CN104560832B

CN104560832B - 一种短乳杆菌、醛缩酶及其基因和制备他汀中间体的方法

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Publication number: CN104560832B
Application number: CN201510023924.8A
Authority: CN
Inventors: 许建和; 焦学成; 潘江; 陈琦; 孔旭东
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2018-06-05
Anticipated expiration: 2035-01-16
Also published as: CN104560832A

Abstract

本发明公开了一种短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、醛缩酶、及其基因和制备他汀中间体的方法，所述的短乳杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.10135。所述的短乳杆菌可以产生醛缩酶，与现有技术相比，所述的醛缩酶具有更高的活性、热稳定性以及底物耐受性，使用所述醛缩酶及其突变体催化制备他汀中间体(3R,5S)‑6‑氯‑2,4,6‑三脱氧‑D‑赤型吡喃糖苷具有反应条件温和、底物浓度高、催化剂用量少等优点，因此在工业生产中具有很好的应用前景。

Description

一种短乳杆菌、醛缩酶及其基因和制备他汀中间体的方法

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种短乳杆菌、醛缩酶、编码该醛缩酶的基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，利用重组表达转化体制备醛缩酶的方法，以及利用醛缩酶制备他汀中间体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖苷的方法。

背景技术

(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖苷[(3R,5S)-6-chloro-2,4,6-trideoxy-D-erythro-hexapyranoside，CTeHP]是合成他汀类药物的重要手性中间体，其分子式为C₆H₁₁O₃Cl，CAS号为714963-27-6。他汀类药物泛指羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，通过竞争性抑制内源性HMG-CoA还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白受体数量和活性增加、提高胆固醇清除能力、降低血清胆固醇水平。他汀类药物还可抑制肝脏合成载脂蛋白B-100，从而减少血浆载脂蛋白的合成和分泌，作为一类经典、有效的降脂药物，广泛应用于高脂血症的治疗。

大多数他汀类药物拥有一个共同的侧链，该侧链的生产方法包括两大类：不对称化学合成法以及酶合成法。与化学合成法相比，酶合成法具有反应条件温和、环境友好、产物光学纯度高等优点，非常适于工业应用。在酶合成法制备他汀手性侧链中间体中，研究较多的酶是羰基还原酶。但羰基还原酶在催化制备他汀侧链手性中间体的过程中存在反应步骤较多、需要添加昂贵的辅因子以及需要使用辅酶再生体系等缺陷。研究人员开发了一条利用2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)催化醛缩反应制备他汀侧链关键手性中间体的路线(J.Am.Chem.Soc.1994,116,8422–8423)。该路线以结构简单、廉价易得的乙醛和氯乙醛作为起始底物，连续两步酶促反应直接制备带有两个手性中心的他汀侧链中间体CTeHP，反应在中性水溶液中进行，不需要额外添加辅因子，也不需要进行pH调节，是合成他汀侧链最简洁的路线。美国Diversa公司通过宏基因组筛选方法得到了一个新的DERA酶，催化剂用量为20g/L时，时空产率为30.6g/L/h。浙江工业大学郑裕国课题组对Diversa公司得到的DERA酶进行了纯化表征，活性为1.8U/mg，当底物浓度为：氯乙醛80mM/乙醛160mM时，时空产率为75.1g/L/d。荷兰皇家帝斯曼(DSM)公司采用易错PCR技术对来源于大肠杆菌的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶(EcDERA)进行了定向进化，所得到的突变体DERAVar14在工业底物浓度条件(乙醛1M，氯乙醛0.5M)下的时空产率达174g/L/d(Directed evolution of an industrialbiocatalyst:2-deoxy-D-ribose 5-phosphate aldolase.Biotechnol.J.,2006,1:537–548)。与传统的化学合成法相比，酶合成法制备CTeHP的方法具有反应条件温和、环境友好、操作简单等优点，但是目前酶合成法仅限于实验室规模，且存在酶活性低、催化剂使用量大、底物耐受性差(氯乙醛浓度不高于0.5M)、反应时间长等缺陷，不适合工业化生产。因此，需要筛选活性高、稳定性好且能在较短反应时间获得较高浓度产物的酶，以满足工业化生产他汀中间体CTeHP的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对目前酶合成法制备CTeHP存在酶活性低、底物耐受性差等缺陷，提供一种催化活性高、底物耐受性强的醛缩酶、表达所述醛缩酶的基因及其重组表达载体和重组表达转化体、所述醛缩酶的制备方法和所述醛缩酶在制备(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖苷中的应用。

本发明的技术方案之一是：一种短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.10135。

所述短乳杆菌CGMCC No.10135来源于上海植物园采集的土壤样本，检测土壤样本中各个菌株的醛缩反应产物的浓度，发现其中1菌株表现出非常好的乙醛、氯乙醛缩合反应效果，对该菌株进行鉴定，为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，命名为ECU8302。该菌株已于2014年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并收到保藏中心登记入册编号CGMCC No.10135，其具有以下的微生物学特性：细胞呈短杆状，大小为0.7～1.0μm×2.0～4.0μm，不产生芽孢，革兰氏染色呈阳性；接触酶、氧化酶阴性；兼性厌氧；在pH5～9生长良好；发酵葡萄糖、葡萄糖酸钠、阿拉伯糖、果糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖产酸。

本发明的技术方案之二是：一种醛缩酶(LbDERA)，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)由SEQ ID No.2所示氨基酸序列在第29位、第78位或第163位替换一个氨基酸而形成的氨基酸序列组成的蛋白质。

本发明所述醛缩酶LbDERA从所述短乳杆菌CGMCC NO.10135中获得。所述短乳杆菌CGMCC NO.10135已于2014年12月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，采用鸟枪法对所述短乳杆菌CGMCC NO.10135的醛缩酶进行了克隆，获得一个具有较高活性和底物耐受性的重组醛缩酶，命名为LbDERA，其氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.2所示。

在筛选获得高活性及高底物耐受性醛缩酶LbDERA的基础上，发明人通过反复的实验和艰苦的摸索，试图通过调整LbDERA氨基酸序列中一些位点的氨基酸种类来达到使调整后的醛缩酶酶活性增大的目的，发现在SEQ ID No.2所示氨基酸序列的基础上对第29位的苏氨酸残基、第78位的谷氨酸残基或第163位的苯丙氨酸残基进行单点替换后，仍具有DERA活性，在此基础上获得了酶活性显著提高的突变体。

因此，较佳地，本发明所述蛋白质(b)为将如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第29位的苏氨酸残基替换为丙氨酸残基而形成的氨基酸序列组成的蛋白质(LbDERA_T29A)、将如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第78位的谷氨酸残基替换为赖氨酸残基而形成的氨基酸序列组成的蛋白质(LbDERA_E78K)或将如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第163位的苯丙氨酸残基替换为缬氨酸残基而形成的氨基酸序列组成的蛋白质(LbDERA_F163V)。

本发明所述醛缩酶的获得的方法为本领域常规；较佳地为分离获得、从重组表达所述醛缩酶的转化体中分离获得或者人工合成获得。

本发明的技术方案之三是：一种醛缩酶的基因，其

(1)核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；或

(2)编码如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或编码由SEQID No.2所示氨基酸序列在第29位、第78位或第163位替换一个氨基酸而形成的氨基酸序列组成的蛋白质。

本发明中，较佳地，所述醛缩酶的基因的核苷酸序列也可以是编码如序列表中SEQID No.2所示的氨基酸序列或编码由SEQ ID No.2所示氨基酸序列经过替换一个氨基酸而形成的氨基酸序列的其他任何碱基序列；更佳地，编码将如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第29位的苏氨酸残基替换为丙氨酸残基的氨基酸序列组成的蛋白质、编码将如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第78位的谷氨酸残基替换为赖氨酸残基的氨基酸序列组成的蛋白质或编码将如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第163位的苯丙氨酸残基替换为缬氨酸残基所示的氨基酸序列组成的蛋白质；最佳地，为按照密码子的简并性，为了适合在宿主细胞中有效表达所述醛缩酶的序列。

本发明所述醛缩酶的基因获得的方法为本领域常规；较佳地，为从所述短乳杆菌CGMCC NO.10135中分离获得、从重组表达所述醛缩酶的重组表达载体的质粒中扩增获得或者人工合成获得。

本发明的技术方案之四是：一种包含所述醛缩酶的重组表达载体。

本发明所述重组表达载体由通过本领域常规方法将所述醛缩酶的基因连接于各种骨架载体上构建而成；较佳地，可通过下述方法制得：将通过PCR所得的醛缩酶的基因的扩增产物与载体pMD-18T连接，形成克隆载体，之后将所述克隆载体和所述骨架载体pET28a用限制性内切酶EcoRI和HindⅢ双酶切，形成互补的粘性末端，再经连接酶连接，形成含有所述醛缩酶的基因的重组表达载体pET28a-LbDERA、pET28a-LbDERA_T29A、pET28a-LbDERA_E78K或pET28a-LbDERA_F163V。所述骨架载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，较佳地为质粒pET28a。

本发明的技术方案之五是：一种包含所述醛缩酶的基因的重组载体的转化体。

本发明所述转化体由通过本领域常规方法将所述重组表达载体转化至宿主微生物中制得；较佳地，将所述重组表达质粒pET28a-LbDERA、pET28a-LbDERA_T29A、pET28a-LbDERA_E78K或pET28a-LbDERA_F163V转化至E.coli BL21中，即可。所述宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足所述重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的醛缩酶的基因可被有效表达即可；较佳地为大肠杆菌，更佳地为大肠埃希氏菌E.coli BL21或E.coliDH5α。

本发明的技术方案之六是：一种所述醛缩酶的制备方法，其包括如下步骤：培养所述转化体，从培养液中获得醛缩酶。

本发明所述醛缩酶通过将所述转化体培养后得到。所述培养的方法和条件为本领域常规的方法和条件，可以根据宿主类型和培养方法等因素进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生所述醛缩酶即可；较佳地，为下述方法：将所述重组表达转化体接种至含50μg/mL卡那霉素的所述LB培养基中35～40℃、160～200rpm振荡培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.8～1.2时，按0.8～1.5％(v/v)的接种量装入有100mL所述LB培养基的500mL三角瓶中，加入终浓度为0.05～0.2mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)18～22℃诱导20～36小时，离心、收集细胞后洗涤获得静息细胞并悬浮，超声破碎后离心收集上清即得所述缩醛酶的粗酶液；更佳地，将所述重组表达转化体接种至含50μg/mL卡那霉素的所述LB培养基中37℃、180rpm振荡培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到1时，采用终浓度为0.1mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷20℃诱导24小时。所述培养所用的培养基为本领域任何可使所述转化体生长并产生所述醛缩酶的培养基；较佳地为LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，pH7.0。

本发明中，较佳地，所述诱导后有对所述醛缩酶进行纯化的步骤：将所述缩醛酶的粗酶液上样，用A液洗脱杂蛋白，然后用B液洗脱目标蛋白醛缩酶，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测结果收集纯化后的目标蛋白，所述A液为：Tris-HCl缓冲液(20mM，pH8.0)，含有0.5MNaCl、20mM咪唑和10％(w/v)的甘油；所述B液为：Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 8.0)，含有0.5MNaCl、500mM咪唑和10％(w/v)的甘油。

本发明的技术方案之七是：一种具有光学活性的他汀中间体(3R,5S)

-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖苷的制备方法，包括以下步骤，在缓冲液中，在如上所述醛缩酶的作用下，将如化学式Ⅰ所示的化合物乙醛和如化学式Ⅱ所示的化合物氯乙醛进行缩合反应，制得具有光学活性的如化学式Ⅲ所示的化合物他汀中间体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖苷：

本发明所述缓冲液为本领域常规的缓冲液，较佳地为pH4-10的缓冲液；更佳地为柠檬酸钠缓冲液(pH4-6)、磷酸钾缓冲液(pH6-8)、Tris-HCl缓冲液(pH8-9)和Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH9-10)；最佳地为pH6.0的磷酸钾缓冲液。所述氯乙醛的浓度为本领域常规，较佳地为50～1000mM，更佳地为100～700mM。所述乙醛的浓度为本领域常规，较佳地，所述乙醛的摩尔浓度为氯乙醛的两倍。所述反应的温度为本领域常规的温度，较佳地为20℃～65℃；更佳地为30～40℃。所述的反应的进程可以采用本领域中的常规测试方法，如气相色谱(毛细管柱HP-5MS)、HPLC或NMR进行监控，反应时间以产物的浓度不再继续提高为准，较佳地为3～4小时。

较佳地，所述的缩合反应结束后还包括将所述具有光学活性的他汀中间体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖苷进行提取的步骤；所述的提取的步骤为本领域常规的提取的步骤。更佳地为使用有机溶剂对反应液进行萃取，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂即可。所述有机溶剂为本领域常规的有机溶剂；较佳地为选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚、甲苯、二氯甲烷和三氯甲烷的一种或多种；更佳地为乙酸乙酯。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：所述醛缩酶LbDERA及其突变体具有高效催化乙醛和氯乙醛缩合，制备光学活性(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖苷的性能。经检测，LbDERA_T29A催化乙醛和氯乙醛缩合的活性提高了4.2倍；LbDERA_E78K催化乙醛和氯乙醛缩合的活性提高了3.7倍；LbDERA_F163V催化乙醛和氯乙醛缩合的活性提高了5.1倍。在氯乙醛浓度为0.5mol/L，催化剂使用量为8g/L时，3小时产物的得率为90.5％，时空产率高达603g/L/d。相对于其它现有的制备方法，使用所述制备方法反应时间短、获得的CTeHP浓度高，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于实现工业化生产。

生物材料保藏信息

本发明的短乳杆菌ECU8302，已于2014年12月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.10135，培养物名称是ECU8302，分类命名是短乳杆菌Lactobacillus brevis。

附图说明

图1为重组表达质粒pET28a-LbDERA的构建示意图。

图2为LbDERA的基因的SDS-PAGE的凝胶图片。图中各泳道分别为：1，蛋白质Marker；2，菌体破碎液离心上清；3，菌体破碎液离心沉淀。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明所述室温的本领域常规的室温，一般为10～30℃，较佳地为15～25℃。

本发明所述醛缩酶DERA的活力测定通过醇脱氢酶(ADH)偶联的方法在酶标仪上进行，2-脱氧核糖-5-磷酸(DR5P)在DERA催化下裂解产生的乙醛可以被ADH还原而消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，引起340nm波长下的吸光度下降(ε＝6.22mmol^-1·cm^-1)。由于ADH相对于DERA是过量的，从而认为吸光度下降的速率与乙醛的生成速率是一致的。该偶联反应在30℃下进行，反应体系为：磷酸钾缓冲液(100mM，pH7.0)、1mM的DR5P、2U/mL ADH、0.2mMNADH以及适量的DERA。连续监测10min内吸光度的变化，从而确定初始反应速率。一个DERA酶活力单位(U)的定义为在上述条件下，每分钟裂解1μmol的DR5P，生成1μmol的乙醛所需要的酶量。

所述CTeHP比旋光度的测量方法和气相色谱测定他汀中间体产物得率的方法，参见Directed evolution of an industrial biocatalyst:2-deoxy-D-ribose5-phosphatealdolase.Biotechnol.J.,2006,1:537–548。

实施例1

短乳杆菌CGMCC NO.10135的筛选

所述短乳杆菌CGMCC NO.10135来源于上海植物园采集的土壤样本，并命名为ECU8302。其分离的包括以下的步骤：将全国各地的100余份土样进行微生物筛选，将适量土样加入生理盐水(0.9％NaCl)中获得含菌悬浮液，将含菌悬浮液稀释后分别涂布LB培养基平板，分离单菌落。将分离的单菌落分别接种到LB培养基中，30℃振荡培养24h，培养液离心，收集静息细胞，加入到含有100mM乙醛和50mM氯乙醛的磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)中，振摇反应，检测醛缩反应产物的浓度，对这些菌株催化醛缩反应的活性进行评价，所述百分比为质量百分比。其中1菌株表现出非常好的乙醛、氯乙醛缩合反应效果，对该菌株进行鉴定，为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，命名为ECU8302。该菌株已于2014年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并收到保藏登记号CGMCCNo.10135。

所述短乳杆菌CGMCC No.10135具有以下的微生物学特性：

1、形态学的特性

在显微镜下观察在固体培养基中培养的菌株时，细胞呈短杆状，大小为0.7～1.0μm×2.0～4.0μm，不产生芽孢，革兰氏染色呈阳性。

2、培养学的特性

当在25～40℃、pH5～9下，在以下各种固体培养基中培养时，本发明的菌株具有以下的特性：在MRS培养基中培养：呈潮湿状，扁平，边缘粗糙，近乎半透明。所述MRS培养基为：葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％和柠檬酸氢二铵0.2％，余量为去离子水，所述百分比为质量体积百分比。

3、生理特性

接触酶、氧化酶阴性；兼性厌氧；发酵葡萄糖、葡萄糖酸钠、阿拉伯糖、果糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖产酸；在pH5～9生长良好。

实施例2

醛缩酶LbDERA基因的克隆

将菌株CGMCC No.10135在LB培养基中进行培养，采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取高纯度、大片段的基因组总DNA：将CGMCC NO.10135菌体加入液氮冷冻，研磨成粉，加入2×CTAB提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,pH 8.0，20mmol/L EDTA，1.4mol/LNaCl，20g/L CTAB，40mmol/L巯基乙醇)，65℃保温10分钟，间歇摇动。随后加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下12000rpm离心10min，将上清液转移到另一离心管中，再加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温下12000rpm离心10分钟。将上层水相转移到新的离心管中，加入与上层水相等体积异丙醇混匀，室温放置30分钟后，4000rpm离心10分钟，移去上清液，用70％乙醇漂洗，所述百分比为体积百分比，风干后加入20μl的TE缓冲液(100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)溶解DNA，-20℃保存备用。

采用Sau3AI对提取的总DNA进行部分酶切，酶切后的DNA片段通过电泳进行纯化，采用胶回收纯化试剂盒(购自天根生化科技有限公司)回收大约2～6kb的片段，回收的DNA溶解于Tris-HCl(10mmol/L，pH8.0)中，置于-20℃保藏。

然后按如下反应体系与载体pUC118进行连接：

16℃温育12小时后取10μL连接产物转化200μL大肠杆菌DH5α感受态细胞(TaKaRa，Code:D9057)，挑取单克隆到加有300μL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基的深孔板，37℃振荡培养过夜获得培养液。接种50μL培养液至加有600μL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基的二级深孔板，37℃振荡培养3小时后加入终浓度为0.2mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导24小时后得菌液。取50μL菌液加到300μL含有终浓度为乙醛100mM、氯乙醛50mM的反应混合液中，37℃振荡反应1小时，加入300μL乙醇终止反应，薄板层析检测产物的生成，生成的产物定义为阳性克隆子。将阳性克隆子委托上海桑尼生物技术有限公司进行序列测定，获得如SEQ ID NO.1所示的核酸序列，根据该核酸序列所推测的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，将该序列表达的醛缩酶命名为LbDERA。

将LbDERA的氨基酸序列与微生物来源的醛缩酶的氨基酸序列进行BLAST比对后发现，Lactobacillus brevis ATCC 367(购自美国菌种保藏中心ATCC)来源的DERA(GeneBank登陆号：CP000416.1)与所述LbDERA的同源性最高，即高于99％，但两者仍有一个氨基酸差异：LbDERA的氨基酸序列的第18位为丙氨酸，而Lactobacillus brevis ATCC 367来源的DERA的氨基酸序列的第18位为赖氨酸。因此，所述LbDERA的氨基酸序列是全新的。

实施例3

重组LbDERA的质粒以及重组菌、重组酶的制备

以引物对1：正向引物5’-ACGGAATTCATGACATTAACCACA-3’(如SEQ ID NO.3所示)，反向引物5’-CCCAAGCTTTTAGTAACCAGCTTT-3’(如SEQ ID NO.4所示)，利用聚合酶链式反应技术对实施例1中获得的LbDERA的核苷酸序列进行扩增，将获得的含有LbDERA基因序列的DNA片段分别用EcoRI和HindIII进行双酶切，随后与同样经过EcoRI和HindIII双酶切的质粒pET28a进行连接，获得质粒pET28a-LbDERA，其构建的示意图参见图1。

将获得的质粒pET28a-LbDERA转化到大肠杆菌E.coli BL21中，构建的重组大肠杆菌接种至含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有600mL LB培养基的2L三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到1.2时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，20℃诱导24小时后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，获得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)中，高压匀浆机破碎，10000×g离心10min，离心上清液冷冻干燥即得LbDERA重组酶的粗酶液，经检测，LbDERA重组酶的酶活力为15.8U/mg。

将得到的LbDERA重组酶的粗酶液上样到镍柱上，首先用A液洗脱杂蛋白，然后用B液洗脱目标蛋白醛缩酶LbDERA，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测结果(参见图2，图2各泳道分别为：1，蛋白质Marker；2，菌体破碎液离心上清；3，菌体破碎液离心沉淀)收集纯化后的目标蛋白，加入浓度为20％(w/v)的甘油，于-20℃保存备用，所述A液为：Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 8.0)，含有0.5M NaCl、20mM咪唑和10％(w/v)的甘油；所述B液为：Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 8.0)，含有0.5M NaCl、500mM咪唑和10％(w/v)的甘油。图2的结果说明，醛缩酶LbDERA大部分以可溶性形式表达。

实施例4

LbDERA在不同温度下的活性测定

在不同温度(20～70℃)下，以磷酸钾(100mM，pH7.0)为缓冲液，2mMDR5P为测活底物，根据分光光度计340nm处吸光值的变化考察了实施例2所制备的LbDERA的活性。结果如表1所示，LbDERA在40℃时催化活性最高；当温度继续升高后，酶活性开始下降。

表1LbDERA在不同温度下的活性

实施例5

LbDERA在不同pH缓冲液中的活性测定

反应温度为30℃时，以2mM DR5P为测活底物，根据分光光度计340nm处吸光值的变化，考察了实施例2所制备的LbDERA在不同pH值缓冲液中的活性。所用的缓冲液体系为：柠檬酸钠缓冲液(pH4.0–6.0)；磷酸钠缓冲液(pH 6.0–8.0)；Tris-HCl缓冲液(pH 8.0–9.0)和Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(9.0–10.0)。结果如表2所示，LbDERA的最适pH在6.0左右。

表2LbDERA在不同pH缓冲液中的活性

实施例6～9

重组LbDERA在不同温度下催化乙醛和氯乙醛缩合反应制备光学活性的CTeHP

将30mg如实施例2获得的重组LbDERA冻干酶粉加入到10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 6.0)中，加入底物乙醛和氯乙醛至终浓度分别为200mM和100mM，在20-65℃下混匀反应。每隔30min取样500μL，加入800μL乙酸乙酯萃取，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(毛细管柱HP-5MS)分析测定产物得率。分析条件为：以氮气为载气，进样口温度250℃，检测器温度280℃，初始柱温50℃，以20℃/min的速率升温至200℃，保持5min。反应最终结果列于表3。表3的数据说明，30℃为最适宜的催化乙醛和氯乙醛缩合反应制备光学活性的CTeHP的反应温度。

表3不同温度下重组酶LbDERA催化乙醛和氯乙醛连续羟醛缩合反应

实施例10～12

重组LbDERA在不同底物浓度下催化乙醛和氯乙醛缩合反应制备光学活性的CTeHP

将如实施例2获得的重组LbDERA冻干酶粉加入到10mL磷酸钾缓冲液(100mM，pH6.0)中，加入氯乙醛至终浓度分别为100mM、300mM和500mM，加入乙醛的摩尔浓度分别为200mM、600mM和1000mM，在30℃下混匀反应。每隔30min取样500μL检测产物得率计算反应时间，加入800μL乙酸乙酯萃取，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(毛细管柱HP-5MS)分析测定产物得率。具体分析条件为：以氮气为载气，进样口温度250℃，检测器温度280℃，初始柱温50℃，以20℃/min的速率升温至200℃，保持5min。反应最终结果列于表4。表4的数据说明，醛缩酶LbDERA具有较高的醛耐受性，氯乙醛浓度高达500mM，仍能有效转化。

表4不同底物浓度下重组酶LbDERA催化乙醛和氯乙醛连续羟醛缩合反应

由实施例4～12可见，较佳地，醛缩酶LbDERA酶促乙醛和氯乙醛缩合的条件如下：将实施例2所制备的醛缩酶LbDERA溶解于pH6.0的磷酸钾缓冲液，加入底物乙醛和氯乙醛，氯乙醛的浓度为100～500mM，乙醛的摩尔浓度为氯乙醛的两倍，反应液充分混合反应。反应在20℃～65℃下进行，40℃时更佳。反应结束后用乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂即可得到(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖苷。

实施例13

LbDERA_T29A的获得

采用II Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,Catalog#200522)所述方案进行操作。

设计含有突变点的引物(引物对2)：

5’-TTTCTTAGCTTCGTCACAAGCTTGCTTGATATCTGCTTCAG-3’(如SEQ ID NO.5所示)和

5’-CTGAAGCAGATATCAAGCAAGCTTGTGACGAAGCTAAGAAA-3’(如SEQ ID NO.6所示)。

PCR反应体系(50μL)：模板0.5～20ng，5μL 10×KOD plus buffer，5μL dNTP(各2.0mM)，2μL MgSO₄(25mM)，一对突变引物各1μL(20μM)，1个单位的KOD酶(TOYOBO CO.,LTD.,Osaka,Japan)，加灭菌蒸馏水至50μL。其中模板为实施例2获得的质粒pET28a-LbDERA。

PCR反应程序：(1)94℃变性5min；(2)94℃变性30秒；(3)55℃退火1min；(4)68℃延伸7min，其中步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后68℃延伸10min，4℃保存PCR扩增产物。

PCR扩增产物在37℃经内切酶DpnI消化2小时后转化E.coli BL21感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板。37℃过夜培养后，挑选单克隆送上海桑尼生物科技有限公司进行测序，结果显示，该单克隆的核苷酸序列为编码将如序列表中SEQID No.2所示的氨基酸序列的第29位的苏氨酸残基替换为丙氨酸残基的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列。

将获得的重组大肠杆菌接种至含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有600mL LB培养基的2L三角瓶中，置37℃，180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到1.2时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，20℃诱导24小时后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，获得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)中，高压匀浆机破碎，10000×g离心10min，离心上清液冷冻干燥即得LbDERA_T29A重组酶的粗酶液，活力为66.4U/mg。

将得到的LbDERA_T29A重组酶的粗酶液上样到镍柱上，首先用A液洗脱杂蛋白，然后用B液洗脱目标蛋白醛缩酶LbDERA，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测结果收集纯化后的目标蛋白，加入浓度为20％(w/v)的甘油，于-20℃保存备用，所述A液为：Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 8.0)，含有0.5MNaCl、20mM咪唑和10％(w/v)的甘油；所述B液为：Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 8.0)，含有0.5M NaCl、500mM咪唑和10％(w/v)的甘油。

实施例14

LbDERA_E78K的获得

设计含有突变点的引物(引物对3)：

5’-CGTGGCTTCAAAGATTTTACTTTCCGTTGCCATGG-3’(如SEQ ID NO.7所示)和5’-CCATGGCAACGGAAAGTAAAATCTTTGAAGCCACG-3’(如SEQ ID NO.8所示)。

PCR扩增产物在37℃经内切酶DpnI消化2小时后转化E.coli BL21感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板。37℃过夜培养后，挑选单克隆至上海桑尼生物科技有限公司进行测序，结果显示，该单克隆的核苷酸序列为编码将如序列表中SEQID No.2所示的氨基酸序列的第78位的谷氨酸残基替换为赖氨酸残基的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列。

将获得的重组大肠杆菌接种至含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有600mL LB培养基的2L三角瓶中，置37℃，180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到1.2时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，20℃诱导24小时后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，获得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于KPB缓冲液(20mM，pH7.0)中，高压匀浆机破碎，10000×g离心10min，离心上清液冷冻干燥即得LbDERA_E78K重组酶，活力为58.4U/mg。

实施例15

LbDERA_F163V的获得

设计含有突变点的引物(引物对4)：

5’-GCACCTGATGTTGAGACCCCAGTGGACGTCTTA-3’(如SEQ ID NO.9所示)和5’-TAAGACGTCCACTGGGGTCTCAACATCAGGTGC-3’(如SEQ ID NO.10所示)。PCR反应体系(50μL)：模板0.5～20ng，5μL 10×KOD plus buffer，5μL dNTP(各2.0mM)，2μL MgSO₄(25mM)，一对突变引物各1μL(20μM)，1个单位的KOD酶(TOYOBO CO.,LTD.,Osaka,Japan)，加灭菌蒸馏水至50μL。其中模板为实施例2获得的质粒pET28a-LbDERA。

PCR扩增产物在37℃经内切酶DpnI消化2小时后转化E.coli BL21感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板。37℃过夜培养后，挑选单克隆至上海桑尼生物科技有限公司进行测序，结果显示，该单克隆的核苷酸序列为编码将如序列表中SEQID No.2所示的氨基酸序列的第163位的苯丙氨酸残基替换为缬氨酸残基的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列。

将获得的重组大肠杆菌接种至含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有600mL LB培养基的2L三角瓶中，置37℃，180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到1.2时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，20℃诱导24小时后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，获得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.0)中，高压匀浆机破碎，10000×g离心10min，离心上清液冷冻干燥即得LbDERA_F163V重组酶，活力为80.6U/mg。

实施例16～19

LbDERA及其突变体催化乙醛和氯乙醛连续羟醛缩合反应

实施例2获得的野生型LbDERA、实施例13～15获得的突变体LbDERA_T29A、LbDERA_E78K和LbDERA_F163V分别催化乙醛和氯乙醛的缩合反应。将重组酶置于1mL磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.0)中，加入底物乙醛和氯乙醛至终浓度分别为1M和0.5M，在30℃下混匀反应进行，结果列于表5，表5的数据说明LbDERA_F163V的产物得率可以达到90.5％，时空产率高达603g/L/d，催化效率最高；而LbDERA_E78K、LbDERA_T29A的产物得率也接近和超过80％；即与野生型相比，突变体LbDERA_T29A、LbDERA_E78K和LbDERA_F163V的产物得率明显提高，催化效率提高。

表5.重组酶LbDERA及其突变体催化乙醛和氯乙醛缩合反应的结果

实施例20～23

重组LbDERA_F163V催化乙醛和氯乙醛连续羟醛缩合反应

将适量如实施例15获得的重组LbDERA_F163V冻干酶粉加入到10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 6.0)中，加入氯乙醛至终浓度分别如表6所示，加入乙醛的摩尔浓度为氯乙醛的2倍，在30℃下混匀反应。每隔30min取样500μL，加入800μL乙酸乙酯萃取，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(毛细管柱HP-5MS)分析测定产物得率。具体分析条件为：以氮气为载气，进样口温度250℃，检测器温度280℃，初始柱温50℃，以20℃/min的速率升温至200℃，保持5min。结果列于表6。表6的数据说明，重组酶LbDERA_F163V具有很高的底物耐受性，即使氯乙醛的浓度提高到700mM，产物得率维持在85％以上。

表6重组酶LbDERA_F163V催化乙醛和氯乙醛连续羟醛缩合反应

实施例24

(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖苷的扩大制备

在1L三口烧瓶中进行反应，加入500mL磷酸钾缓冲液(100mM，pH 6.0)，加入乙醛和氯乙醛至终浓度分别为1.4M和0.7M，加入8g如实施例5所制备的LbDERA_F163V粗酶粉，在30℃，100rpm机械搅拌下反应。反应4h后，转化率达到95％。停止反应，加入500mL乙酸乙酯进行萃取，重复三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，获得(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖苷49.1g，产物得率为84.3％，GC纯度为97.0％，比旋光度(c 1.0,CHCl₃)，时空产率为589g/L/d。

对比实施例1

Lactobacillus brevis ATCC 367的DERA的克隆、表达及活力测定

对Lactobacillus brevis ATCC 367(购自美国菌种保藏中心ATCC)中的DERA进行了克隆(GeneBank登陆号：CP 000416.1)，其与本发明所述LbDERA序列(如序列表中SEQ IDNo.2所示)进行BLAST之后发现，两者仅有一个氨基酸差异，即LbDERA的氨基酸序列的第18位为丙氨酸，而Lactobacillus brevis ATCC 367来源的醛缩酶的氨基酸序列的第18位为赖氨酸，两者同源性高于99％。将Lactobacillus brevis ATCC 367来源的醛缩酶在大肠杆菌中重组表达，并对其进行了纯化鉴定(同实施例2～3的操作步骤)，其纯酶的V_max为31.1μmol/min/mg蛋白，远低于本发明的LbDERA(V_max＝102.2μmol/min/mg蛋白)。其中，V_max的测定方法为：用1mM～20mM浓度的底物(2-脱氧核糖-5-磷酸，DR5P)，进行LbDERA的酶活性测定，然后通过Lineweaver–Burk作图法进行计算。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，其特征在于，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.10135。

2.一种醛缩酶，其特征在于，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)由SEQ ID No.2所示氨基酸序列在第29位、第78位或第163位替换一个氨基酸而形成的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述蛋白质(b)为将如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第29位的苏氨酸残基替换为丙氨酸残基而形成的氨基酸序列组成的蛋白质、将如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第78位的谷氨酸残基替换为赖氨酸残基而形成的氨基酸序列组成的蛋白质或将如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第163位的苯丙氨酸残基替换为缬氨酸残基而形成的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.一种醛缩酶的基因，其特征在于，其

(1)核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；或

(2)编码如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或编码由SEQ IDNo.2所示氨基酸序列在第29位、第78位或第163位替换一个氨基酸而形成的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述基因(2)编码将如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第29位的苏氨酸残基替换为丙氨酸残基的氨基酸序列组成的蛋白质、编码将如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第78位的谷氨酸残基替换为赖氨酸残基的氨基酸序列组成的蛋白质或编码将如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的第163位的苯丙氨酸残基替换为缬氨酸残基所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

4.一种包含如权利要求3所述的醛缩酶的基因的重组载体。

5.一种包含如权利要求4所述的重组载体的转化体。

6.一种醛缩酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：培养如权利要求5所述的转化体，从培养液中获得醛缩酶。

7.一种具有光学活性的他汀中间体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖苷的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，在缓冲液中，在如权利要求2所述醛缩酶的作用下，将如化学式Ⅰ所示的化合物乙醛和如化学式Ⅱ所示的化合物氯乙醛进行缩合反应，制得具有光学活性的如化学式Ⅲ所示的化合物他汀中间体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖苷：

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为pH4-10的缓冲液；所述氯乙醛的浓度为50～1000mM；所述乙醛的摩尔浓度为所述氯乙醛的两倍；所述反应的温度为20℃～65℃。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为选自pH4-6的柠檬酸钠缓冲液、pH6-8的磷酸钾缓冲液、pH8-9的Tris-HCl缓冲液和pH9-10的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液的任一种。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为pH6.0的磷酸钾缓冲液。

11.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的氯乙醛的浓度为100～700mM。

12.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的反应的温度为30～40℃。