CN110004133A - 油酸水合酶及其在10-羟基硬脂酸与10-羰基硬脂酸合成中的应用 - Google Patents

油酸水合酶及其在10-羟基硬脂酸与10-羰基硬脂酸合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及来源于嗜氨副球菌的油酸水合酶及其基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体，其重组酶及制备方法，以及该重组酶作为催化剂在制备10‑羟基硬脂酸和10‑羰基硬脂酸的应用。与现有技术相比，应用本发明的油酸水合酶催化制备10‑羟基硬脂酸和10‑羰基硬脂酸，具有反应条件温和，产物浓度高，操作简便，反应时间短，易于放大等显著优势，具有很好的应用前景。

Description

油酸水合酶及其在10-羟基硬脂酸与10-羰基硬脂酸合成中的 应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种嗜氨副球菌(Paracoccusaminophilus)来源的重组油酸水合酶，表达所述油酸水合酶的基因及其重组表达载体和重组表达转化体，该重组油酸水合酶的制备方法，以及利用该油酸水合酶作为催化剂催化制备10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸的应用。
背景技术
传统化工产业以石油、天然气、煤炭等石化资源作为原料和能源，石化资源的大量消耗，造成了资源短缺以及全球气候变暖等严重问题，为缓解现有的这些问题，利用资源丰富、可再生的生物质资源，通过生物技术生产生物基燃料、材料和化学品的理念受到了广泛关注。
油酸作为一种不饱和脂肪酸，是油脂类生物质的重要组成成分，资源非常丰富。以油酸作为出发原料，可以通过酶法转化制备10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸，这两种长链脂肪酸衍生物可以作为润滑剂、表面活性剂以及聚酯合成的原料；10-羰基硬脂酸还可以进一步通过酶法裂解制备癸二酸、羟基癸酸、癸醇、辛醇等中链脂肪族功能化学品。
目前脂肪酸(包括油酸)的酶法催化转化研究主要集中在转化途径的建立和高活力酶的挖掘。2012年，Joo等从嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)中挖掘获得一个脂肪酸水合酶，使用重组表达该酶的大肠杆菌整细胞催化油酸水合转化为10-羟基硬脂酸，底物浓度为50g/L，整细胞催化剂用量为10g/L，反应4h，转化率为92％，时空产率为295g/L/d(J.Biotechnol.,2012,158(1-2):17-23)。2013年，Park课题组开发了一条多酶整细胞催化油酸转化、裂解的途径，其中脂肪酸水合酶催化的油酸水合反应是这条途径的第一步，也是比较关键的限速步骤。这条途径给脂肪酸的催化转化提供了新的方向，然而这条途径的底物上载量仅为1mM，转化率为60％(Angew.Chem.Int.Ed.,2013,52(9):2534-2537)，存在着油酸水合酶催化活性低、底物上载量低，反应时间长以及转化率低等问题。2015年，Lee等人在谷氨酸棒状杆菌中共表达了油酸水合酶和10-羟基硬脂酸脱氢酶，利用整细胞催化油酸一步转化生成10-羰基硬脂酸。该反应的底物上载量为2.5g/L(8.8mM)，整细胞催化剂的上载量为5g/L，反应6h后，转化率仅有78％，时空产率仅为16.5g/L/d(Biotechnol.Lett.,2015,37(5):1101-1106)。
对于油酸水合酶催化生产10-羟基硬脂酸以及油酸水合酶和10-羟基硬脂酸脱氢酶的级联催化生产10-羰基硬脂酸的反应，前人的研究都存在底物上载量低，转化率低的现象，主要原因是现有的油酸水合酶的活力偏低，因此需要筛选高活力的油酸水合酶，在此基础上优化10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸合成的催化反应体系，以达到更优的反应效果。
发明内容
针对目前已报道的油酸水合酶活力低下，催化反应时空产率低的缺陷，本发明提供了一种具有高活性的油酸水合酶，表达所述油酸水合酶的基因及其重组表达载体和重组表达转化体，所述油酸水合酶的制备方法及其在合成10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案之一：提供了一种高活性的油酸水合酶。
本发明以已报道的分别来源于Stenotrophomonas maltophilia、Macrococcuscaseolyticus和Lysinibacillus fusiformis的油酸水合酶的氨基酸序列作为探针，在美国国立生物技术信息中心(NCBI,National Center for Biotechnology Information)进行序列比对，挑选一致性为30％～70％的一批序列作为备选对象，设计相应的PCR扩增引物，对已有的微生物基因组DNA进行目的片段扩增。将扩增的目的片段克隆到大肠杆菌中进行候选酶的表达，对表达的候选油酸水合酶进行油酸水合反应的功能验证。在成功克隆表达的序列中，发现来源于嗜氨副球菌(Paracoccus aminophilus)JCM 7686的一个油酸水合酶具有最高的活性，将该酶命名为PaOH。所述油酸水合酶PaOH的核酸序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述菌株嗜氨副球菌(Paracoccus aminophilus)JCM 7686购自日本微生物菌种保藏中心。
在获得油酸水合酶PaOH的基础上，采用易错PCR的策略对油酸水合酶PaOH进行定向进化，结合酶标仪高通量筛选方法，获得活性显著改善的油酸水合酶突变体。
本发明提供一种活性显著改善的油酸水合酶，所述油酸水合酶是由下述氨基酸序列组成的蛋白质，
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第254位组氨酸替换为酪氨酸；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；
(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第22位天冬酰胺替换为丝氨酸；
(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第60位异亮氨酸替换为天冬酰胺；
(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第300位天冬酰胺替换为天冬氨酸，第632位苏氨酸替换为异亮氨酸；
(13)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第129位谷氨酸替换为甘氨酸，第368位苯丙氨酸替换为丝氨酸，第626位苯丙氨酸替换为苏氨酸；
(14)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第40位天冬酰胺替换为酪氨酸，第316位丙氨酸替换为苏氨酸，第356位丙氨酸替换为苏氨酸。
本发明所述油酸水合酶的获得方法为本领域常规方法，较佳地为从重组表达上述油酸水合酶的转化体中分离获得；或者人工合成获得。
本发明所述油酸水合酶的活力测定采用常规方法进行。例如，反应在2mlEppendorf管中进行，将适当稀释的酶液加入到含有底物油酸的柠檬酸-磷酸缓冲液(100mM,pH 6.5)中，振荡反应4h后，加入20％(w/v)的硫酸溶液终止反应，乙酸乙酯萃取、干燥过夜。干燥后的萃取上清液加入适量的吡啶和N,O-双三甲硅基三氟乙酰胺(BSTFA)，对脂肪酸底物和产物进行衍生化处理，再进行气相色谱检测，分析底物和产物的含量，计算反应的转化率。
油酸水合酶的活力单位(U)定义为：上述反应条件下，每分钟催化1.0μmol油酸转化生成10-羟基硬脂酸所需的酶量。
本发明的技术方案之二：提供了一种编码如技术方案一所述油酸水合酶的核酸。
较佳的，可以依据密码子的简并性，对所述核酸序列进行优化，使其在宿主细胞中更有效地表达如技术方案一所述的油酸水合酶。
本发明所述油酸水合酶的编码核酸的获得方法为本领域常规方法：为从所述嗜氨副球菌(Paracoccus aminophilus)JCM 7686中分离获得；从所述油酸水合酶突变体的重组表达转化体的质粒中扩增获得；或者通过人工全序列合成的手段获得编码如技术方案一所述油酸水合酶的核酸分子。
本发明的技术方案之三：提供了一种包含所述油酸水合酶基因核酸的重组表达载体。所述重组表达载体可通过本领域常规方法将编码本发明所述油酸水合酶基因的核酸连接于各种合适载体上构建而成。所述载体可以是本领域的各种常规载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，只要所述重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达所述的油酸水合酶即可。所述油酸水合酶基因可以操作性连接于载体中合适的调控序列的下游，以实现所述油酸水合酶的组成型或诱导型表达。所述载体优选质粒，更优选质粒pET28a。
较佳地，可通过下述方法制得本发明所述的重组表达载体：将如技术方案二所述的油酸水合酶的编码核酸和所述表达载体pET28a用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，形成互补的粘性末端，再经连接酶连接，形成含有所述油酸水合酶核酸序列的重组表达载体。
本发明的技术方案之四：提供了一种包含所述油酸水合酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体。所述重组表达转化体可通过将本发明所述的重组表达载体转化至合适的宿主细胞中来制得。所述宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主细胞，前提是能使所述重组表达载体稳定地自行复制，且其所携带的油酸水合酶基因可被有效表达即可。本发明优选宿主细胞为大肠杆菌，更优选的为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)或大肠杆菌E.coli DH5α。
本发明的技术方案之五：提供了所述重组油酸水合酶的制备方法，包括如下步骤：培养本发明所述的重组表达转化体，获得重组油酸水合酶。
其中，培养所述重组表达转化体所用的培养基可选自本领域的常规培养基，前提是可使重组表达转化体生长并产生本发明所述的重组油酸水合酶。
重组表达转化体培养的具体操作均可按本领域常规操作进行。
所述重组表达转化体是大肠杆菌时，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。
重组表达转化体的培养和重组油酸水合酶的产生，优选下述方法：将本发明所述的重组大肠杆菌接种至含有卡那霉素的LB培养基中，37℃培养，当培养液的光密度OD600达到0.5-0.7(优选0.6)时，将培养温度降低至16-30℃，加入终浓度为0.1-1.0mmol/L(优选0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，高效表达本发明所述的重组油酸水合酶。培养结束后，培养液离心，收集获得静息细胞。对静息细胞进行破碎，高速离心，获得含有所述油酸水合酶的粗酶液，对静息细胞或粗酶液进行冷冻干燥，可以分别获得冻干细胞与冻干酶粉。
本发明的技术方案之六：提供一种重组油酸水合酶作为催化剂，制备10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸的方法。
所述油酸水合酶是由下述氨基酸序列组成的蛋白质，
(1)如SEQ ID No.2所示氨基酸序列
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第254位组氨酸替换为酪氨酸；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸；
(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；
(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第22位天冬酰胺替换为丝氨酸；
(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第60位异亮氨酸替换为天冬酰胺；
(13)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第300位天冬酰胺替换为天冬氨酸，第632位苏氨酸替换为异亮氨酸；
(14)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第129位谷氨酸替换为甘氨酸，第368位苯丙氨酸替换为丝氨酸，第626位苯丙氨酸替换为苏氨酸；
(15)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第40位天冬酰胺替换为酪氨酸，第316位丙氨酸替换为苏氨酸，第356位丙氨酸替换为苏氨酸。
所述重组油酸水合酶可以催化油酸水合生成10-羟基硬脂酸，所述油酸水合酶催化油酸水合生成10-羟基硬脂酸的具体反应条件如底物浓度、缓冲液组成、pH、酶用量等可按本领域此类反应的常规条件进行选择。优选的，反应缓冲液为柠檬酸-磷酸缓冲液，pH6.0-7.5，缓冲液浓度为0.05～0.2mol/L，更优选浓度为0.1mol/L的柠檬酸-磷酸缓冲液，pH6.5；反应温度为15～35℃，更优选25℃；底物油酸在反应液中的浓度为1～90g/L，所述重组油酸水合酶的活力上载量为0.1～5kU/L，在所述重组油酸水合酶的作用下，催化油酸进行水合反应，生成10-羟基硬脂酸。
可以采用常规方法对反应获得的10-羟基硬脂酸进行分离，然后在10-羟基硬脂酸脱氢酶催化下，转化生成10-羰基硬脂酸；或者，无须对反应获得的10-羟基硬脂酸进行分离，直接在反应液中加入10-羟基硬脂酸脱氢酶，使10-羟基硬脂酸转化生成10-羰基硬脂酸。
具体的，10-羰基硬脂酸的合成可以有以下两种方法，
方法一：使用所述重组油酸水合酶作为催化剂，催化油酸水合生成10-羟基硬脂酸；反应结束后对产物10-羟基硬脂酸进行分离，然后使用10-羟基硬脂酸脱氢酶作为催化剂，在其他辅助酶和辅底物存在的条件下，催化10-羟基硬脂酸脱氢生成10-羰基硬脂酸。
所述10-羟基硬脂酸脱氢酶来源于藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，命名为MlADH，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。所述10-羟基硬脂酸脱氢酶催化10-羟基硬脂酸脱氢酶氧化制备10-羰基硬脂酸的具体反应条件如底物浓度、缓冲液组成、pH、酶用量等可按本领域此类反应的常规条件进行选择。优选的，反应缓冲液为柠檬酸-磷酸缓冲液，pH7.5-9.0，缓冲液浓度为0.05～0.2mol/L，更优选浓度为0.1mol/L的柠檬酸-磷酸缓冲液，pH8.0；反应温度为15～35℃，更优选25℃；底物10-羟基硬脂酸在反应液中的浓度为1～100g/L，所述重组10-羟基硬脂酸脱氢酶的活力上载为0.1～10kU/L。
10-羟基硬脂酸脱氢酶催化10-羟基硬脂酸氧化生成10-羰基硬脂酸的反应需要辅酶NAD+的参与，辅酶NAD+的浓度为0.1～0.5mM，反应过程中辅酶NAD+还原为NADH。可以通过与乳酸脱氢酶催化的反应进行耦合实现反应过程中NAD+的原位再生。所述乳酸脱氢酶以丙酮酸为辅底物，催化NADH氧化产生NAD+，同时丙酮酸被还原生成乳酸。
方法二：使用本发明所述的重组油酸水合酶作为催化剂，催化油酸水合生成10-羟基硬脂酸；反应的转化率达到预期水平时，将反应体系的pH调整到7.5-9.0，然后加入如上所述的10-羟基硬脂酸脱氢酶MlADH、乳酸脱氢酶、辅底物丙酮酸以及辅酶NAD+，原位催化第一步反应中生成的10-羟基硬脂酸转化为10-羰基硬脂酸。
反应结束后，可采用本领域常规方法进行产物的提取。在反应液中加酸，将反应液的pH调节至强酸性，优选的，加入硫酸(20％,w/v)，将反应液pH调节至2左右，然后用等体积乙酸乙酯进行多次萃取，合并萃取液，旋转蒸发除去溶剂，然后再加入适量甲醇，加热至回流，搅拌1h，冷却，抽滤，滤饼干燥，得到目标产品。
与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：
本发明提供了一种新的高活性的油酸水合酶及其突变体，所述油酸水合酶可以高效催化油酸的水合以制备10-羟基硬脂酸，进而通过10-羟基硬脂酸脱氢酶MlADH催化合成10-羰基硬脂酸。使用本发明方法，可以高效制备10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸，产物浓度高，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用前景。
通过随后的描述和所附权利要求，本领域技术人员会明白本申请的其他目标、特征、优点和各方面。然而，应当理解，虽然表明了本申请的优选实施方式，但以下描述、所附的权利要求和具体实施例仅是为了说明而给出。本领域技术人员阅读下文后不难明白属于本发明构思和范围内的各种改变和改进。
附图说明
图1：酶促油酸转化生成10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书进行选择。
下列实施例中的材料来源为：
嗜氨副球菌(Paracoccus aminophilus)JCM 7686。
表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。
E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。
实施例1油酸水合酶PaOH的基因克隆与表达
设计上下游引物：
上游引物：GGAATTCATGAGCCCCAAGACCTCCAAACCC，其中下划线所示序列为限制性内切酶EcoR I酶切位点；
下游引物：CCGCTCGAGTCACTTGCGGGTCCTCTCTTTGA，其中下划线所示序列为限制性内切酶Xho I酶切位点。
以嗜氨副球菌JCM 7686的基因组DNA作为模版，进行PCR扩增，对PCR产物进行电泳纯化，使用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切，然后通过T4 DNA连接酶连接到同样使用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切的pET28a质粒上，形成含有本发明所述油酸水合酶基因序列的重组表达质粒pET28a-PaOH。将所述重组表达质粒转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基平板上，过夜培养，挑取单克隆，进行阳性验证，获得表达重组油酸水合酶PaOH的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-PaOH。
所述油酸水合酶PaOH的核酸序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。所述菌株嗜氨副球菌(Paracoccus aminophilus)JCM 7686购自日本微生物菌种保藏中心。
将所述重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-PaOH接种到装有4mL LB培养基(含终浓度为50μg/mL的卡那霉素)的试管中，37℃、180rpm振摇培养，至OD600达到0.6时，按1％的接种量接种至100mL的LB培养基(含终浓度为50μg/mL的卡那霉素)中，在37℃、180rpm摇床上振摇培养至菌液的OD600约为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.2mM，在16℃、180rpm摇床上继续培养20h。离心收集细胞，生理盐水洗涤两次后，用10mL的柠檬酸-磷酸缓冲液(10mM，pH 6.5)重悬。将重悬菌液放在冰水混合物上，用超声破碎仪进行破碎，功率400瓦，工作时间4s，间隔时间6s，共99个循环。破碎结束后，16,200×g，4℃离心20min，获得含有重组油酸水合酶的离心上清液。采用镍离子亲和柱对重组油酸水合酶进行纯化，对纯酶进行活力测定，为5.21U/mg。
油酸水合酶的活力测定反应在2ml Eppendorf管中进行，将100μl适当稀释的酶液加入到390μL的柠檬酸-磷酸缓冲液(100mM,pH 6.5)中，再加入10μl油酸底物(500mM，溶解于DMSO中)，30℃、1,000rpm振荡反应4h后，加入20μL硫酸(20％,w/v)终止反应。再加入等体积的乙酸乙酯振荡萃取，14,000rpm离心2min。将萃取有机相转移到新的EP管中，加入适量无水硫酸钠干燥过夜。取5μL干燥后的萃取有机相加入到气相分析瓶的内衬管中，再加入85μL吡啶和10μL的BSTFA，在烘箱中保温15min。通过气相色谱分析检测底物和产物的含量，计算反应的转化率，并换算为酶的活力。
气相色谱分析条件如下：色谱柱为HP-5MS，进样口和氢火焰检测器的温度都为280℃，初始柱温为180℃，4℃/min升至250℃。样品进样量为1μL，分流比为25:1，恒压模式控制。油酸的保留时间为9.95min，10-羟基硬脂酸的保留时间为13.9min。
实施例2油酸水合酶PaOH的定向进化改造
采用易错PCR的策略对油酸水合酶PaOH进行随机突变改造。
使用的引物为：
上游引物：GGAATTCATGAGCCCCAAGACCTCCAAACCC，其中下划线所示序列为限制性内切酶EcoR I的酶切位点；
下游引物：CCGCTCGAGTCACTTGCGGGTCCTCTCTTTGA，其中下划线所示序列为限制性内切酶Xho I的酶切位点。
以pET28a-PaOH为模板，用rTaq DNA聚合酶进行易错PCR，构建随机突变库。PCR体系(50μL)：rTaq DNA聚合酶0.5μL，10×PCR buffer(Mg2+Plus)5.0μL，dNTP Mixture(各2.0mM)4.0μL，终浓度为100μmol/L的MnCl2，pET28a-SmCR质粒100ng，上下游引物(10μM)各2μL，加灭菌蒸馏水补足至50μL。PCR反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)58℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，对回收后的目的基因DNA片段与空载质粒pET28a分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I在37℃双酶切6h。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，用T4 DNA连接酶将得到的线性化pET28a质粒与纯化后的目的基因DNA片段置于16℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h。
将转化平板上的转化体用牙签挑入96孔深孔板中，于37℃，220rpm摇床中培养过夜。从一级板的孔洞中吸取50μL菌液接入二级板的相应孔洞中，于37℃，220rpm摇床中培养2～3h后，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃培养20h。然后于4℃、3500×g离心10min，倒掉上层培养基，每个孔洞中加入200μL溶菌酶液(750mg溶菌酶和10mg DNA酶溶解于1L去离子水中)，振荡混匀，再于37℃摇床上处理1.5h。随后4℃、3500×g离心10min，取10μL细胞破碎离心上清液转移到每个孔加了190μL反应液的96孔酶标板中，190μL反应液的配方为：柠檬酸-磷酸缓冲液(100mM,pH 7.5)，含有1mM油酸、0.2mM NAD+以及0.2U MlADH，30℃、200rpm震荡混匀，在酶标仪上读取340nm处吸光度值的上升。在96孔板中对表达的油酸水合酶蛋白进行高通量活力筛选，对活性较高的突变体进行纯化表征，活力测定复筛，对活性提高的突变体进行基因测序。
油酸水合酶的活力复筛反应在2ml Eppendorf管中进行，将100μl适当稀释的酶液加入到390μl的柠檬酸-磷酸缓冲液(100mM,pH 6.5)中，再加入10μl油酸底物(500mM，溶解于DMSO中)，30℃、1,000rpm振荡反应4h后，加入20μL硫酸(20％,w/v)终止反应。再加入等体积的乙酸乙酯振荡萃取，14,000rpm离心2min。将萃取有机相转移到新的EP管中，加入适量无水硫酸钠干燥过夜。取5μL干燥后的萃取有机相加入到气相分析瓶的内衬管中，再加入85μL吡啶和10μL的BSTFA，在烘箱中保温15min。通过气相色谱分析检测底物和产物的含量，计算反应的转化率，并换算为酶的活力。
通过易错PCR突变，得到一些油酸水合活性提高的突变体，进而对其中的一些突变点进行组合，得到了对油酸水合活性显著提高的系列突变体，这些突变体的序列以及这些突变体对油酸的水合活性列于表1中。在表1的列表中，序列标号分别指表1后面相对应的一系列序列；突变体活性提高倍数中，一个加号“+”表示突变体蛋白比由SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了0.1-1.5倍；两个加号“++”表示突变体蛋白比由SEQID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了1.6-3.0倍；三个加号“+++”表示突变体蛋白比由SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了3.1-5.0倍。
表1羰基还原酶突变体序列和相应的活性改进列表
所述油酸水合酶突变体的氨基酸序列是如下序列中的一种：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第254位组氨酸替换为酪氨酸；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；
(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第22位天冬酰胺替换为丝氨酸；
(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第60位异亮氨酸替换为天冬酰胺；
(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第300位天冬酰胺替换为天冬氨酸，第632位苏氨酸替换为异亮氨酸；
(13)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第129位谷氨酸替换为甘氨酸，第368位苯丙氨酸替换为丝氨酸，第626位苯丙氨酸替换为苏氨酸；
(14)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第40位天冬酰胺替换为酪氨酸，第316位丙氨酸替换为苏氨酸，第356位丙氨酸替换为苏氨酸。
实施例3重组油酸水合酶PaOHM6的表达及活力测定
将实施例2获得的油酸水合酶PaOH突变体M6对应的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-PaOHM6接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃继续诱导培养12小时后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得到静息细胞。将100mL培养液所得的静息细胞悬浮于10mL的柠檬酸-磷酸缓冲液(10mM,pH 7.0)中，在冰水浴中超声破碎：功率400W，工作4s，间歇6s，进行99个循环，4℃下12000×g离心40分钟，收集上清粗酶液，活力为6.0U/mL。另外，将收获的粗酶液冷冻干燥，获得的冻干酶粉活力为1.1U/mg。
同样的方法，得到油酸水合酶PaOH及其他突变体的静息细胞、粗酶液、冻干酶粉并进行活力测定。
实施例4重组油酸水合酶PaOH催化油酸水合制备10-羟基硬脂酸
在0.5ml柠檬酸-磷酸缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)中加入终浓度为1g/L的油酸(预先溶解于DMSO中，浓度为500mM)，100U/L如实施例1所述重组油酸水合酶PaOH离心上清液。在15℃，1000rpm振荡反应4小时。反应结束后用硫酸(20％，w/v)调节pH至2以下，加入0.5mL乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，气相色谱分析反应转化率为90.2％。
实施例5-1重组油酸水合酶PaOHM6催化油酸水合制备10-羟基硬脂酸在0.5ml柠檬酸-磷酸缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)中加入终浓度为1g/L的油酸(预先溶解于DMSO中，浓度为500mM)，100U/L如实施例3所述制备的重组油酸水合酶PaOHM6粗酶液。在15℃，1000rpm振荡反应4小时。反应结束后用硫酸(20％，w/v)调节pH至2以下，加入0.5mL乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，气相色谱分析反应转化率为96.1％。
实施例5-2重组油酸水合酶PaOHM6催化油酸水合制备10-羟基硬脂酸在0.5ml柠檬酸-磷酸缓冲液(100mmol/L，pH 7.5)中加入终浓度为1g/L的油酸(预先溶解于DMSO中，浓度为500mM)，500U/L如实施例3所述制备的重组油酸水合酶PaOHM6粗酶液。在35℃，1000rpm振荡反应4小时。反应结束后用硫酸(20％，w/v)调节pH至2以下，加入0.5mL乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，气相色谱分析反应转化率为93.8％。
实施例6-9重组油酸水合酶PaOHM6催化油酸水合制备10-羟基硬脂酸
在10mL柠檬酸-磷酸缓冲液(100mmol/L，pH 6.5)中加入终浓度分别30-90g/L的底物油酸，加入2g/L的吐温-80，充分混合使油酸乳化，加入适量如实施例3所述制备的重组油酸水合酶PaOHM6冻干酶粉，25℃下磁力搅拌反应。间歇取样，气相色谱分析反应转化率，至转化率不再持续增长时终止反应。反应终止时加入硫酸(20％,w/v)调节pH至2左右，反应液用10mL乙酸乙酯萃取三次，萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱分析测定反应转化率。结果见表2，油酸浓度为90g/L，催化剂上载量为5kU/L时，反应4h，转化率高于95％。
表2.油酸水合酶PaOHM6催化油酸水合反应的结果
实施例10重组油酸水合酶PaOHM6催化油酸水合制备10-羟基硬脂酸
在1L柠檬酸-磷酸缓冲液(100mmol/L，pH 6.5)中加入90g油酸，2g吐温-80，充分搅拌使油酸乳化，加入5kU如实施例3所述制备的重组油酸水合酶PaOHM6冻干酶粉。反应在25℃、200rpm机械搅拌下进行，反应4小时，气相色谱分析转化率为96.2％，时空产率达553g/L/d。反应结束后加入硫酸(20％,w/v)，将反应液pH调节至2左右，用等体积乙酸乙酯萃取五次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，然后再加入1L甲醇，加热至回流，搅拌1h，冷却，抽滤，滤饼干燥，得到产品78.1g，纯度为99.1％。
实施例11 10-羟基硬脂酸脱氢酶MlADH的制备
依据如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，根据大肠杆菌中的密码子偏好性，设计优化的核酸密码子序列，如SEQ ID No.3所示，并进行人工合成，将合成的序列连接到pET-28a质粒中，转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，构建重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-MlADH。
将所述重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-MlADH接种到装有4mLLB培养基(含终浓度为50μg/mL的卡那霉素)的试管中，37℃、180rpm振摇培养，至OD600达到0.6时，按1％的接种量接种至100mL的LB培养基(含终浓度为50μg/mL的卡那霉素)中，在37℃、180rpm摇床上振摇培养至菌液的OD600约为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.2mM，在16℃、180rpm摇床上继续培养20h。离心收集细胞，生理盐水洗涤两次后，用10mL的柠檬酸-磷酸缓冲液(10mM，pH 8.0)重悬。将重悬菌液放在冰水混合物上，用超声破碎仪进行破碎，功率400瓦，工作时间4s，间隔时间6s，共99个循环。破碎结束后16,200×g，4℃离心20min，获得粗酶液，对粗酶液冷冻干燥，得到冻干酶粉，活力为20.1U/mg。
MlDH在催化10-羟基硬脂酸氧化的过程中同时催化NAD+还原生成NADH，所以采用分光光度法测定340nm处的吸光度的变化来测定酶活。所述MlADH的活力测定方法为：1mL比色皿中加入970μL的柠檬酸-磷酸缓冲液(100mM，pH 8.0)，10μL的底物10-羟基硬脂酸(10mM，溶解于DMSO)，0.1mM的NAD+，以及10μL适当稀释的酶液。混匀后，在分光光度计上，30℃、340nm条件下，记录1min内吸光值的变化ΔA，用下式计算得到酶活力：
酶活力(U)＝EW×V×103/(6220×l)
式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为mL；6220为NADH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位(U)定义为上述条件下每分钟催化1μmol NAD+还原生成NADH所需的酶量。
实施例12 10-羟基硬脂酸脱氢酶MlADH催化制备10-羰基硬脂酸
在100mL柠檬酸-磷酸缓冲液(100mmol/L，pH 7.5)中加入1g/L的如实施例10所述制备的10-羟基硬脂酸，2g/L吐温-80，5g/L的丙酮酸钠，终浓度0.2mM的NAD+，100U/L如实施例11所述制备的10-羟基硬脂酸脱氢酶MlADH冻干酶粉以及100U/L乳酸脱氢酶。在15℃，200rpm机械搅拌反应4小时，气相色谱分析反应转化率高于99.5％。
转化率分析过程为：取样500μL，加入50μL硫酸(20％,w/v)终止反应，再加入等体积的乙酸乙酯振荡萃取，14,000rpm离心2min。将萃取有机相转移到新的EP管中，加入适量无水硫酸钠干燥过夜。取5μL干燥后的萃取有机相加入到气相分析瓶的内衬管中，再加入85μL吡啶和10μL的BSTFA，在烘箱中保温15min。通过气相色谱分析检测底物和产物的含量，计算反应的转化率。所述气相色谱分析条件如下：色谱柱为HP-5MS，进样口和氢火焰检测器的温度都为280℃，初始柱温为180℃，4℃/min升至250℃。样品进样量为1μL，分流比为25:1，恒压模式控制。10-羟基硬脂酸的保留时间为13.9min，10-羰基硬脂酸的保留时间为18.1min。
实施例13 10-羟基硬脂酸脱氢酶MlADH催化制备10-羰基硬脂酸
在100mL柠檬酸-磷酸缓冲液(100mmol/L，pH 9.0)中加入10g/L的如实施例10所述制备的10-羟基硬脂酸，2g/L吐温-80，5g/L的丙酮酸钠，终浓度0.2mM的NAD+，1000U/L如实施例11所述制备的10-羟基硬脂酸脱氢酶MlADH冻干酶粉以及1000U/L乳酸脱氢酶LDH。在35℃，200rpm机械搅拌反应2小时，气相色谱分析反应转化率为98.3％。
实施例14重组PaOHM6与MlADH级联催化油酸转化生成10-羰基硬脂酸
在1L柠檬酸-磷酸缓冲液(100mmol/L，pH 6.5)中加入90g油酸，2g吐温-80，充分搅拌使油酸乳化，加入5kU如实施例3所述制备的重组油酸水合酶PaOHM6冻干酶粉。反应在25℃、200rpm机械搅拌下进行，反应4小时；然后加入42.4g丙酮酸钠，加入NaOH溶液，将反应液pH调节到8.0，再加入终浓度0.2mM的NAD+，10kU如实施例111所述制备的10-羟基硬脂酸脱氢酶MlADH冻干酶粉以及10kU乳酸脱氢酶，在25℃，200rpm继续机械搅拌反应2小时，气相色谱分析最终反应转化率为95.8％，时空产率达364g/L/d。
反应结束后加入硫酸(20％,w/v)，将反应液pH调节至2左右，用等体积乙酸乙酯萃取五次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，然后再加入1L甲醇，加热至回流，搅拌1h，冷却，抽滤，滤饼干燥，得到产品74.2g，纯度为99.0％。
实施例4说明了重组油酸水合酶PaOH在10-羟基/羰基硬脂酸合成中的应用，以上实施例5-14以重组油酸水合酶PaOHM6为例说明了其在10-羟基/羰基硬脂酸合成中的应用，而本领域技术人员显然知道其他的重组油酸水合酶同样能够实现在10-羟基/羰基硬脂酸合成中的应用。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华东理工大学；苏州百福安酶技术有限公司
<120> 油酸水合酶及其在10-羟基硬脂酸与10-羰基硬脂酸合成中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1965
<212> DNA
<213> 嗜氨副球菌(Paracoccus aminophilus)
<400> 1
atgagcccca agacctccaa acccttccac gtcgagaacg acacgaccgc cggatattgg 60
tcaaatcgac cagaaaatac cctgcctgtg cccgatatga tgggcgctta tatgcgcaac 120
cacccctatc ccggcaacca ggtcgagggt cgcaaggcct ggatcattgg cagcggtatc 180
gccgggctgg cagcggcgtt ctacctgatc cgtgatggcg ggatgaaagg gcaagacatc 240
accattctgg atgcgctgga tgtcacgggc ggctcgctcg acggggctgg caatcccgag 300
gatggctata tcatccgcgg cggccgcgag atgaacttta attacgacaa cctttgggac 360
atgttccagg acgtgcaggc gctggagctg cccgagggct acagcgtgct cgacgagtat 420
cgccaactga acgatgccga tcccaactgg tcaaagtctc ggctgatgca caatcagggc 480
gagattcgcg atttctcaac cttcggcctg accaagccgc agcaatggga gctgatccgc 540
ctgctcttga agcgcaaaga ggatctcgat gatctgacca tcgaggatta tttcagcccc 600
ggcttcctgc agtcgaactt ttggttcctg tggcgctcga tgttcgcctt tgagaactgg 660
cagagcttgc tggagatgaa gctttatacc caccgctttc tcgattccat cgacgggttt 720
gcggatatgt cctgcctcgt tttcccgaag tataatcagc atgatacctt cgttaagccg 780
ctggtcgacc acctaaagaa gctcggcgtt caggtccagt tcgcgacccg tgtctctgat 840
ttggaaatga ccgaagacgc aggcaagcgc agtgtgacgg gcattctggc cagcgtgaac 900
ggtcaggaac accgcatccc agtcgatgaa aaggatgtgg tctttgcgct gaccggctcg 960
atgaccgagg gcaccgccta tggcgatatg gatcatgccc ccgtgatgga gcgcgggcgc 1020
tcggatccgg gaccagacag tgattgggct ttgtggcaaa acctcgccgc gaaatcgccg 1080
atctttggca atcccaagaa gttctatggc gatatcgaca agtcgatgtg ggaatccggc 1140
acgctgacgt gcaagccctc gcccctgact gaccggctga cagagctgtc ggtcaacgac 1200
ccctattccg gcaagaccgt gaccggcggc atcattacct tcaccgactc gaattgggtg 1260
atgagcgtga cctgtaaccg ccagccgcat ttcctcggcc agcccaagga tgttctggtg 1320
ctctgggtct atgcgctgct gatggacaag gatggcaaca aggtcaaaaa gcccatgccc 1380
gcctgcaccg ggcgcgagat tttggccgag ctgtgccatc atttgggcat tcccgacgat 1440
caattcgagg ccgtcgccgc gaagaccaag gtacggttgg cgttgatgcc ctatattacc 1500
tcgatgttca tgccgcgtgc caaaggtgac cgtccccatg tcgtgcccga gggctgcacg 1560
aacctcgcgc tgatgggcca gttcgtcgag acggcgaatg atatcgtctt caccatggat 1620
agctcgatcc gcacggcgcg cattggcgtc tatacgctgt tggggctgcg caagcaggtg 1680
cccgatatca gcccggtgca atatgatatc cgcaccttga tcaaggccgc ccgcacggtg 1740
aacaacaacc agcccttccc gggtgaacgc ctgctgcatc gtctcttggg aaagacctac 1800
tatgcccata tcctgccgcc gctgcccgat cgcacccaaa ccacccgcga cgctgccgag 1860
accgaactga aggcgtttct cggtactggc ggcactgctc tggcggccgt gggcggttgg 1920
ctgcaaaggg ttcgcgagga cctcaaagag aggacccgca agtga 1965
<210> 2
<211> 654
<212> PRT
<213> 嗜氨副球菌(Paracoccus aminophilus)
<400> 2
Met Ser Pro Lys Thr Ser Lys Pro Phe His Val Glu Asn Asp Thr Thr
1 5 10 15
Ala Gly Tyr Trp Ser Asn Arg Pro Glu Asn Thr Leu Pro Val Pro Asp
20 25 30
Met Met Gly Ala Tyr Met Arg Asn His Pro Tyr Pro Gly Asn Gln Val
35 40 45
Glu Gly Arg Lys Ala Trp Ile Ile Gly Ser Gly Ile Ala Gly Leu Ala
50 55 60
Ala Ala Phe Tyr Leu Ile Arg Asp Gly Gly Met Lys Gly Gln Asp Ile
65 70 75 80
Thr Ile Leu Asp Ala Leu Asp Val Thr Gly Gly Ser Leu Asp Gly Ala
85 90 95
Gly Asn Pro Glu Asp Gly Tyr Ile Ile Arg Gly Gly Arg Glu Met Asn
100 105 110
Phe Asn Tyr Asp Asn Leu Trp Asp Met Phe Gln Asp Val Gln Ala Leu
115 120 125
Glu Leu Pro Glu Gly Tyr Ser Val Leu Asp Glu Tyr Arg Gln Leu Asn
130 135 140
Asp Ala Asp Pro Asn Trp Ser Lys Ser Arg Leu Met His Asn Gln Gly
145 150 155 160
Glu Ile Arg Asp Phe Ser Thr Phe Gly Leu Thr Lys Pro Gln Gln Trp
165 170 175
Glu Leu Ile Arg Leu Leu Leu Lys Arg Lys Glu Asp Leu Asp Asp Leu
180 185 190
Thr Ile Glu Asp Tyr Phe Ser Pro Gly Phe Leu Gln Ser Asn Phe Trp
195 200 205
Phe Leu Trp Arg Ser Met Phe Ala Phe Glu Asn Trp Gln Ser Leu Leu
210 215 220
Glu Met Lys Leu Tyr Thr His Arg Phe Leu Asp Ser Ile Asp Gly Phe
225 230 235 240
Ala Asp Met Ser Cys Leu Val Phe Pro Lys Tyr Asn Gln His Asp Thr
245 250 255
Phe Val Lys Pro Leu Val Asp His Leu Lys Lys Leu Gly Val Gln Val
260 265 270
Gln Phe Ala Thr Arg Val Ser Asp Leu Glu Met Thr Glu Asp Ala Gly
275 280 285
Lys Arg Ser Val Thr Gly Ile Leu Ala Ser Val Asn Gly Gln Glu His
290 295 300
Arg Ile Pro Val Asp Glu Lys Asp Val Val Phe Ala Leu Thr Gly Ser
305 310 315 320
Met Thr Glu Gly Thr Ala Tyr Gly Asp Met Asp His Ala Pro Val Met
325 330 335
Glu Arg Gly Arg Ser Asp Pro Gly Pro Asp Ser Asp Trp Ala Leu Trp
340 345 350
Gln Asn Leu Ala Ala Lys Ser Pro Ile Phe Gly Asn Pro Lys Lys Phe
355 360 365
Tyr Gly Asp Ile Asp Lys Ser Met Trp Glu Ser Gly Thr Leu Thr Cys
370 375 380
Lys Pro Ser Pro Leu Thr Asp Arg Leu Thr Glu Leu Ser Val Asn Asp
385 390 395 400
Pro Tyr Ser Gly Lys Thr Val Thr Gly Gly Ile Ile Thr Phe Thr Asp
405 410 415
Ser Asn Trp Val Met Ser Val Thr Cys Asn Arg Gln Pro His Phe Leu
420 425 430
Gly Gln Pro Lys Asp Val Leu Val Leu Trp Val Tyr Ala Leu Leu Met
435 440 445
Asp Lys Asp Gly Asn Lys Val Lys Lys Pro Met Pro Ala Cys Thr Gly
450 455 460
Arg Glu Ile Leu Ala Glu Leu Cys His His Leu Gly Ile Pro Asp Asp
465 470 475 480
Gln Phe Glu Ala Val Ala Ala Lys Thr Lys Val Arg Leu Ala Leu Met
485 490 495
Pro Tyr Ile Thr Ser Met Phe Met Pro Arg Ala Lys Gly Asp Arg Pro
500 505 510
His Val Val Pro Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ala Leu Met Gly Gln Phe
515 520 525
Val Glu Thr Ala Asn Asp Ile Val Phe Thr Met Asp Ser Ser Ile Arg
530 535 540
Thr Ala Arg Ile Gly Val Tyr Thr Leu Leu Gly Leu Arg Lys Gln Val
545 550 555 560
Pro Asp Ile Ser Pro Val Gln Tyr Asp Ile Arg Thr Leu Ile Lys Ala
565 570 575
Ala Arg Thr Val Asn Asn Asn Gln Pro Phe Pro Gly Glu Arg Leu Leu
580 585 590
His Arg Leu Leu Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala His Ile Leu Pro Pro Leu
595 600 605
Pro Asp Arg Thr Gln Thr Thr Arg Asp Ala Ala Glu Thr Glu Leu Lys
610 615 620
Ala Phe Leu Gly Thr Gly Gly Thr Ala Leu Ala Ala Val Gly Gly Trp
625 630 635 640
Leu Gln Arg Val Arg Glu Asp Leu Lys Glu Arg Thr Arg Lys
645 650
<210> 3
<211> 933
<212> DNA
<213> 藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)
<400> 3
atgtccgagt tcacccgttt cgagcaggtc accgtgctgg gcaccggtgt gctgggttcg 60
cagatcatca tgcaggccgc ctaccacggc aagaaggtca tggcgtacga cgccgtcccc 120
gccgccctcg agaacctcga caagcgctgg gcgtggatcc gccagggcta cgaggccgac 180
ctgggcgagg gctacgacgc cgcccgcttc gacgaggcca tcgcccgcat caccccgacg 240
tcggacctgg ccgaggcggt ggcggacgcg gacatcgtga tcgaggccgt cccggagaac 300
ctggagctca agcgcaaggt gtgggcccag gtgggtgagc tcgcccccgc cacgaccctg 360
ttcgccacga acacctcctc cctgctgccc tcggacttcg ccgacgccag cggccatccg 420
gagcgcttcc tggccctgca ctacgccaac cgcatctggg cgcagaacac cgccgaggtc 480
atgggcaccg ccgccacctc gccggaggcc gtcgcgggag ccctgcagtt cgccgaggag 540
accggcatgg tccccgtgca cgtgcgcaag gagatcccgg gctacttcct caactccctg 600
ctcatcccgt ggctgcaggc cggctccaag ctgtacatgc acggagtggg caacccggcg 660
gacatcgacc gcacctggcg cgtggccacc ggtaacgagc gcggcccgtt ccagacctat 720
gacatcgtgg gcttccacgt ggccgccaac gtctcccgca acacgggcgt cgactggcag 780
ctcggcttcg ctgagatgct cgagaagagc atcgccgagg gccacagcgg cgtggccgac 840
ggccaggggt tctaccgata cggccccgac ggggagaacc tgggcccggt cgaggactgg 900
aacctgggcg acaaggacac cccgctcggc tga 933
<210> 4
<211> 310
<212> PRT
<213> 藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)
<400> 4
Met Ser Glu Phe Thr Arg Phe Glu Gln Val Thr Val Leu Gly Thr Gly
1 5 10 15
Val Leu Gly Ser Gln Ile Ile Met Gln Ala Ala Tyr His Gly Lys Lys
20 25 30
Val Met Ala Tyr Asp Ala Val Pro Ala Ala Leu Glu Asn Leu Asp Lys
35 40 45
Arg Trp Ala Trp Ile Arg Gln Gly Tyr Glu Ala Asp Leu Gly Glu Gly
50 55 60
Tyr Asp Ala Ala Arg Phe Asp Glu Ala Ile Ala Arg Ile Thr Pro Thr
65 70 75 80
Ser Asp Leu Ala Glu Ala Val Ala Asp Ala Asp Ile Val Ile Glu Ala
85 90 95
Val Pro Glu Asn Leu Glu Leu Lys Arg Lys Val Trp Ala Gln Val Gly
100 105 110
Glu Leu Ala Pro Ala Thr Thr Leu Phe Ala Thr Asn Thr Ser Ser Leu
115 120 125
Leu Pro Ser Asp Phe Ala Asp Ala Ser Gly His Pro Glu Arg Phe Leu
130 135 140
Ala Leu His Tyr Ala Asn Arg Ile Trp Ala Gln Asn Thr Ala Glu Val
145 150 155 160
Met Gly Thr Ala Ala Thr Ser Pro Glu Ala Val Ala Gly Ala Leu Gln
165 170 175
Phe Ala Glu Glu Thr Gly Met Val Pro Val His Val Arg Lys Glu Ile
180 185 190
Pro Gly Tyr Phe Leu Asn Ser Leu Leu Ile Pro Trp Leu Gln Ala Gly
195 200 205
Ser Lys Leu Tyr Met His Gly Val Gly Asn Pro Ala Asp Ile Asp Arg
210 215 220
Thr Trp Arg Val Ala Thr Gly Asn Glu Arg Gly Pro Phe Gln Thr Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Val Gly Phe His Val Ala Ala Asn Val Ser Arg Asn Thr Gly
245 250 255
Val Asp Trp Gln Leu Gly Phe Ala Glu Met Leu Glu Lys Ser Ile Ala
260 265 270
Glu Gly His Ser Gly Val Ala Asp Gly Gln Gly Phe Tyr Arg Tyr Gly
275 280 285
Pro Asp Gly Glu Asn Leu Gly Pro Val Glu Asp Trp Asn Leu Gly Asp
290 295 300
Lys Asp Thr Pro Leu Gly
305 310

Claims (10)

1.一种油酸水合酶，其特征在于，其是由下述氨基酸序列组成的蛋白质：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第254位组氨酸替换为酪氨酸；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；
(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第22位天冬酰胺替换为丝氨酸；
(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第60位异亮氨酸替换为天冬酰胺；
(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第300位天冬酰胺替换为天冬氨酸，第632位苏氨酸替换为异亮氨酸；
(13)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第129位谷氨酸替换为甘氨酸，第368位苯丙氨酸替换为丝氨酸，第626位苯丙氨酸替换为苏氨酸；
(14)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第40位天冬酰胺替换为酪氨酸，第316位丙氨酸替换为苏氨酸，第356位丙氨酸替换为苏氨酸。
2.一种核酸，其特征在于，编码如权利要求1所述的油酸水合酶。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的核酸。
4.一种重组表达转化体，其特征在于，包含如权利要求3所述的重组表达载体。
5.如权利要求1所述油酸水合酶的制备方法，其特征在于，培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离重组表达的油酸水合酶。
6.一种油酸水合酶的应用，其特征在于，所述油酸水合酶作为催化剂，催化底物油酸的水合反应制备10-羟基硬脂酸；
所述油酸水合酶是由下述氨基酸序列组成的蛋白质，
(1)如SEQ ID No.2所示氨基酸序列；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第254位组氨酸替换为酪氨酸；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸；
(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；
(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；
(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第22位天冬酰胺替换为丝氨酸；
(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第60位异亮氨酸替换为天冬酰胺；
(13)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第300位天冬酰胺替换为天冬氨酸，第632位苏氨酸替换为异亮氨酸；
(14)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第129位谷氨酸替换为甘氨酸，第368位苯丙氨酸替换为丝氨酸，第626位苯丙氨酸替换为苏氨酸；
(15)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第40位天冬酰胺替换为酪氨酸，第316位丙氨酸替换为苏氨酸，第356位丙氨酸替换为苏氨酸。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，使用10-羟基硬脂酸脱氢酶催化如权利要求6所得10-羟基硬脂酸氧化生成10-羰基硬脂酸。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，
所述油酸水合酶作为催化剂，催化底物油酸水合制备10-羟基硬脂酸的反应结束后，采用常规方法将产物10-羟基硬脂酸提取出来，然后再使用10-羟基硬脂酸脱氢酶催化10-羟基硬脂酸氧化生成10-羰基硬脂酸，或，
所述油酸水合酶作为催化剂，催化底物油酸水合制备10-羟基硬脂酸的反应结束后，调节反应液pH，然后加入所述10-羟基硬脂酸脱氢酶，催化10-羟基硬脂酸氧化生成10-羰基硬脂酸。
9.根据权利要求7或8所述应用，其特征在于，10-羟基硬脂酸脱氢酶催化10-羟基硬脂酸氧化生成10-羰基硬脂酸的反应需要辅酶NAD+的参与，反应过程中辅酶NAD+被还原为NADH，
进一步地，可以通过与乳酸脱氢酶催化的丙酮酸还原反应进行反应耦联，以丙酮酸作为辅底物，实现辅酶NAD+的原位再生。
10.根据权利要求7或8所述应用，其特征在于，
所述油酸水合酶作为催化剂，催化底物油酸的水合反应制备10-羟基硬脂酸反应过程中，底物油酸的浓度为1-90g/L，反应温度为15-35℃，反应pH为6.0-7.5，
使用10-羟基硬脂酸脱氢酶催化10-羟基硬脂酸氧化生成10-羰基硬脂酸的反应pH为7.5-9.0。
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