，一般可达到的准确的钾离子浓度测量范围为2.0-10.0mmol/L。本发明的试剂盒可以包括记载有上述各种组分使用方法和用量的说明书。因此，所述标准液也可以不配备在试剂盒中，由使用者在使用前按照试剂盒说明书的记载根据现有技术配制即可。

适于使用本发明所述试剂盒的待测标本可以使动物体(包括人体)健康状态下以及病理状态下产生的各种体液，例如：血液、淋巴液、脑脊髓液、胃液及各种消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液、乳汁、羊水、胆汁、肋膜积液(又称胸水)、支气管液、滤泡液、腹腔积液(又称腹水)、心包膜积液、关节积液、各器官的囊肿积液等等。

下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。

制备实施例1

(1)干酪乳杆菌(Lactobacillus casei ATCC 334)基因组DNA的提取

将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei ATCC 334)以1×10³细胞/毫升的接种量，在37℃、200转/分的转速下100ml培养基中振荡培养18小时后，该细菌的密度达到4×10⁸细胞/毫升。所述培养干酪乳杆菌的培养基配方为：牛肉膏3g/L；蔗糖2g/L；大豆蛋白胨10g/L；氯化钠2g/L；培养基的溶剂为无菌蒸馏水，培养基的pH为7.5。其中g/L为固体物质与溶剂的重量体积比。

在有盖50ml离心管中加入20ml提取缓冲液I在65℃水浴预热备用，所述提取缓冲液I含有100mmol/L Tris盐酸、pH8.0、20mmol/L EDTA、500mmol/LNaCl和1.5％SDS。在10000rpm下离心10min收集干酪乳杆菌菌体。将离心得到的菌体与液氮以体积比1∶1的比例在研钵中混合后充分研磨后，倒入所述65℃预热的离心管中，混匀，65℃水浴温育10分钟。然后加入20ml符合25∶24∶1的比例的酚/氯仿/异戊醇混合物，颠倒混匀，4℃下12000rpm离心5分钟。移取上清液至另一50ml离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清得到提取的基因组DNA 15微克。

将提取的基因组DNA 15微克，溶解在10mmol/L的Tris-Cl缓冲液中备用，该缓冲液的pH为8.0，并且同时含有1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)。

(2)钓取目的基因(即丙酮酸激酶基因)

本发明的发明人设计了正向引物：ATCGCATATGAAAAAAACCAAGATCGTC(SEQ ID NO：4)，其上附加有NdeI酶切位点；反向引物：ATCGGAATTCTTAAAGGGCGTTGGTAGC(SEQ ID NO：5)，其上附加有EcoRI酶切位点。以上述步骤(1)得到的干酪乳杆菌基因组DNA为模板，按照如下条件扩增丙酮酸激酶基因：

聚合酶链式反应的混合物包括正向引物：3μl；反向引物：3μl；dNTPs：3μl；10×缓冲液：10μl；高保真Taq酶(Pyrobest Taq)：1μl；基因组DNA：100ng；加双蒸水至100μl，退火温度为52℃，延伸时间为2分钟，30个循环得到基因扩增产物。将得到的扩增基因片段用琼脂糖凝胶电泳回收纯化出1.7-1.8kb单一条带的DNA片段。

将所得DNA片段用美国应用生物系统公司的310型全自动DNA测序仪测序，测序结果显示：所得DNA片段中含有长度为1764bp(起始于起始密码子atg并终止于终止密码子taa)的蛋白编码基因，详细序列如SEQ ID NO：2所示。

(3)构建重组载体

用限制性内切酶NdeI和EcoRI酶切(2)得到的蛋白编码基因，酶切所得大片段通过使用T4DNA连接酶，连接至同样已经用限制性内切酶NdeI和EcoRI酶切过的空载体pET28b上。将包括重组载体的连接反应产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，然后所得转化产物涂布在含有50μg/mL的卡那霉素LB琼脂平板上，在37℃培养过夜，随机挑选10个克隆接种到含有50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养后，提取质粒，用限制性内切酶NdeI和EcoRI进行酶切，琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。结果测到大小约为1.8Kb片段的酶切片段的相应重组质粒为阳性克隆，即证明获得了重组表达载体pET28b-PK。培养所述阳性克隆，提取重组表达载体pET28b-PK。所述重组表达载体pET28b-PK在pH为7.5的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液中保存。

(4)重组载体对宿主细胞的转化以及所得重组宿主细胞的培养

挑取在LB固体培养基上37℃培养16小时的大肠杆菌BL21(DE3)的单菌落，于液体LB培养基中在37℃、150rpm的摇床再培养16小时。取1ml所得液体培养物转接于100ml新鲜液体LB培养基中，在37℃摇床上以250-300rpm的转速剧烈振荡培养2.5小时。吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟后，在4℃、3000g下离心5分钟。弃去上清，加入100μl在冰上预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，重悬细胞，在冰放置20分钟。然后在4℃、3000g下离心5分钟，弃去上清，加入100μl在冰上预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，重悬细胞，得到感受态的宿主细胞。

取200μl上述感受态的大肠杆菌BL21(DE3)置于1.5ml离心管中，加入体积为10μl的pET28b-PK溶液(其中pET28b-PK含量为40ng)轻轻摇匀，冰上放置30分钟。然后在42℃水浴中热击90秒，接着迅速置于冰上冷却5分钟。向离心管中加入1ml LB液体培养基(不含卡那霉素)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的卡那霉素抗生素抗性基因(Ampr)。将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Kan的LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养20小时。在筛选平板上出现了大肠杆菌的菌落，即pET28b-PK已经转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到了本实施例的重组宿主细胞——大肠杆菌BL21(DE3)-pET28bPK。

配制3L LB培养基加入到5L发酵罐中，在121℃灭菌15分钟，完全冷却至室温后加入卡那霉素，使其终浓度为50ug/mL。在所得培养基中加入60mL生长至对数生长期的上述大肠杆菌BL21(DE3)-pET28bPK(10⁶细胞/毫升)。在37℃下培养至发酵液取样中的细胞密度达到10⁷细胞/毫升。然后加入1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，诱导8小时后发酵完毕。

(5)蛋白产物的分离提纯

将(4)得到的发酵液在10000rpm下离心10min，收集重组宿主细胞沉淀。弃去上清，将所得重组宿主细胞重悬于等体积的pH为7.5的50mmol/L的Tris-HCl溶液中。用高压匀浆机破碎重悬的细胞，在10000rpm下离心10min，收集上清粗酶液，弃取细胞碎片沉淀。

将上述所得粗酶液用孔径为0.22μm滤膜过滤后，所得滤液在美国通用电子公司(GE公司)的安克塔纯化者(AKTA Purifier)镍亲和层析柱上进行亲和层析。其中，上样缓冲液为50mmol/L的pH为7.5的Tris-HCl缓冲液。在流过两个柱体积的上样缓冲液后，使用洗脱缓冲液，其为含有0.5mol/L咪唑的50mmol/L的pH为7.5的Tris-HCl缓冲液。当咪唑浓度达0.3mol/L时开始收集蛋白，收集实时监测到的蛋白单峰结束。

向收集到的蛋白溶液中加入40％(W/V)硫酸铵沉淀，然后在10000rpm的转速下离心10分钟。收集蛋白沉淀，并用0.1mol/L的pH为7.5的Tris-HCl缓冲液复溶。所得溶液用孔径为0.22μm的滤膜过滤后，所得滤液再用葡聚糖凝胶G-25层析柱(Sephadex G-25)脱盐。所述脱盐缓冲液是0.1mol/L的pH为7.5的Tris-HCl缓冲液。在用脱盐缓冲液平衡好的层析柱上上样，其中样品溶液(即上述用0.1mol/L的pH为7.5的Tris-HCl缓冲液复溶的蛋白溶液)的流速为5ml/min，然后用脱盐缓冲液以15ml/min的流速洗脱2个柱体积。收集洗脱下的液体共500毫升。

所收集的液体在普通冰箱中-10℃下冷冻2小时，然后再-40℃深冷冰箱预冻8小时，在德国科瑞斯特(CHRIST)的ALPHA 1-4 LSC型冷冻干燥机中，以真空度0.04mbar、安全压力0.100mbar且冷阱温度-60℃的条件冻干10小时。然后等物料温度与冻干机隔板温度差为零，并且观察在15秒内压力指示不变时，结束冻干。冻干所得蛋白质的量为10克。冻干蛋白在冷冻条件下密封保存。

采用《蛋白质电泳试验技术》(郭尧君，132-145页，科学出版社，1999年)记载的SDS-PAGE电泳的方法测定出本实施例的蛋白质的分子量为64KD，并且根据《生物化学》(王镜岩等，高等教育出版社，2002，见168页)记载的蛋白质一级结构的测定方法(分肽段测定)，测得本实施例的蛋白质有588个氨基酸残基(参见SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列)，与由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码的蛋白质结果一致。

按照文献“丙酮酸激酶反应的静态和动态研究(Equilibrium and KineticStudies of the Pyruvic Kinase Reaction)”，John T.McQuate和Merton F.Utter，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，第234卷，第2151-2157页，1959年，所记载的方法，测到本实施例的蛋白不仅具有丙酮酸激酶的活性，并且具有的丙酮酸的Km值为0.8×10^-2mol/L，足以满足临床上测定待测标本中钾离子浓度的试剂盒的对丙酮酸激酶的要求(37℃下的丙酮酸的Km值至多为0.8×10^-2mol/L)。

综上，本发明的发明人得到了一种新的丙酮酸激酶，其来源于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei ATCC 334)，分子量为64KD，具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列以及SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。其中，本领域技术人员通过阅读本实施例，可以知晓本发明的核苷酸序列例如SEQ ID NO：2，并可以通过化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此可以在得到具有该核苷酸序列的核酸后，无需实施本实施例第(1)-(2)步，而是直接从本实施例第(3)步开始重复本实施例。

制备实施例2

按照SEQ ID NO：3对SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列进行定点突变，得到SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的同义突变核苷酸序列。然后将得到的核苷酸序列按照制备实施例1的方法连接到pET28b空载体上，也转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。在相同条件下培养所得重组宿主细胞，结果本实施例的丙酮酸激酶产量比制备实施例1提高了10％。

制备实施例3

将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列第979位的核苷酸定点突变，即由密码子“T”突变为“G”。按照制备实施例1的方法连接到pET28b空载体上，也转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。在相同条件下培养所得重组宿主细胞，结果得到的丙酮酸激酶，其氨基酸序列为第327位丝氨酸被丙氨酸取代的SEQID NO：1所示的氨基酸序列，其Km值为0.8×10^-2mol/L，其丙酮酸激酶的产量与制备实施例1持平。

制备实施例4

将SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列第1174位的核苷酸定点突变，即由密码子“T”突变为“G”。按照制备实施例1的方法连接到pET28b空载体上，也转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。在相同条件下培养所得重组宿主细胞，结果得到的丙酮酸激酶，其氨基酸序列为第392位丝氨酸被丙氨酸取代的SEQID NO：1所示的氨基酸序列，其Km值为0.8×10^-2mol/L，其丙酮酸激酶的产量比制备实施例1持平。

对比例1

本对比例为东洋纺公司(TOYOBO)生产的兔肌来源的丙酮酸激酶，其分子量为237KD，对丙酮酸的Km为1.0×10^-2mol/L，最适pH值7.0，最适温度40℃。

测试实施例1

按照如下方法测试制备实施例1-4和对比例1的丙酮酸激酶活性：

1)测定试剂：

试剂1(R1)：

pH为7.6的三乙醇胺缓冲液：122mmol/L

氯化镁(MgCl₂)：3.6mmol/L

磷酸烯醇丙酮酸钾盐：0.7mmol/L

氯化钾(KCl)：13.5mmol/L

二磷酸腺苷(ADP)：18.66mmol/L

乳酸脱氢酶(LDH)：1.5U/mL

试剂2(R2)：

pH为9.0的Tris-Cl缓冲液：40mmol/L

NADH：1.2g/L

酶干粉用pH为7.6的三乙醇胺缓冲液稀释至1000U/L。

2)操作过程：

取0.9mL试剂R1加上0.3mL试剂R2混匀，37℃保温3分钟，然后加入0.04mL的酶液。在340nm下根据NADH的减少量来判断丙酮酸激酶的酶活。线性范围是0.2-1KU/L。在37℃条件下，1分钟氧化1微摩尔NADH的酶量为1个酶活力单位。其中，1KU的酶活力是指，在37℃下1分钟内NADH减少1000微摩尔。

3)酶活计算公式

酶活(U/mg)＝(U/mL)×1/C

其中，Vt：总体积(1.24mL)

Vs：酶液样品体积(0.04mL)

6.22：在测定条件下NADH的摩尔吸光系数(cm²/μmoL)

1.0：光径长度(cm)

df：稀释倍数

C：溶液中酶浓度

4)测试结果见下表1

表1

丙酮酸激酶	制备实施例1	制备实施例2	制备实施例3	制备实施例4	对比例1
						酶活(KU/mg)	0.080	0.080	0.079	0.065	0.100

由以上结果可知，实施例1-4的丙酮酸激酶其酶活力与对比例1相比在同一数量级上，完全能够满足临床上测定待测标本中钾离子浓度的试剂盒的对丙酮酸激酶的要求。

测试实施例2

按照如下方法测试制备实施例1-4和对比例1的丙酮酸激酶的pH稳定性：

将0.5KU的丙酮酸激酶在25℃下，分别溶于PH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的100mmol/L三乙醇胺缓冲液中，静置20小时。除“酶干粉用pH为7.6的三乙醇胺缓冲液稀释至1000U/L”的步骤不同外，按照测试实施例1的方法测定酶活。按所测酶活与最大所测酶活的比值百分数即相对活性为纵坐标，pH为横坐标绘制曲线。制备实施例1的测试结果见图1，对比例1的测试结果见图5。制备实施例2与制备实施例1所得蛋白的氨基酸序列相同，制备实施例3和制备实施例4的蛋白与制备实施例1性质相同(未示出)。

从图中可以看出，制备实施例1-4的pH稳定性显著好于对比例1，这样一来包括本发明的丙酮酸激酶的试剂盒能够测定的待测样本的种类比现有技术更多，对试剂盒的运输、保存的条件降低，对使用试剂盒的人员的操作精密精细要求降低，有利于带有丙酮酸激酶的试剂盒的普及。

测试实施例3

按照如下方法测试制备实施例1-4和对比例1的丙酮酸激酶的最适pH：

将0.5KU的丙酮酸激酶在37℃下，分别溶于pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的100mmol/L三乙醇胺缓冲液中放置五分钟。除“酶干粉用pH为7.6的三乙醇胺缓冲液稀释至1000U/L”的步骤不同外，按照测试实施例1的方法测定酶活。按所测酶活与最大所测酶活的比值百分数即相对活性为纵坐标，pH为横坐标绘制曲线。制备实施例1的测试结果见图2，对比例1的测试结果见图6。制备实施例2与制备实施例1所得蛋白的氨基酸序列相同，制备实施例3和制备实施例4的蛋白与制备实施例1性质相同(未示出)。

从图中可以看出，制备实施例1-4的最适pH大于对比例1，在多种常规偏碱性的待测标本(比如血清)中更稳定。并且结合表1的数据可知，即使制备实施例的酶活性在pH7.0时下降至最适pH值时的70％，其活力仍然高于对比例1。

测试实施例4

按照如下方法测试制备实施例1-4和对比例1的丙酮酸激酶的热稳定性：

将0.5KU的丙酮酸激酶干粉溶于pH值为8.0的100mmol/L三乙醇胺缓冲液中，分别在35、40、45、50、60、65℃下，静置30分钟。除“酶干粉用pH为7.6的三乙醇胺缓冲液稀释至1000U/L”的步骤不同外，按照测试实施例1的方法测定酶活。按所测酶活与最大所测酶活的比值百分数即相对活性为纵坐标，温度为横坐标绘制曲线。制备实施例1的测试结果见图3，对比例1的测试结果见图7。制备实施例2与制备实施例1所得蛋白的氨基酸序列相同，制备实施例3和制备实施例4的蛋白与制备实施例1性质相同(未示出)。

从图中可以看出，制备实施例1-4的热稳定性显著大于对比例1。在60℃加热10分钟条件下都具有50％以上的相对活性，明显高于在相同条件下的对比例1的丙酮酸激酶的相对活性。

测试实施例5

按照如下方法测试制备实施例1-4和对比例1的丙酮酸激酶的最适温度：

将0.5KU的丙酮酸激酶干粉溶于PH值为8.0的100mmol/L三乙醇胺缓冲液中，分别在35、40、45、50、60、65℃下，放置5分钟。除“酶干粉用pH为7.6的三乙醇胺缓冲液稀释至1000U/L”的步骤不同外，按照测试实施例1的方法测定酶活。按所测酶活与最大所测酶活的比值百分数即相对活性为纵坐标，温度为横坐标绘制曲线。制备实施例1的测试结果见图4，对比例1的测试结果见图8。制备实施例2与制备实施例1所得蛋白的氨基酸序列相同，制备实施例3和制备实施例4的蛋白与制备实施例1性质相同(未示出)。

从图中可以看出，制备实施例1-4的最适温度显著大于对比例1，在多种高温恶劣环境中可以保持稳定。并且结合表1的数据可知，即使制备实施例的酶活性在37℃时下降至最适温度的约20％，其活力仍然高于同温度下的对比例1。

制备实施例5-8

按照表2的配方配制试剂一和试剂二：

表2

制备实施例5和6的试剂一和试剂二分别配制成液体形式即可。制备实施例7和8的试剂一和试剂二分别在如下条件下冷冻干燥：在普通冰箱中-10℃下冷冻2小时，然后再-40℃深冷冰箱预冻8小时，在德国科瑞斯特(CHRIST)的ALPHA 1-4 LSC型冷冻干燥机中，以真空度0.04mbar、安全压力0.100mbar且冷阱温度-60℃的条件冻干10小时。然后等物料温度与冻干机隔板温度差为零，并且观察在15秒内压力指示不变时，结束冻干。冻干得到的试剂干粉可以在使用前用蒸馏水复溶成原液体形式的体积。冻干得到的试剂干粉，比液体形式的试剂保存的时间更长，包装要求较低，并且体积更小，运输更容易。

制备实施例5-8具有钾离子浓度为2.55mmol/L的低值校准液(KCl)和钾离子浓度为6.15mmol/L的高值校准液(KCl)。

对比例2

按照与制备实施例5相同的配方配制成液体形式的试剂盒。

测试实施例6

本测试实施例测量了两个待测标本：一个是3.50mmol/L的KCl水溶液标准品；另一个为健康状况良好的30岁女性的血清待测标本，抽取其10ml血液，静置至血细胞沉淀分层，取上层血清5ml用于对制备实施例5-8和对比例2的试剂盒进行检验。

分别将制备实施例5-8中的R1取200μl，加上标本6μl，标本和R1在37℃保温300秒，加入R2。R1、R2和标本混合液在37℃条件下保温60秒，340nm条件下记录吸光度数值A1，180秒记录吸光度数值A2，根据吸光度数值的变化，并按照式三计算钾离子的浓度。测试结果见表3。

表3

由表3可以看出，制备实施例5-8的试剂盒测试结果比对比例2更接近真实值；并且制备实施例5-8的试剂盒测试结果标准偏差明显小于对比例2，说明本发明的试剂盒性能更稳定，测量更准确。

序列表

<110>北京利德曼生化股份有限公司

<120>丙酮酸激酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞和试剂盒

<130>OICN093429

<160>5

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>588

<212>PRT

<213>Lactobacillus casei

<400>1

Met Lys Lys Thr Lys Ile Val Ser Thr Leu Gly Pro Ala Ser Asn Thr

1               5                   10                  15

Thr Asp Ile Ile Val Lys Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asn Val Phe Arg

            20                  25                  30

Phe Asn Phe Ser His Gly Asp His Glu Glu His Leu Ala Arg Met Asn

        35                  40                  45

Met Val His Glu Ala Glu Lys Ile Thr Gly Lys Thr Val Gly Ile Met

    50                  55                  60

Leu Asp Thr Lys Gly Ala Glu Ile Arg Thr Thr Leu Glu Asp Thr Pro

65                  70                  75                  80

Asn Gly Lys Ile Asp Phe His Thr Gly Asp Lys Val Arg Ile Ser Met

                85                  90                  95

Asp Ala Ser Leu Lys Gly Thr Lys Glu Lys Val Ala Val Thr Tyr Pro

            100                 105                 110

Gly Leu Tyr Asp Asp Thr His Val Gly Gly His Val Leu Phe Asp Asp

        115                 120                 125

Gly Leu Ile Asp Met Lys Ile Thr Glu Lys Asp Glu Lys Asn Arg Glu

    130                 135                 140

Leu Val Thr Val Val Gln Asn Asp Gly Val Leu Gly Gly Lys Lys Gly

145                 150                 155                 160

Val Asn Ala Pro Gly Val Ala Ile Asn Leu Pro Gly Ile Thr Glu Lys

                165                 170                 175

Asp Ser Asp Asp Ile Arg Phe Gly Leu Asp Asn Gly Ile Asn Phe Ile

            180                 185                 190

Ala Ala Ser Phe Val Arg Lys Pro Gln Asp Val Leu Asp Ile Arg Glu

        195                 200                 205

Leu Leu Glu Glu Lys Asn Ala Leu Asn Val Gln Ile Phe Pro Lys Ile

    210                 215                 220

Glu Ser Gln Glu Gly Ile Asp Asn Ile Asp Asp Ile Leu Lys Val Ser

225                 230                 235                 240

Asp Gly Leu Met Val Ala Arg Gly Asp Met Gly Val Glu Ile Pro Phe

                245                 250                 255

Glu His Val Pro Ile Val Gln Lys Arg Leu Ile Lys Lys Cys Asn Ser

            260                 265                 270

Leu Gly Lys Pro Val Ile Thr Ala Thr Gln Met Leu Asp Ser Met Gln

        275                 280                 285

Glu Asn Pro Arg Pro Thr Arg Ala Glu Val Asn Asp Val Ala Asn Ala

    290                 295                 300

Val Phe Asp Gly Thr Asp Ala Thr Met Leu Ser Gly Glu Ser Ala Asn

305                 310                 315                 320

Gly Asp Tyr Pro Val Glu Ser Val Ala Ala Met Ala Arg Ile Asp Glu

                325                 330                 335

Tyr Thr Glu Ala Ala Met Met Asp Gln Asp Ala Phe Ala Leu Lys Glu

            340                 345                 350

Ser Ser Asn Lys Asn Val Thr Glu Ala Val Gly Gln Ser Val Ala His

        355                 360                 365

Thr Ala Arg Asn Leu Gly Val Lys Thr Ile Val Ala Ala Thr Glu Ser

    370                 375                 380

Gly Tyr Thr Ala Arg Met Ile Ser Lys Tyr Arg Pro Lys Ala Asp Ile

385                 390                 395                 400

Leu Ala Ile Thr Phe Ser Glu Lys Thr Gln Arg Gly Leu Met Val Asn

                405                 410                 415

Trp Gly Val Tyr Pro Ile Ile Ala Glu Lys Pro Ala Asn Thr Asp Ala

            420                 425                 430

Met Phe Asp Leu Ala Thr Lys Lys Ala Gln Asp Leu Gly Phe Ala Lys

        435                 440                 445

Glu Gly Asp Leu Ile Leu Ile Thr Ala Gly Val Pro Val Gly Glu Ser

    450                 455                 460

Gly Thr Thr Asn Val Met Lys Val Gln Leu Ile Gly Ser Lys Leu Val

465                 470                 475                 480

Gln Gly Ser Gly Val Gly Asp Glu Ser Thr Ile Gly Lys Ala Val Ile

                485                 490                 495

Ala Ser Asn Ala Gln Glu Ala Ala Ala Lys Met Gln Lys Gly Asp Ile

            500                 505                 510

Leu Val Val Lys Thr Thr Asp Lys Asp Tyr Leu Pro Ala Ile Glu Lys

        515                 520                 525

Ala Ala Ala Leu Val Val Glu Thr Gly Gly Leu Thr Ser His Ala Ala

    530                 535                 540

Val Val Gly Ile Ala Met Gly Ile Pro Val Val Val Gly Ala Glu Asn

545                 550                 555                 560

Ala Thr Ser Val Ile Ser Asp Gly Gln Ile Ile Thr Val Asp Ser Arg

                565                 570                 575

Arg Gly Ile Ile Tyr Lys Gly Ala Thr Asn Ala Leu

            580                 585

<210>2

<211>1767

<212>DNA

<213>Lactobacillus casei

<400>2

atgaaaaaaa ccaagatcgt cagcacgctt ggacctgcaa gtaacaccac tgatatcatc     60

gttaagttga ttgaagcggg tgccaacgtt ttccgtttca atttctcaca tggtgatcat    120

gaagagcatt tggcacggat gaacatggtt cacgaagctg aaaagatcac gggtaagacc    180

gttggtatca tgctggatac gaagggtgcc gaaattcgga caactcttga agataccccg    240

aatggtaaga tcgattttca caccggtgat aaagttcgca tctccatgga tgcaagtctg    300

aaaggcacca aggaaaaagt tgctgttacc tatcctggcc tttatgatga cactcacgtt    360

ggcggccatg ttttgtttga tgatggcttg attgacatga agatcaccga aaaggacgaa    420

aagaaccgtg aactcgttac cgttgttcaa aacgacggtg tccttggtgg taagaaaggt    480

gtcaacgctc ctggtgttgc catcaacttg cctgggatta cggaaaaaga ctccgatgac    540

attcgtttcg gcttggacaa cgggatcaac ttcattgctg cttccttcgt tcgtaagcct    600

caagacgttt tagacattcg tgaactcctt gaagaaaaga acgcacttaa tgttcagatc     660

ttccctaaga tcgaatcaca agaaggcatc gacaacattg atgacatctt gaaggtttcc     720

gatggcttaa tggttgctcg tggcgacatg ggtgttgaaa ttccatttga acatgttccg     780

atcgttcaga agcgcttgat caagaagtgc aactctttgg gtaagccggt tatcacggct     840

acacaaatgt tggattccat gcaagaaaac ccacgtccta cccgtgccga agtaaacgac     900

gttgccaatg ccgtgtttga tggcaccgat gcaacgatgc tttctggcga atctgctaat     960

ggtgactatc cggttgaatc cgttgctgca atggctcgga ttgacgaata caccgaagca    1020

gcgatgatgg atcaggatgc cttcgcattg aaggaatcca gtaacaagaa cgtcaccgaa    1080

gctgttggcc aaagtgttgc acacacggct cgcaacttag gggttaagac cattgttgct    1140

gcgaccgaat ccggctacac tgcccgcatg atttccaagt atcgtccgaa ggctgacatt    1200

cttgccatta ccttcagcga aaagactcaa cgcggcctga tggtcaactg gggcgtttac    1260

ccaatcattg ctgaaaagcc tgctaacacc gatgctatgt tcgacttggc aaccaagaag    1320

gcccaagacc ttggctttgc taaggaaggc gatctgatct tgatcactgc cggtgttcct    1380

gttggtgaat ctggcacaac caacgtaatg aaggttcaac tcattggctc caagctggtt    1440

caaggctcag gtgtcggcga cgaatccacg attggtaagg cagtcatcgc aagcaacgct    1500

caagaagctg ctgctaagat gcaaaagggt gacattctgg ttgttaagac gactgacaaa    1560

gattatttgc cagcaatcga aaaagcagct gccttggttg ttgaaaccgg tggcttgacc    1620

agtcacgcag ctgttgttgg tattgctatg ggtatcccag ttgttgttgg tgctgaaaat    1680

gctaccagcg tcatctccga tggccagatc attactgttg actcccgtcg tgggatcatc    1740

tacaaaggtg ctaccaacgc cctttaa                                        1767

<210>3

<211>1767

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atgaaaaaaa ccaaaattgt gagcaccctg ggcccggcga gcaacaccac cgatattatt      60

gtgaaactga ttgaagcggg cgcgaacgtg tttcgtttta actttagcca tggcgatcat     120

gaagaacatc tggcgcgtat gaacatggtg catgaagcgg aaaaaattac cggcaaaacc     180

gtgggcatta tgctggatac caaaggcgcg gaaattcgta ccaccctgga agataccccg     240

aacggcaaaa ttgattttca taccggcgat aaagtgcgta ttagcatgga tgcgagcctg     300

aaaggcacca aagaaaaagt ggcggtgacc tatccgggcc tgtatgatga tacccatgtg     360

ggcggccatg tgctgtttga tgatggcctg attgatatga aaattaccga aaaagatgaa     420

aaaaaccgtg aactggtgac cgtggtgcag aacgatggcg tgctgggcgg caaaaaaggc     480

gtgaacgcgc cgggcgtggc gattaacctg ccgggcatta ccgaaaaaga tagcgatgat     540

attcgttttg gcctggataa cggcattaac tttattgcgg cgagctttgt gcgtaaaccg     600

caggatgtgc tggatattcg tgaactgctg gaagaaaaaa acgcgctgaa cgtgcagatt     660

tttccgaaaa ttgaaagcca ggaaggcatt gataacattg atgatattct gaaagtgagc     720

gatggcctga tggtggcgcg tggcgatatg ggcgtggaaa ttccgtttga acatgtgccg     780

attgtgcaga aacgtctgat taaaaaatgc aacagcctgg gcaaaccggt gattaccgcg     840

acccagatgc tggatagcat gcaggaaaac ccgcgtccga cccgtgcgga agtgaacgat     900

gtggcgaacg cggtgtttga tggcaccgat gcgaccatgc tgagcggcga aagcgcgaac     960

ggcgattatc cggtggaaag cgtggcggcg atggcgcgta ttgatgaata taccgaagcg    1020

gcgatgatgg atcaggatgc gtttgcgctg aaagaaagca gcaacaaaaa cgtgaccgaa    1080

gcggtgggcc agagcgtggc gcataccgcg cgtaacctgg gcgtgaaaac cattgtggcg    1140

gcgaccgaaa gcggctatac cgcgcgtatg attagcaaat atcgtccgaa agcggatatt    1200

ctggcgatta cctttagcga aaaaacccag cgtggcctga tggtgaactg gggcgtgtat    1260

ccgattattg cggaaaaacc ggcgaacacc gatgcgatgt ttgatctggc gaccaaaaaa    1320

gcgcaggatc tgggctttgc gaaagaaggc gatctgattc tgattaccgc gggcgtgccg    1380

gtgggcgaaa gcggcaccac caacgtgatg aaagtgcagc tgattggcag caaactggtg    1440

cagggcagcg gcgtgggcga tgaaagcacc attggcaaag cggtgattgc gagcaacgcg    1500

caggaagcgg cggcgaaaat gcagaaaggc gatattctgg tggtgaaaac caccgataaa    1560

gattatctgc cggcgattga aaaagcggcg gcgctggtgg tggaaaccgg cggcctgacc    1620

agccatgcgg cggtggtggg cattgcgatg ggcattccgg tggtggtggg cgcggaaaac    1680

gcgaccagcg tgattagcga tggccagatt attaccgtgg atagccgtcg tggcattatt    1740

tataaaggcg cgaccaacgc gctgtaa                                        1767

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>4

atcgcatatg aaaaaaacca agatcgtc                            28

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向序列

<400>5

atcggaattc ttaaagggcg ttggtagc                            28

Claims (7)

1.一种丙酮酸激酶，其特征在于，所述丙酮酸激酶的氨基酸序列为第327位丝氨酸被丙氨酸取代的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.一种编码丙酮酸激酶的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为编码权利要求1所述的丙酮酸激酶的核苷酸序列。

3.一种编码丙酮酸激酶的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为第979位“T”突变为“G”的SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因为权利要求2或3所述的编码丙酮酸激酶的核苷酸序列。

5.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞含有权利要求4所述的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

7.一种检测钾离子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的丙酮酸激酶。

Images