CN101659943B - 丙酮酸氧化酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丙酮酸氧化酶，其氨基酸序列为(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者(2)对(1)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其丙酮酸氧化酶的功能不变的氨基酸序列。本发明还公开了编码所述丙酮酸氧化酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，以及包括上述丙酮酸氧化酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。本发明的丙酮酸氧化酶耐热性好、反复冻融后残留酶活性高，并且在宽的pH值范围内稳定性很高。

Description

丙酮酸氧化酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种氧化酶，编码该酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，以及包括上述氧化酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。更具体地，本发明涉及一种丙酮酸氧化酶，编码该丙酮酸氧化酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，以及包括上述丙酮酸氧化酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。 

背景技术

丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase，EC1.2.3.3)是一种用途广泛的临床诊断用酶制剂。它主要应用于血液丙氨酸氨基转移酶(ALT)和/或天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活力测定，还可以用于丙酮酸激酶活性测定等。因而可以制备成包括丙酮酸氧化酶的相应试剂盒。例如，具体反应原理可以如以下的式一和式二所示： 

(式一) 

(式二) 

由以上反应式可知，可以通过在550nm波长处监测醌亚胺染料的浓度变化来测定丙酮酸氧化酶的酶活。 

但是目前的试剂盒所用的丙酮酸氧化酶存在着耐热性差的缺点，使试剂盒的运输、保存和使用过程对环境温度要求较高，容易由于丙酮酸氧化酶的变性而影响到试剂盒测定的有效性和准确性。例如，EP0257986A2公开了一种丙酮酸氧化酶，其在最高达45℃的温度下在pH为7.0时能保持10分钟的稳定 性(参见该专利的图2)。此外，目前的试剂盒所用的丙酮酸氧化酶只能在窄的pH值范围内保持较高的稳定性和活性(参见专利EP0257986A2的图1)，大大局限了试剂盒能够测定的被测标本的范围，对测定的pH条件要求较高，从而对使用试剂盒的人员的操作技术水平要求也很高。 

发明内容

本发明的一个目的是克服现有的丙酮酸氧化酶耐热性差、仅能在窄的pH值范围内保持较高的稳定性和活性的缺点，提供一种耐热性好、能在宽的pH值范围内保持较高的稳定性和活性，并且具有反复冻融后残留酶活性高的丙酮酸氧化酶。 

本发明的第二个目的是提供编码所述丙酮酸氧化酶的核苷酸序列。 

本发明的第三个目的是提供包括所述核苷酸序列的重组载体。 

本发明的第四个目的是提供包括所述重组载体的重组宿主细胞。 

本发明的第五个目的是提供包括上述丙酮酸氧化酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。 

本发明的发明人付出了大量地创造性劳动，利用随机突变的方法，从文献[“编码植物乳杆菌中丙酮酸氧化酶的poxB基因的特征和功能分析(Characterization and Functional Analysis of the poxB Gene，Which EncodesPyruvate Oxidase in Lactobacillus plantarum)”，Frédérique Lorquet等人，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)，第186卷，第12期，第3749-3759页，2004年6月]报道的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)丙酮酸氧化酶序列得到本发明具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的丙酮酸氧化酶。并且本发明的发明人意外地发现，所得丙酮酸氧化酶、能在宽的pH值范围内保持较高的稳定性，并且具有反复冻融后残留酶活性高的丙酮酸氧化酶。 

本发明提供了一种丙酮酸氧化酶，其中，所述丙酮酸氧化酶的氨基酸序列为 

(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者 

(2)对(1)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其丙酮酸氧化酶的功能不变的氨基酸序列。 

本发明还提供了编码本发明所述丙酮酸氧化酶的核苷酸序列。 

本发明还提供了包括本发明所述核苷酸序列的重组载体。 

本发明还提供了包括本发明所述重组载体的重组宿主细胞。 

本发明还提供了包括本发明所述的丙酮酸氧化酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。 

本发明提供的丙酮酸氧化酶具有如下优点： 

第一，耐热性好。参见图3可知，本发明的丙酮酸氧化酶在55℃下于pH6.0的缓冲液中静置15分钟后仍具有50％的相对活性，明显高于在相同条件下的对比例1的丙酮酸氧化酶的相对活性(不到30％)。 

第二，在宽的pH值范围内稳定性很高。参见图4可知，本发明的丙酮酸氧化酶在pH5.0-pH9.0的缓冲液中于25℃放置20小时后仍具有60％以上的相对活性，明显高于在相同条件下的对比例1的丙酮酸氧化酶的相对活性(不到20％)。 

第三，反复冻融后残留酶活性高。参见图5可知，本发明的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在-20℃和室温之间反复冻融5次的条件下反复冻融后残留酶活性仍达90％，而在相同条件下对比例1的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反复冻融后残留酶活性仅为75％。 

附图说明

图1实施例1的pox B基因纯化的琼脂糖凝胶鉴定照片； 

图2实施例1的pox B诱导表达与纯化的SDS-PAGE鉴定照片； 

图3实施例1和对比例1的丙酮酸氧化酶热稳定性对比图； 

图4实施例1和对比例1的丙酮酸氧化酶pH稳定性对比图； 

图5实施例1和对比例1的丙酮酸氧化酶反复冻融后残留酶活性对比图。 

具体实施方式

本发明提供了一种丙酮酸氧化酶，其中，所述丙酮酸氧化酶的氨基酸序列为 

(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者 

(2)对(1)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其丙酮酸氧化酶的功能不变的氨基酸序列。 

本领域人员公知，组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分 成四类： 

1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)； 

2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)； 

3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)； 

4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。例如，本领域技术人员公知，Ala和Ser、Val和Ile、Asp和Glu、Ser和Thr、Ala和Gly、Ala和Thr、Ser和Asn、Ala和Val、Ser和Gly、Tyr和Phe、Ala和Pro、Lys和Arg、Asp和Asn、Leu和Ile、Leu和Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，两两之间相互取代，不会影响蛋白的立体结构和功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在丙酮酸氧化酶上的任意一个氨基酸残基位置上。相反，不同类别的氨基酸残基发生取代，或者氨基酸的取代不符合上述列举的取代规律，很可能会使蛋白的结构发生变化，功能出现差异。 

本发明提供的丙酮酸氧化酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的丙酮酸氧化酶存在氨基酸序列上的差异，或者有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术获得。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。 

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或 进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。 

优选情况下，所述丙酮酸氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。 

本发明还提供了编码本发明所述丙酮酸氧化酶的核苷酸序列。 

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的丙酮酸氧化酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述丙酮酸酶活性一致的氨基酸序列。 

优选情况下，本发明所述核苷酸序列为 

(1)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者 

(2)SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；或者 

(3)对SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或增加而得到的核苷酸序列，该核苷酸序列编码的丙酮酸氧化酶功能不变。所述核苷酸序列更优选为SEQ ID NO：2或者SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列。所述核苷酸序列最优选为SEQ ID NO：3所示的核 苷酸序列。本发明的发明人通过大量的实验最终确定的SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，由于可能更符合例如大肠杆菌的基因工程菌的密码子偏好性，因而更有利于基因工程菌表达蛋白产物。 

本发明提供的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列和重组工程菌，可以很容易获得模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增，然后将所得片段按正确次序拼接。一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。 

本发明还提供了包括本发明所述核苷酸序列的重组载体。本领域公知，所述重组载体一般包括空载体和插入该空载体的目的基因，所述目的基因为本发明所述的丙酮酸氧化酶的核苷酸序列。 

在本发明中，所述“空载体”(或称“载体”)可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选pET28a(+)质粒、pET30a(+)或pET32a(+)。所述空载体可以包括多种常用的检测标记(例如荧光标记、抗生素标记等报告基因)和酶切位点。重组载体构建可采用空载体本身多克隆位点的各种核酸内切酶(如对于pUC18，可用Sal I、BamHI、EcoR I等，对于pET28a，可用Ndel、XhoI、Nhel、EcoR I、BamH、HindIII等，对于pET28b可用EcoR I、Nde I、BamH、HindIII等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。优选所述重组载体为pET28a-poxB、pET30a-poxB或pET32a-poxB。本发明优选采用NdeI和XhoI双酶切pET28a及与其连接的PCR产物片段，经连接酶连接，构建本发明的重组载体pET28a-poxB。 

本发明还提供了包括本发明所述重组载体的重组宿主细胞。 

可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化；所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母(如毕赤酵母) 或各种动植物细胞，更优选所述宿主细胞为本领域常用的基因工程菌，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母。最优选所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。 

可以使用本领域常用的方法从重组宿主细胞中分离和纯化丙酮酸氧化酶。例如，离心分离培养基和重组宿主细胞，高压匀浆破碎细胞、离心过滤去除细胞碎片，亲和层析纯化丙酮酸氧化酶。对于分离纯化所得的丙酮酸氧化酶的产物，可以使用本领域常用的方法进行纯度鉴定。例如，考马斯亮蓝法、凯氏定氮法、双缩脲法、lowry法、紫外吸收法、亲和层析、酶活性、抗原抗体法、电泳分析(例如十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)、沉降分析、扩散分析、恒溶度法、蛋白质谱等。 

本发明还提供了包括本发明所述的丙酮酸氧化酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。优选情况下，本发明的试剂盒包括丙酮酸氧化酶，而不包括核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞。更优选本发明的试剂盒包括丙酮酸氧化酶的干粉，而不包括核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞。可以用本领域常用的方法制备丙酮酸氧化酶的干粉，只要该方法能够得到丙酮酸氧化酶的干粉，并且不破坏丙酮酸氧化酶的干粉的活性即可。例如使用真空减压浓缩器得到浓缩的酶液，然后使用冷冻干燥机干燥浓缩的酶液；或者使用真空减压干燥器等设备。由于本发明的丙酮酸氧化酶耐热性好，还可以使用喷雾干燥的技术得到该酶的干粉。丙酮酸脱氢酶的干粉在使用时可以通过溶解于pH5.0-8.0的缓冲液体系(例如醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液，优选pH为5.5-7.0)中而转化为液体形式。 

本发明的试剂盒还可以包括本领域常用于测定丙氨酸氨基转移酶的试剂盒的成分。对应于本发明的试剂盒中的丙酮酸氧化酶可以是液体形式或固体干粉形式，本发明的试剂盒中的其他成分也可以是液体形式和/或固体干粉形式。例如，当本发明的试剂盒为液体形式时，一般可以含有0.01-0.5mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液、1000-10000U/L的丙酮酸氧化酶、1000-10000U/L的过氧化物酶、500-5000U/L的抗坏血酸氧化酶、100-1000mmol/L的L-丙氨酸、5-50mmol/L的a-酮戊二酸、5-50μmol/L的亚铁氰化钾、5-50μmol/L的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、5-50μmol/L的焦磷酸硫胺素(TPP)和5-50μmol/L的N-乙醛 -N-3-甲基苯胺(EHSPT)。本发明的试剂盒优选含有0.05-0.2mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液、3000-5000U/L的丙酮酸氧化酶、3000-5000U/L的过氧化物酶、1000-3000U/L的抗坏血酸氧化酶、300-500mmol/L的L-丙氨酸、10-30mmol/L的a-酮戊二酸、15-30μmol/L的亚铁氰化钾、10-30μmol/L的FAD、15-45μmol/L的TPP和10-45μmol/L的EHSPT。 

本发明液体形式的试剂盒组分可以通过冷冻干燥技术，结合减压蒸馏技术、反渗透技术及超滤技术等，制备成试剂干粉。所述干粉可以在检测待测标本前用选自去离子水、蒸馏水和双蒸水的溶剂复溶至所述试剂的原有体积。本发明的试剂盒可以包括记载有上述各种组分使用方法和用量的说明书。因此，所述溶液也可以由使用者在使用前按照试剂盒说明书的记载根据现有技术配制即可。 

适于使用本发明所述试剂盒的待测标本可以是动物体(包括人体)健康状态下以及病理状态下的血液自然凝固后析出的血清。 

下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。 

制备实施例1 

(1)现有丙酮酸氧化酶poxB基因的合成 

按照文献[“编码植物乳杆菌中丙酮酸氧化酶的poxB基因的特征和功能分析(Characterization and Functional Analysis of the poxB Gene，Which EncodesPyruvate Oxidase in Lactobacillus plantarum)”，Frédérique Lorquet等人，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)，第186卷，第12期，第3749-3759页，2004年6月]报道的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)丙酮酸氧化酶序列，委托捷瑞生物工程(上海)有限公司利用DNA合成仪合成DNA片段，然后用DNA连接技术连接所得的DNA片段，最后将所得DNA片段用美国应用生物系统公司的310型全自动DNA测序仪测序，测序结果显示：所得DNA片段中含有长度为1812bp(起始于起始密码子atg并终止于终止密码子taa)的蛋白编码基因与上述文献报道一致的，为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。 

(2)目的基因的获得 

本发明的发明人设计了正向引物：CGTCATATGGTTATGAAACAAACAA AAC，其上附加有NdeI酶切位点；反向引物：ATTCTCGAGTTAAAACCCACCCTGTCC，其上附加有XhoI酶切位点。以上述步骤(1)得到的现有丙酮酸氧化酶poxB基因DNA为模板，按照如下条件扩增丙酮酸氧化酶基因： 

易错聚合酶链式反应的混合物包括正向引物(10μM)：2μl；反向引物(10μM)：2μl；dNTPs(2.5mM，宝生物(Takara)公司产品)：4μl；10X PCR缓冲液(不含Mg²⁺，Takara公司产品)：10μl；Taq DNA聚合酶(5U/μl，Takara公司产品)：5μl；模板DNA：0.5μl；10X MgCl₂(30mM)：5μl；10X MnCl₂(3mM)：5μl；加灭菌去离子水至50μl。在94℃保持2.5分钟，然后进行30个循环(94℃，0.5min；50℃，0.5min；72℃，2min)；退火温度为72℃，延伸时间7min，得到基因扩增产物。将得到的扩增基因片段用琼脂糖凝胶电泳回收纯化出1.8-1.9kb单一条带的DNA片段(如图1所示)。 

将所得DNA片段用美国应用生物系统公司的310型全自动DNA测序仪测序，测序结果显示：所得DNA片段中含有长度为1812bp(起始于起始密码子atg并终止于终止密码子taa)的蛋白编码基因，详细序列如SEQ ID NO：2所示。 

(3)构建重组载体 

用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切(2)得到的蛋白编码基因，酶切所得大片段通过使用T4DNA连接酶，连接至同样已经用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切过的空载体pET28a(+)上。将包括重组载体的连接反应产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，然后所得转化产物涂布在含有50μg/mL的卡那霉素LB琼脂平板上，在37℃培养过夜，随机挑选10个克隆接种到含有50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养后，提取质粒，用限制性内切酶NdeI和XhoI进行酶切，琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。结果测到大小约为1.8Kb片段的酶切片段的相应重组质粒为阳性克隆，即证明获得了重组表达载体pET28a-poxB。培养所述阳性克隆，提取重组表达载体pET28a-poxB。所述重组表达载体pET28a-poxB在pH为7.0的50mmol/L的磷酸钾缓冲液中保存。 

(4)重组载体对宿主细胞的转化以及所得重组宿主细胞的培养 

挑取在LB固体培养基上37℃培养16小时的大肠杆菌BL21(DE3)的单菌落，于液体LB培养基中在37℃、150rpm的摇床再培养16小时。取1ml 所得液体培养物转接于100ml新鲜液体LB培养基中，在37℃摇床上以250-300rpm的转速剧烈振荡培养2.5小时。吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟后，在4℃、3000g下离心5分钟。弃去上清，加入100μl在冰上预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，重悬细胞，在冰放置20分钟。然后在4℃、3000g下离心5分钟，弃去上清，加入100μl在冰上预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，重悬细胞，得到感受态的宿主细胞。 

取200μl上述感受态的大肠杆菌BL21(DE3)置于1.5ml离心管中，加入体积为10μl的pET28a-poxB溶液(其中pET28a-poxB含量为40ng)轻轻摇匀，冰上放置30分钟。然后在42℃水浴中热击90秒，接着迅速置于冰上冷却5分钟。向离心管中加入1ml LB液体培养基(不含卡那霉素)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的卡那霉素抗生素抗性基因(Kan^r)。将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Kan的LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养20小时。在筛选平板上出现了大肠杆菌的菌落，即pET28a-poxB已经转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到了本实施例的重组宿主细胞——大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-poxB。 

配制3L LB培养基加入到5L发酵罐中，在121℃灭菌15分钟，完全冷却至室温后加入卡那霉素，使其终浓度为50ug/mL。在所得培养基中加入60mL生长至对数生长期的上述大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-poxB(10⁶细胞/毫升)。在37℃下培养至发酵液取样中的细胞密度达到10⁷细胞/毫升。然后加入1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，诱导8小时后发酵完毕。 

(5)蛋白产物的分离提纯 

将(4)得到的发酵液在7000rpm下离心20min，收集重组宿主细胞沉淀。弃去上清，将所得重组宿主细胞重悬于等体积的pH为7.5的50mmol/L的Tris-HCl溶液中。用高压匀浆机破碎重悬的细胞，在12000rpm下离心20min，收集上清粗酶液，弃取细胞碎片沉淀。 

将上述所得粗酶液用孔径为0.22μm滤膜过滤后，所得滤液在美国通用电 子公司(GE公司)的安克塔纯化者(AKTA Purifier)镍亲和层析柱上进行亲和层析。其中，上样缓冲液为50mmol/L的pH为7.0的磷酸钾缓冲液。在流过两个柱体积的上样缓冲液后，使用洗脱缓冲液，其为含有0.5mol/L咪唑的50mmol/L的pH为7.0的磷酸钾缓冲液。当咪唑浓度达0.3mol/L时开始收集蛋白，收集实时监测到的蛋白单峰结束。 

向收集到的蛋白溶液中加入40％(W/V)硫酸铵沉淀，然后在10000rpm的转速下离心10分钟。收集蛋白沉淀，并用0.1mol/L的pH为7.0的磷酸钾缓冲液复溶。所得溶液用孔径为0.22μm的滤膜过滤后，所得滤液再用葡聚糖凝胶G-25层析柱(Sephadex G-25)脱盐。所述脱盐缓冲液是0.1mol/L的pH为7.0的磷酸钾缓冲液。在用脱盐缓冲液平衡好的层析柱上上样，其中样品溶液(即上述用0.1mol/L的pH为7.0的磷酸钾缓冲液复溶的蛋白溶液)的流速为5ml/min，然后用脱盐缓冲液以5ml/min的流速洗脱1.5个柱体积。收集洗脱下的液体共300毫升。 

所收集的液体在普通冰箱中-10℃下冷冻2小时，然后再-40℃深冷冰箱预冻8小时，在德国科瑞斯特(CHRIST)的ALpHA 1-4LSC型冷冻干燥机中，以真空度0.04mbar、安全压力0.100mbar且冷阱温度-60℃的条件冻干10小时。然后等物料温度与冻干机隔板温度差为零，并且观察在15秒内压力指示不变时，结束冻干。冻干所得蛋白质的量为10.5克。冻干蛋白在常温干燥器中密封保存。 

采用《分子克隆实验指南》(Sambrook等，科学出版社(第三版)，2002，见1039-1044页)记载的SDS-PAGE电泳的方法测定出本实施例的蛋白质的分子量约为66.2KD，测试结果如图2所示。并且根据“通过蛋白质胶内消化作用后的快速技术完全测序GABAA受体β3亚基(Complete sequencing ofGABAA receptor subunit beta 3 by a rapid technique following in-gel digestion ofthe protein).Kang SU，Lubec G.电泳(Electrophoresis).2009Jun；30(12)：2159-67”记载的纳米-电喷雾离子化源液相色谱-质谱联用(nano-ESI-LC-MS/MS)方法，测得本实施例的蛋白质有603个氨基酸残基(参见SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列)，与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码结果一致。其中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所 示的氨基酸序列区别在于：SEQ ID NO：4第247位上的Val被Ala取代，第301位上的Tyr被Ile取代，第561位上的Met被Thr取代。 

(6)酶活的测定 

按照如下方法测定酶活： 

A)测定试剂： 

a.丙酮酸盐溶液：0.3M[378mg的丙酮酸钾盐(MW＝126.15)/10ml的水] 

b.磷酸钾缓冲液，pH 5.9：0.15M。 

c.4-氨基安替比林溶液：0.15％(150mg的4-氨基安替比林/100ml的水) 

d.EHSPT(TOOS)溶液：0.3％[300mg的EHSPT(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-m-甲苯胺)/100ml的水] 

e.TPP溶液：3mM[13.8mg的TPP(硫胺素焦磷酸酯)(MW＝460.77)/10ml的水] 

f.FAD溶液：0.15mM[1.3mg的FAD二钠盐(MW＝865.55)/10ml的水] 

g.EDTA溶液：15mM[590mg的EDTA二钠盐(MW＝394.22)/100ml的水] 

h.MgSO4溶液：0.15M[3.4g的MgSO₄·7H₂O(246.48)/100ml的水] 

i.过氧化物酶溶液：50U/ml[45mg的过氧化物酶(110红棓酚单位)/100ml的水] 

j.酶稀释剂：50mM磷酸钾缓冲液，pH 5.7 

B)操作过程： 

i)在棕色瓶中于冰上制备下列工作液： 

10ml K磷酸盐缓冲液，pH 5.9    (b) 

2ml 4-氨基安替比林溶液        (c) 

2ml EHSPT溶液                 (d) 

2ml TPP溶液                   (e) 

2ml FAD溶液                   (f) 

2ml EDTA溶液                  (g) 

2ml MgSO₄溶液                 (h) 

3ml 过氧化物酶                (i) 

ii)将酶制品溶解在冰冷的酶稀释剂(j)中，稀释至0.5U/ml并贮存在冰上。 

iii)吸量管吸取2.5ml的上述i)的工作液至比色皿(d＝1.0cm)中，加入0.5ml的丙酮酸溶液(a)，并在37℃下平衡5分钟。 

iv)加入0.1ml的上述酶溶液，并温和倒转混合。 

v)在37℃恒温的分光光度计(岛津UV-2450分光光度计)中，记录在550nm下，相对于水的光密度(OD)4分钟的增长，并由曲线的起始线性部分计算每分钟ΔOD(ΔOD试样)。 

同时通过与测试试样同样的方法测量空白速度(ΔOD空白)，除了仅加入酶稀释剂而不是加入酶溶液。 

C)酶活计算公式 

重量酶活(U/mg)＝(U/mL)×1/C 

其中，Vt：总体积(3.10mL) 

Vs：酶液样品体积(0.10mL) 

36.88：在测定条件下醌亚胺染料的摩尔吸光系数(cm²/mmoL) 

1/2：系数基于一摩尔H₂O₂产生半摩尔的醌亚胺染料 

1.0：光径长度(cm) 

df：稀释倍数 

C：溶液中酶浓度(c mg/ml) 

D)测试结果见下表1。 

综上，本发明的发明人得到了一种新的丙酮酸氧化酶，其分子量约为66.2KD，具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列以及SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。其中，本领域技术人员通过阅读本实施例，可以知晓本发明的核苷酸序列例如SEQ ID NO：2，并可以通过化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此可以在得到具有该核苷酸序列的核酸后，无需实施本实施例第(1)-(2)步，而是直接从本实施例第(3)步开始重复本实施例。 

制备实施例2 

按照SEQ ID NO：3所示序列进行全基因合成，得到SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的同义突变核苷酸序列。然后将得到的核苷酸序列按照制备实施例1的方法连接到pET28a(+)空载体上，也转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。在相同条件下培养所得重组宿主细胞，结果本实施例的丙酮酸氧化酶产量比实施例1的提高了149.7％。 

制备实施例3 

将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列按照制备实施例1的方法连接到pET32a(+)空载体上，也转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。在相同条件下培养所得重组宿主细胞，结果得到的丙酮酸氧化酶，其Km值为5.4×10^-4mol/L，其丙酮酸氧化酶的产量与制备实施例1基本持平。 

制备实施例4 

将SEQ ID NO：3按照制备实施例1的方法连接到pET28a(+)空载体上，转化入宿主菌大肠杆菌Rosetta^TM中。在相同条件下培养所得重组宿主细胞，结果得到的丙酮酸氧化酶，其Km值为5.2×10^-4mol/L，其丙酮酸氧化酶的产量比制备实施例1提高了101.7％。 

对比例1 

本对比例为东洋纺公司(TOYOBO)生产的兔肌来源的丙酮酸氧化酶，其分子量为237KD，对丙酮酸的Km为7.0×10^-2mol/L，最适pH值7.0，最适温度40℃。 

测试实施例1 

按照制备实施例1记载的方法测试制备实施例2-4和对比例1的丙酮酸氧化酶活性： 

表1 

丙酮酸氧化酶	制备实施例1	制备实施例2	制备实施例3	制备实施例4	对比例1
						酶活(U/mg)	5.2	5.1	4.8	5.4	1.5

由以上结果可知，制备实施例1-4所制备的丙酮酸氧化酶其酶活力与对比例1相比在同一数量级上，完全能够满足临床上测定待测标本中钾离子浓度的试剂盒的对丙酮酸氧化酶的要求。 

测试实施例2 

按照如下方法测试制备实施例1-4和对比例1的丙酮酸氧化酶的热稳定性： 

将5U的丙酮酸氧化酶干粉溶于pH值为6.0的50mmol/L磷酸钾缓冲液1ml中，分别在20.0℃、23.8℃、28.1℃、32.9℃、37.6℃、42.4℃、47.1℃、51.9℃、56.2℃和60℃下，静置15分钟后，按照测试实施例1的方法测定酶活。制备实施例1(制备实施例2-4编码的得到的氨基酸序列与制备实施例1相同)的热稳定性测试结果和对比例1的热稳定性测试结果如图3所示。通过比较，制备实施例2-4的热稳定性(图中未示出)测试结果与制备实施例1的基本相同。 

从图中可以看出，制备实施例1-4的热稳定性明显大于对比例1。 

测试实施例3 

按照如下方法测试实施例1-4和对比例1的丙酮酸氧化酶的pH稳定性： 

将0.5U的丙酮酸氧化酶在25℃下，分别溶于pH值为4.0、5.0、5.7、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的50mmol/L缓冲液1ml中(pH稳定性测定缓冲液的梯度设定为：HAc缓冲液：pH4.0、pH5.0、pH6.0；磷酸钾缓冲液：pH5.7、pH6.0、pH7.0、pH8.0；Tris缓冲液：pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0)，静置20小时。所述静置在PCR仪中进行，用奥林帕斯全自动生化分析仪测定酶活，按残存酶活与最大残存酶活的比值百分数为纵坐标，pH值为横坐标绘制曲线。制备实施例1(制备实施例2-4编码的得到的氨基酸序列与制备实施例1相同)的pH稳定性测试结果如图4所示，对比例1的pH稳定性测试结果如图4所示。通过比较，制备实施例2-4的pH稳定性(图中未示出)测试结果与制备实施例1的基本相同。 

从图中可以看出，制备实施例1-4的pH稳定性显著好于对比例1，这样一来包括本发明的丙酮酸氧化酶的试剂盒能够测定的待测样本的种类比现有技术更多，对试剂盒的运输、保存的条件降低，对使用试剂盒的人员的操作精密精细要求降低，有利于带有丙酮酸氧化酶的试剂盒的普及。 

测试实施例4 

将制备实施例1-4和对比例1的酶分别用pH6.0磷酸钾缓冲液(含10mMMgSO4、10μm FAD、0.2mM TPP)稀释成1mg/ml，于-20℃冷冻，再在室温融化，反复5次，分别测定酶活。以第一次冷冻前的酶活为100％，冻融后的残余酶活与冷冻前酶活的百分数为纵坐标，冻融次数为横坐标作图。制备实施例1(制备实施例2-4编码的得到的氨基酸序列与制备实施例1相同)的反复冻融测试结果如图5所示，对比例1的反复冻融测试结果如图5所示。通过比较，制备实施例2-4的反复冻融(图中未示出)测试结果与制备实施例1的基本相同。 

从图5中可以看出，制备实施例1-4所指丙酮酸氧化酶的反复冻融稳定性显著大于对比例1，反复冻融5次的条件下制备实施例1残留酶活性仍达90％，而在相同条件下对比例1残留酶活性仅为75％。制备实施例5-8 

按照表2的配方配制试剂： 

表2 

实施例	制备实施例5	制备实施例6	制备实施例7	制备实施例8
					磷酸盐缓冲液(mmol/L  pH＝7.4)	50	100	150	200
丙酮酸氧化酶(U/L)	3000	3500	4000	5000
					过氧化物酶(U/L)	3000	3500	4000	5000
抗坏血酸氧化酶(U/L)	1000	1500	2000	3000
					L-丙氨酸(mmol/L)	300	350	400	500
a-酮戊二酸(mmol/L)	10	15	20	30
					亚铁氰化钾(μmol/L)	15	20	25	30
FAD(μmol/L)	10	15	20	30
					TPP(μmol/L)	15	20	30	45
EHSPT(μmol/L)	10	20	30	45

[0146] 制备实施例5和6的试剂配制成液体形式即可使用。制备实施例7和8的试剂分别在如下条件下冷冻干燥：在普通冰箱中-10℃下冷冻2小时，然后再-40℃深冷冰箱预冻8小时，在德国科瑞斯特(CHRIST)的ALpHA 1-4 LSC型冷冻干燥机中，以真空度0.04mbar、安全压力0.100mbar且冷阱温度-60℃的条件冻干10小时。然后等物料温度与冻干机隔板温度差为零，并且观察在15秒内压力指示不变时，结束冻干。冻干得到的试剂干粉可以在使用前用蒸馏水复溶成原液体形式的体积。冻干得到的试剂干粉，比液体形式的试剂保存的时间更长，包装要求较低，并且体积更小，运输更容易。制备实施例5-8中所用的丙酮酸氧化酶分别为制备实施例1-4中获得的丙酮酸氧化酶。 

对比例2 

按照与制备实施例5相同的配方配制成液体形式的试剂盒。 

测试实施例5 

本测试实施例测量了两个待测标本：第一个为丙氨酸氨基转移酶质控品(罗氏公司产品，批号17006501，靶值为46.6U/L)；另一个为健康状况良好的30岁男性的血清待测标本(乙肝表面抗体阳性，乙肝五项其他4项均为阴性)。抽取其10ml血液，静置至血细胞沉淀分层，取上层血清5ml用于对制备实施例5-8和对比例2的试剂盒进行检验。 

在96孔酶标板上，A1孔为标准液，A2-H12孔为样品孔。在A1孔内加校准血清(罗氏公司产品，批号17006501)20μl；A2-H12孔内分别加受检血清20μl，然后各孔加入制备实施例5-9中任一一种酶反应试剂200μl；混匀，置37℃放置10分钟，用酶标仪测定1次550nm处的吸光度，计为A1，3分钟后再测一次吸光值，计为A2。用以下公式计算血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性： 

测试结果见表3。 

表3 

由表3可以看出，制备实施例5-8的试剂盒测试结果比对比例2更接近真实值；并且制备实施例5-8的试剂盒测试结果标准偏差明显小于对比例2，说明本发明的试剂盒性能更稳定，测量更准确。 

测试实施例6 

本测试实施例将实施例5-8的试剂盒和对比例2试剂盒置于42℃下进行3天的加速的实验，在第0天、1天、2天和3天，按测试实施例5所述方法测 量了丙氨酸氨基转移酶质控品(罗氏公司产品，批号17006501，靶值为46.6U/L)。测试结果见表4。 

表4 

由表4可以看出，制备实施例5-8的试剂盒测试结果比对比例2的试剂盒更能耐受42℃恶劣环境：实施例5-8的试剂盒能够耐受42℃加速两天，而对比例2仅能耐受1天。 

序列表 

<110>北京利德曼生化股份有限公司 

<120>丙酮酸氧化酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞和试剂盒 

<130>OICN093784 

<160>5 

<170>PatentIn version 3.4 

<210>1 

<211>603 

<212>PRT 

<213>Lactobacillus plantarum 

<400>1 

Met Val Met Lys Gln Thr Lys Gln Thr Asn Ile Leu Ala Gly Ala Ala 

1               5                   10                  15 

Val Ile Lys Val Leu Glu Ala Trp Gly Val Asp His Leu Tyr Gly Ile 

            20                  25                  30 

Pro Gly Gly Ser Ile Asn Ser Ile Met Asp Ala Leu Ser Ala Glu Arg 

        35                  40                  45 

Asp Arg Ile His Tyr Ile Gln Val Arg His Glu Glu Val Gly Ala Met 

    50                  55                  60 

Ala Ala Ala Ala Asp Ala Lys Leu Thr Gly Lys Ile Gly Val Cys Phe 

65                  70                  75                  80 

Gly Ser Ala Gly Pro Gly Gly Thr His Leu Met Asn Gly Leu Tyr Asp 

                85                  90                  95 

Ala Arg Glu Asp His Val Pro Val Leu Ala Leu Ile Gly Gln Phe Gly 

            100                 105                 110 

Thr Thr Gly Met Asn Met Asp Thr Phe Gln Glu Met Asn Glu Asn Pro 

        115                 120                 125 

Ile Tyr Ala Asp Val Ala Asp Tyr Asn Val Thr Ala Val Asn Ala Ala 

    130                 135                 140 

Thr Leu Pro His Val Ile Asp Glu Ala Ile Arg Arg Ala Tyr Ala His 

145                 150                 155                 160 

Gln Gly Val Ala Val Val Gln Ile Pro Val Asp Leu Pro Trp Gln Gln 

                165                 170                 175 

Ile Pro Ala Glu Asp Trp Tyr Ala Ser Ala Asn Ser Tyr Gln Thr Pro 

            180                 185                 190 

Leu Leu Pro Glu Pro Asp Val Gln Ala Val Thr Arg Leu Thr Gln Thr 

        195                 200                 205 

Leu Leu Ala Ala Glu Arg Pro Leu Ile Tyr Tyr Gly Ile Gly Ala Arg 

    210                 215                 220 

Lys Ala Gly Lys Glu Leu Glu Gln Leu Ser Lys Thr Leu Lys Ile Pro 

225                 230                 235                 240 

Leu Met Ser Thr Tyr Pro Ala Lys Gly Ile Val Ala Asp Arg Tyr Pro 

                245                 250                 255 

Ala Tyr Leu Gly Ser Ala Asn Arg Val Ala Gln Lys Pro Ala Asn Glu 

            260                 265                 270 

Ala Leu Ala Gln Ala Asp Val Val Leu Phe Val Gly Asn Asn Tyr Pro 

        275                 280                 285 

Phe Ala Glu Val Ser Lys Ala Phe Lys Asn Thr Arg Ile Phe Leu Gln 

    290                 295                 300 

Ile Asp Ile Asp Pro Ala Lys Leu Gly Lys Arg His Lys Thr Asp Ile 

305                 310                 315                 320 

Ala Val Leu Ala Asp Ala Gln Lys Thr Leu Ala Ala Ile Leu Ala Gln 

                325                 330                 335 

Val Ser Glu Arg Glu Ser Thr Pro Trp Trp Gln Ala Asn Leu Ala Asn 

            340                 345                 350 

Val Lys Asn Trp Arg Ala Tyr Leu Ala Ser Leu Glu Asp Lys Gln Glu 

        355                 360                 365 

Gly Pro Leu Gln Ala Tyr Gln Val Leu Arg Ala Val Asn Lys Ile Ala 

    370                 375                 380 

Glu Pro Asp Ala Ile Tyr Ser Ile Asp Val Gly Asp Ile Asn Leu Asn 

385                 390                 395                 400 

Ala Asn Arg His Leu Lys Leu Thr Pro Ser Asn Arg His Ile Thr Ser 

                405                 410                 415 

Asn Leu Phe Ala Thr Met Gly Val Gly Ile Pro Gly Ala Ile Ala Ala 

            420                 425                 430 

Lys Leu Asn Tyr Pro Glu Arg Gln Val Phe Asn Leu Ala Gly Asp Gly 

        435                 440                 445 

Gly Ala Ser Met Thr Met Gln Asp Leu Ala Thr Gln Val Gln Tyr His 

    450                 455                 460 

Leu Pro Val Ile Asn Val Val Phe Thr Asn Cys Gln Tyr Gly Phe Ile 

465                 470                 475                 480 

Lys Asp Glu Gln Glu Asp Thr Asn Gln Asn Asp Phe Ile Gly Val Glu 

                485                 490                 495 

Phe Asn Asp Ile Asp Phe Ser Lys Ile Ala Asp Gly Val His Met Gln 

            500                 505                 510 

Ala Phe Arg Val Asn Lys Ile Glu Gln Leu Pro Asp Val Phe Glu Gln 

        515                 520                 525 

Ala Lys Ala Ile Ala Gln His Glu Pro Val Leu Ile Asp Ala Val Ile 

    530                 535                 540 

Thr Gly Asp Arg Pro Leu Pro Ala Glu Lys Leu Arg Leu Asp Ser Ala 

545                 550                 555                 560 

Thr Ser Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Phe Lys Gln Arg Tyr Glu Ala 

                565                 570                 575 

Gln Asp Leu Gln Pro Leu Ser Thr Tyr Leu Lys Gln Phe Gly Leu Asp 

            580                 585                 590 

Asp Leu Gln His Gln Ile Gly Gln Gly Gly Phe 

        595                 600 

<210>2 

<211>1812 

<212>DNA 

<213>Lactobacillus plantarum 

<400>2 

atggttatga aacaaacaaa acaaactaac atactagcag gtgcagcagt tattaaagtt     60 

ttagaagctt ggggagtaga tcatttgtat ggtattcctg gaggttcaat taattcaatt    120 

atggacgcat tatcagcaga aagggatcga atccattata ttcaagtacg gcatgaagaa    180 

gttggtgcaa tggccgccgc tgctgatgct aagctaacgg gtaaaatcgg ggtttgcttc    240 

ggctcagcgg gacctggtgg cactcatctt atgaatgggt tatatgatgc gcgtgaagac    300 

catgtccctg ttctagcact tattggtcaa tttggaacta ctgggatgaa catggatacg    360 

ttccaagaaa tgaatgagaa tccgatttat gcggacgttg cagattataa tgtaacagcc    420 

gtcaatgctg ccacgttgcc acatgttatt gacgaagcaa ttcgacgcgc ctacgctcac     480 

caaggtgttg cggttgtgca aattccagtc gatttaccat ggcaacagat tccagctgaa     540 

gattggtatg cttccgctaa tagttatcaa acgccgttat taccagaacc cgacgttcaa     600 

gcagtgacga gattgacaca gactttactc gcagctgaac ggccacttat ttactatggc     660 

attggagctc gtaaggctgg taaagaactc gaacaattga gtaaaacgtt gaaaattcca     720 

ttaatgagta cgtatccagc taagggtatt gtcgcggatc gttatccagc ctatttgggt     780 

tctgctaatc gggtggcaca aaaaccggcg aatgaggcac ttgcgcaagc cgacgttgtt     840 

ttatttgttg gtaataatta tccgtttgca gaagtttcca aagcgtttaa aaatacgcgt     900 

attttcttac aaattgatat tgatccagct aagttaggta aacgacataa aacagatatt     960 

gcggtacttg ctgatgcaca aaaaacgctg gctgcaattt tagcacaggt atctgaacgg    1020 

gagtcgacac cttggtggca agccaattta gccaatgtta aaaattggcg ggcttatcta    1080 

gcttcattag aagataagca ggaagggcct ttacaagcat atcaagtgct acgtgcggtt    1140 

aataaaattg cggagcctga tgcaatctat tcgattgatg ttggtgatat caatttgaat    1200 

gcgaatcgac atttgaaatt aacgccgtcc aatcggcaca ttacttctaa cttatttgct    1260 

acgatgggag ttggtattcc gggagcaatt gctgccaaac ttaattatcc tgagcggcag    1320 

gtgtttaatc tggccggtga tggtggcgct tcgatgacca tgcaagattt ggcgacgcaa    1380 

gttcaatacc atttaccagt gattaatgtt gttttcacca actgccaata tggatttatc    1440 

aaagatgagc aggaagatac taatcagaat gattttattg gcgttgaatt caatgatatt    1500 

gattttagta agattgccga tggcgtgcac atgcaagctt ttcgagttaa taagattgag    1560 

caattacctg atgtttttga acaagccaaa gcaatcgctc agcatgaacc agttctgatt    1620 

gatgcggtga ttacaggaga tcggccactg cctgctgaaa agcttcgttt agattcggca    1680 

acgagttcgg cagctgatat tgaagcattt aaacaacggt atgaagctca agatttacaa    1740 

ccactttcaa cttatttaaa acaatttggc ttagatgatt tgcaacatca aattggacag    1800 

ggtgggtttt aa                                                        1812 

<210>3 

<211>1812 

<212>DNA 

<213>Lactobacillus plantarum 

<400>3 

atggtgatga aacagaccaa acagaccaac attctggcgg gcgcggcggt gattaaagtg      60 

ctggaagcgt ggggcgtgga tcatctgtat ggcattccgg gcggcagcat taacagcatt     120 

atggatgcgc tgagcgcgga acgtgatcgt attcattata ttcaggtgcg tcatgaagaa     180 

gtgggcgcga tggcggcggc ggcggatgcg aaactgaccg gcaaaattgg cgtgtgcttt     240 

ggcagcgcgg gcccgggcgg cacccatctg atgaacggcc tgtatgatgc gcgtgaagat     300 

catgtgccgg tgctggcgct gattggccag tttggcacca ccggcatgaa catggatacc     360 

tttcaggaaa tgaacgaaaa cccgatttat gcggatgtgg cggattataa cgtgaccgcg     420 

gtgaacgcgg cgaccctgcc gcatgtgatt gatgaagcga ttcgtcgtgc gtatgcgcat     480 

cagggcgtgg cggtggtgca gattccggtg gatctgccgt ggcagcagat tccggcggaa     540 

gattggtatg cgagcgcgaa cagctatcag accccgctgc tgccggaacc ggatgtgcag     600 

gcggtgaccc gtctgaccca gaccctgctg gcggcggaac gtccgctgat ttattatggc     660 

attggcgcgc gtaaagcggg caaagaactg gaacagctga gcaaaaccct gaaaattccg     720 

ctgatgagca cctatccggc gaaaggcatt gtggcggatc gttatccggc gtatctgggc     780 

agcgcgaacc gtgtggcgca gaaaccggcg aacgaagcgc tggcgcaggc ggatgtggtg     840 

ctgtttgtgg gcaacaacta tccgtttgcg gaagtgagca aagcgtttaa aaacacccgt     900 

atttttctgc agattgatat tgatccggcg aaactgggca aacgtcataa aaccgatatt     960 

gcggtgctgg cggatgcgca gaaaaccctg gcggcgattc tggcgcaggt gagcgaacgt    1020 

gaaagcaccc cgtggtggca ggcgaacctg gcgaacgtga aaaactggcg tgcgtatctg    1080 

gcgagcctgg aagataaaca ggaaggcccg ctgcaggcgt atcaggtgct gcgtgcggtg    1140 

aacaaaattg cggaaccgga tgcgatttat agcattgatg tgggcgatat taacctgaac    1200 

gcgaaccgtc atctgaaact gaccccgagc aaccgtcata ttaccagcaa cctgtttgcg    1260 

accatgggcg tgggcattcc gggcgcgatt gcggcgaaac tgaactatcc ggaacgtcag    1320 

gtgtttaacc tggcgggcga tggcggcgcg agcatgacca tgcaggatct ggcgacccag    1380 

gtgcagtatc atctgccggt gattaacgtg gtgtttacca actgccagta tggctttatt    1440 

aaagatgaac aggaagatac caaccagaac gattttattg gcgtggaatt taacgatatt    1500 

gattttagca aaattgcgga tggcgtgcat atgcaggcgt ttcgtgtgaa caaaattgaa    1560 

cagctgccgg atgtgtttga acaggcgaaa gcgattgcgc agcatgaacc ggtgctgatt    1620 

gatgcggtga ttaccggcga tcgtccgctg ccggcggaaa aactgcgtct ggatagcgcg    1680 

accagcagcg cggcggatat tgaagcgttt aaacagcgtt atgaagcgca ggatctgcag    1740 

ccgctgagca cctatctgaa acagtttggc ctggatgatc tgcagcatca gattggccag    1800 

ggcggctttt aa                                                        1812 

<210>4 

<211>603 

<212>PRT 

<213>Lactobacillus plantarum 

<400>4 

Met Val Met Lys Gln Thr Lys Gln Thr Asn Ile Leu Ala Gly Ala Ala 

1               5                   10                  15 

Val Ile Lys Val Leu Glu Ala Trp Gly Val Asp His Leu Tyr Gly Ile 

            20                  25                  30 

Pro Gly Gly Ser Ile Asn Ser Ile Met Asp Ala Leu Ser Ala Glu Arg 

        35                  40                  45 

Asp Arg Ile His Tyr Ile Gln Val Arg His Glu Glu Val Gly Ala Met 

    50                  55                  60 

Ala Ala Ala Ala Asp Ala Lys Leu Thr Gly Lys Ile Gly Val Cys Phe 

65                  70                  75                  80 

Gly Ser Ala Gly Pro Gly Gly Thr His Leu Met Asn Gly Leu Tyr Asp 

                85                  90                  95 

Ala Arg Glu Asp His Val Pro Val Leu Ala Leu Ile Gly Gln Phe Gly 

            100                 105                 110 

Thr Thr Gly Met Asn Met Asp Thr Phe Gln Glu Met Asn Glu Asn Pro 

        115                 120                 125 

Ile Tyr Ala Asp Val Ala Asp Tyr Asn Val Thr Ala Val Asn Ala Ala 

    130                 135                 140 

Thr Leu Pro His Val Ile Asp Glu Ala Ile Arg Arg Ala Tyr Ala His 

145                 150                 155                 160 

Gln Gly Val Ala Val Val Gln Ile Pro Val Asp Leu Pro Trp Gln Gln 

                165                 170                 175 

Ile Pro Ala Glu Asp Trp Tyr Ala Ser Ala Asn Ser Tyr Gln Thr Pro 

            180                 185                 190 

Leu Leu Pro Glu Pro Asp Val Gln Ala Val Thr Arg Leu Thr Gln Thr 

        195                 200                 205 

Leu Leu Ala Ala Glu Arg Pro Leu Ile Tyr Tyr Gly Ile Gly Ala Arg 

    210                 215                 220 

Lys Ala Gly Lys Glu Leu Glu Gln Leu Ser Lys Thr Leu Lys Ile Pro 

225                 230                 235                 240 

Leu Met Ser Thr Tyr Pro Val Lys Gly Ile Val Ala Asp Arg Tyr Pro 

                245                 250                 255 

Ala Tyr Leu Gly Ser Ala Asn Arg Val Ala Gln Lys Pro Ala Asn Glu 

            260                 265                 270 

Ala Leu Ala Gln Ala Asp Val Val Leu Phe Val Gly Asn Asn Tyr Pro 

        275                 280                 285 

Phe Ala Glu Val Ser Lys Ala Phe Lys Asn Thr Arg Tyr Phe Leu Gln 

    290                 295                 300 

Ile Asp Ile Asp Pro Ala Lys Leu Gly Lys Arg His Lys Thr Asp Ile 

305                 310                 315                 320 

Ala Val Leu Ala Asp Ala Gln Lys Thr Leu Ala Ala Ile Leu Ala Gln 

                325                 330                 335 

Val Ser Glu Arg Glu Ser Thr Pro Trp Trp Gln Ala Asn Leu Ala Asn 

            340                 345                 350 

Val Lys Asn Trp Arg Ala Tyr Leu Ala Ser Leu Glu Asp Lys Gln Glu 

        355                 360                 365 

Gly Pro Leu Gln Ala Tyr Gln Val Leu Arg Ala Val Asn Lys Ile Ala 

    370                 375                 380 

Glu Pro Asp Ala Ile Tyr Ser Ile Asp Val Gly Asp Ile Asn Leu Asn 

385                 390                 395                 400 

Ala Asn Arg His Leu Lys Leu Thr Pro Ser Asn Arg His Ile Thr Ser 

                405                 410                 415 

Asn Leu Phe Ala Thr Met Gly Val Gly Ile Pro Gly Ala Ile Ala Ala 

            420                 425                 430 

Lys Leu Asn Tyr Pro Glu Arg Gln Val Phe Asn Leu Ala Gly Asp Gly 

        435                 440                 445 

Gly Ala Ser Met Thr Met Gln Asp Leu Ala Thr Gln Val Gln Tyr His 

    450                 455                 460 

Leu Pro Val Ile Asn Val Val Phe Thr Asn Cys Gln Tyr Gly Phe Ile 

465                 470                 475                 480 

Lys Asp Glu Gln Glu Asp Thr Asn Gln Asn Asp Phe Ile Gly Val Glu 

                485                 490                 495 

Phe Asn Asp Ile Asp Phe Ser Lys Ile Ala Asp Gly Val His Met Gln 

            500                 505                 510 

Ala Phe Arg Val Asn Lys Ile Glu Gln Leu Pro Asp Val Phe Glu Gln 

        515                 520                 525 

Ala Lys Ala Ile Ala Gln His Glu Pro Val Leu Ile Asp Ala Val Ile 

    530                 535                 540 

Thr Gly Asp Arg Pro Leu Pro Ala Glu Lys Leu Arg Leu Asp Ser Ala 

545                 550                 555                 560 

Met Ser Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Phe Lys Gln Arg Tyr Glu Ala 

                565                 570                 575 

Gln Asp Leu Gln Pro Leu Ser Thr Tyr Leu Lys Gln Phe Gly Leu Asp 

            580                 585                 590 

Asp Leu Gln His Gln Ile Gly Gln Gly Gly Phe 

        595                 600 

<210>5 

<211>1812 

<212>DNA 

<213>Lactobacillus plantarum 

<400>5 

atggttatga aacaaacaaa acaaactaac atactagcag gtgcagcagt tattaaagtt     60 

ttagaagctt ggggagtaga tcatttgtat ggtattcctg gaggttcaat taattcgatt    120 

atggacgcat tatcagcaga aagggatcga atccattata ttcaagtacg gcatgaagaa    180 

gttggtgcaa tggccgccgc tgctgatgct aagctaacgg gtaaaatcgg ggtttgcttc    240 

ggctcagcgg gacctggtgg cactcatctt atgaatgggt tatatgatgc gcgtgaagac     300 

catgtccctg ttctagcgct tattggtcaa tttggcacta ctgggatgaa catggatacg     360 

ttccaagaaa tgaatgagaa tccgatttat gcggacgttg cagattataa tgtaacagcc     420 

gtcaatgctg ccacgttgcc acatgttatt gacgaagcaa ttcgacgcgc ctatgcgcac     480 

caaggtgttg cagttgtgca aattccagtc gatttaccat ggcaacagat tccagctgaa     540 

gattggtatg cttccgctaa tagttatcaa acgccgttat taccagaacc cgacgttcaa     600 

gcagtgacga gattgacaca gactttactc gcagctgaac ggccacttat ttactatggc     660 

attggagctc gtaaggctgg taaagaactc gaacaattga gtaaaacgtt gaaaattcca     720 

ttaatgagta cgtatccagt taagggtatt gtcgcagatc gttatcccgc ctatttgggt     780 

tccgctaata gggtggcaca aaaaccggcg aatgaggcac ttgcgcaagc tgacgttgtt     840 

ttatttgttg gtaataatta tccgtttgca gaagtttcca aagcgtttaa aaatacgcgt     900 

tatttcttac aaattgatat tgatccagct aagttaggta aacgacataa aacagatatt     960 

gcggtacttg ctgatgcaca aaagacgctg gccgcaattt tagcacaggt atctgaacgg    1020 

gagtcgacac cttggtggca agccaattta gccaatgtta aaaattggcg ggcttatcta    1080 

gcttcattag aagataagca ggaagggcct ttacaagcat atcaggtgct acgtgcggtt    1140 

aataaaattg cggagcctga tgcaatctat tcgattgatg ttggtgatat caatttgaat    1200 

gcgaatcgac atttgaaatt aacgccatcc aatcggcaca ttacttctaa cttatttgct    1260 

acgatgggag ttggtattcc gggagcaatt gctgccaaac ttaattatcc tgagcggcag    1320 

gtgtttaatc tggctggtga tggtggcgct tcgatgacca tgcaagattt ggcgacgcaa    1380 

gttcaatacc atttaccagt gattaatgtt gttttcacca actgccaata tggatttatc    1440 

aaagatgagc aggaagatac taatcagaat gattttattg gcgttgaatt caatgatatt    1500 

gattttagta agattgccga tggcgtgcac atgcaagctt ttcgagttaa taagattgag    1560 

caattacctg atgtttttga acaagccaaa gcaatcgctc agcatgaacc agttctgatt    1620 

gatgcggtga ttacaggaga tcggccactg cctgctgaaa agcttcgttt agattcggca    1680 

atgagttcgg cagctgatat tgaagcattt aaacaacggt atgaagctca agatttacaa    1740 

ccactttcaa cttatttaaa acaatttggc ttagatgatt tgcaacatca aattggacag    1800 

ggtgggtttt aa                                                        1812 

Claims (6)

1.一种丙酮酸氧化酶，其特征在于，所述丙酮酸氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.一种编码丙酮酸氧化酶的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为编码权利要求1所述的丙酮酸氧化酶的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为

(1)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或者

(2)SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因为权利要求3所述的丙酮酸氧化酶的核苷酸序列，所述空载体为pET28a(+)。

5.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞含有权利要求4所述的重组载体，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌Rosetta。

6.一种检测丙氨酸氨基转移酶的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下(a)-(d)中的至少一种：

(a)权利要求1所述的丙酮酸氧化酶；

(b)权利要求3所述的丙酮酸氧化酶的核苷酸序列；

(c)权利要求4所述的重组载体；

(d)权利要求5所述的重组宿主细胞。

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