CN110241095B - 一种cyp119酶及其突变体和用途 - Google Patents

一种cyp119酶及其突变体和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种CYP119酶及其突变体和用途。本发明提供的CYP119酶的突变体为T213G+F153G，本发明提供的CYP119酶及其突变体在常温下能高效催化硫醚类底物氧化为亚砜和砜，并且在反应体系中加入正辛酸，突变体酶催化苯甲硫醚氧化反应的催化能力较野生型提高2.38倍；本发明还发现突变酶能提高反应的化学选择性，即增加亚砜的生成减少砜的生成。本发明提供了CYP119酶的新用途，也提供了CYP119酶的突变体在提高硫醚类氧化反应催化能力及提高反应的化学选择性的新用途，能够取得优异的经济效益，应用前景广阔。

Description

一种CYP119酶及其突变体和用途
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种CYP119酶及其突变体和用途。
背景技术
CYP119酶(cytochrome P450 119)来自黄石公园火山口分离的嗜酸嗜热硫矿硫叶菌(Sulfolobus solfataricus)，因此该酶具耐酸抗高温等作用。目前文献报道CYP119酶在过氧化氢或假单孢氧还蛋白-还原酶(Pd/PdR)和辅酶NADPH条件下能催化月桂酸羟基化和苯乙烯及其类似底物的环氧化反应，该反应绿色环保具有较高应用前景。由于该酶的天然底物未能确定，因此，利用苯乙烯作为CYP119酶的底物进行环氧化反应时，其催化效率较低。Zhang等研究小组，对该酶进行一系列突变，能提高其对苯乙烯及其类似底物的催化效率。
现有的CYP119酶及其突变体没有报道能催化硫醚类底物。硫醚类底物的氧化产物，是许多药物的重要的中间体，通过化学法合成这类产物，具有反应条件苛刻且环境污染严重等缺点，通过酶催化获得这类产物均能克服这些缺点，具有重要的应用前景。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种有效的催化苯甲硫醚及苯乙硫醚的CYP119酶的催化体系及方法。
本发明的第二个目的在于提供能高效催化苯甲硫醚及苯乙硫醚的CYP119酶突变体的应用。
为达到以上目的，本发明的发明人筛选了野生型酶CYP119催化硫醚及苯乙硫醚的反应条件，并对该条件进行优化。同时，对蛋白序列以及蛋白构象和酶活性中心的特点进行了研究，通过分子动力学和分子对接方式，理性设计CYP119酶突变体，开发了一种新的CYP119酶突变体。
具体地，本发明提供了CYP119酶的新用途，即CYP119酶在催化硫醚类底物氧化反应中的应用，所述CYP119酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述CYP119酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明以野生型CYP119酶的氨基酸序列为参考序列表示以目前本领域已经公知的野生型CYP119酶的氨基酸序列中氨基酸的种类和排列方式为参考。
所述硫醚类底物包括但不限于苯甲硫醚、苯乙硫醚、苯甲亚砜、苯乙亚砜。
本发明经过条件摸索、筛选和优化，发现CYP119酶在催化硫醚类底物氧化反应时pH值为4.5-8.5，反应温度为35℃，反应在供氧剂TBHP(叔丁基过氧化氢)存在下进行。
优选地，CYP119酶在催化硫醚类底物氧化反应时pH值为7.5。
进一步地，上述新用途中，供氧剂TBHP与硫醚类底物的摩尔浓度比为1:10。
优选地，上述新用途中，硫醚类底物与CYP119酶用量的摩尔浓度比为1000:7，供氧剂TBHP与硫醚类底物的摩尔浓度比为1:10。
本发明还提供了一种CYP119酶的突变体，所述突变体为氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示CYP119酶的突变位点为T213G和F153G。为方便描述，本发明所述的CYP119酶的突变体简述为T213G+F153G。
本领域技术人员可以理解的是，对以上述所列举的2个突变位点为基础的，其他位点的氨基酸进行的没有影响所述CYP119酶突变体功能的其他突变所获得的突变体均应属于本发明的保护范围。
优选地，本发明所述突变体T213G+F153G为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示CYP119酶中含有以下突变位点：T213G和F153G。具有该两个突变位点的CYP119酶突变体具有最佳催化效率提高效果。
所述T213G代表以SIQ ID NO.2所示的氨基酸序列为参考序列，第213位氨基酸处存在一个突变，突变的形式为由苏氨酸T突变为甘氨酸G。
所述F153G代表以SIQ ID NO.2所示的氨基酸序列为参考序列，第153位氨基酸处存在一个突变，突变的形式为由苯丙氨酸F突变为甘氨酸G。
本发明的CYP119酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明优选的CYP119酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。值得注意的是，由于密码子具有简并性，因此能够编码本发明所述CYP119酶突变体的核苷酸序列均属于本发明的保护范围。
本发明还提供了所述基因的表达单元、重组载体或表达系统。
其中，所述表达单元为可以用于基因表达CYP119酶突变体的DNA序列、RNA序列等。
其中，所述重组载体为携带有所述CYP119酶突变体的编码核苷酸序列的用于保存、携带或者在目的生物中表达所述CYP119酶突变体酶的基因的核苷酸序列。
其中，所述表达系统可以为用于表达所述CYP119酶突变体蛋白的宿主细胞或生物体，所述宿主细胞优选为微生物细胞。
本发明的一个方面还提供了所述CYP119酶突变体的应用。所述应用包括CYP119酶突变体在催化月桂酸羟基化反应、苯乙烯及苯乙烯类似物的环氧化反应、硫醚类底物的氧化反应的应用。
所述硫醚类底物包括但不限于：苯甲硫醚、苯乙硫醚、苯甲亚砜、苯乙亚砜。
上述硫醚类底物均不是野生型CYP119酶的常规已知催化底物。
在所述应用中，酶催化的底物为苯甲硫醚、苯乙硫醚、苯甲亚砜、苯乙亚砜，酶的最适pH范围为4.5-8.5，反应温度为35℃，反应在供氧剂TBHP存在下进行。
本发明还提供了所述的酶在催化硫醚类底物环氧化反应、增加亚砜生成，减少砜生成中的应用。反应中加入辛酸后提高了反应物的产率及反应的化学选择性，使得酶反应后生成单一的产物，减少了后期分离纯化的工作，简化了工作，降低了人力、物力和时间成本。
本发明突变体在催化硫醚类底物氧化反应体系中，一个关键的条件是本发明发现在反应体系中加入正辛酸能够顺利实现酶催化苯甲硫醚底物，提高产率及化学选择性。
本发明还发现，在CYP119酶野生型进行反应的体系中，加入正辛酸后，产率变化不明显，但化学选择性有明显提高，见表4。
优选的，当本发明所述的CYP119酶的突变体催化底物为苯甲硫醚、苯乙硫醚时，酶的最适pH范围为7.5，加入正辛酸，反应温度为35℃，反应在供氧剂TBHP存在下进行。
特别优选的，在本发明所提供的方法中，相对于2mmol·L-1的所述催化底物，酶的用量为7μmol·.L-1，在正辛酸浓度为20mmol·L-1，供氧剂TBHP与酶催化底物的摩尔浓度比为1:10。
本领域此前没有关于CYP119酶及其突变体对硫醚类底物的催化反应的相关报道，本发明的发明人通过研究发现，本发明所提供的CYP119酶及其突变体能够适用于上述底物的环氧化反应，并能取得较好的酶促反应效果。极大的扩展了CYP119酶的应用范围。
本发明提供的CYP119酶突变体催化效率更高。在常温下，在正辛酸作用下，突变体酶催化苯甲硫醚氧化反应的催化能力较野生型能够提高2.38倍。此外，本发明所提供的酶突变体还能催化除以往文献报道的底物外的硫醚类底物发生氧化。可见本发明所提供的CYP119突变体不但极大的提高了CYP119酶的催化反应效果也在很大程度上扩展了酶的应用范围，能够取得优异的经济效益，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1A-图1E分别为CYP119野生型酶催化苯甲硫醚氧化反应的GC检测结果图。图1A，底物苯甲硫醚进样；图1B，苯甲亚砜进样；图1C，苯甲基砜进样；图1D，苯乙酮进样；图1E,反应温度为35℃，底物浓度2mmol·L-1，TBHP 20mmol·L-1,酶浓度7μmol·L-1，pH＝7.5，反应时间1h，CYP119野生型酶催化苯甲硫醚氧化反应。
图2A-图2B为CYP119突变酶T213G+F153G在正辛酸作用下催化苯甲硫醚氧化反应的GC检测结果。图2A，正辛酸进样；图2B，CYP119突变酶催化苯甲硫醚氧化反应。
图3A为CYP119野生型催化苯甲硫醚的米氏方程；图3B为突变体酶T213G+F153G在正辛酸条件下催化苯甲硫醚的米氏方程。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 CYP119突变酶的构建及其表达
1、CYP119酶的突变体的构建：根据pET30a-CYP119载体，利用QuickchangeLighting Site-directed Mutagenesis Kit(Agilent Techologies)进行点突变。将PCR产物进行双酶切并连接到pET30a载体上，构建pET30a-CYP119突变质粒。将该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS。挑选阳性克隆并测序验证突变质粒的正确性。
2、野生型及T213G+F1533G突变体的表达：阳性质粒，接种于2mL双抗LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。取100μL过夜培养的菌液于50mL双抗的TB培养基。加入250μL/LTrace Element，37℃，震荡培养至OD 0.6。加入0.4mmol·L-1IPTG，32℃，诱导24h。12000rpm，4℃离心10min，弃上清，加入1mL pH7.4，50mmol·L-1PBS溶液充分悬浮菌体(此步骤仅将离心后获得有红色菌体沉淀的样品用于下一步纯化操作)。将样品置于冰水上，超声破胞，50％功率，3s-3s，20min分两次破完。破胞后在55℃水浴中加热15min，12000rpm，4℃，离心40min，取上清液即为粗酶液。
3、CYP119野生型及突变体酶T213G+F153G的纯化及筛选：采用Ni-NTA柱，利用10-80mmol.L-1咪唑梯度浓度对粗酶液进行梯度洗脱，最后利用150mmol·L-1咪唑洗脱目的蛋白。将收集的洗脱液用
Figure BDA0002085353670000062
Ultra-15 30K浓缩至200μL左右，酶液呈现鲜红色或红黑色，-80℃保存。
实施例2 CYP119野生型及突变酶催化苯甲硫醚氧化反应条件的筛选
本实施例针对TBHP的浓度进行筛选，筛选条件见表1。
表1 CYP119野生型酶在35℃、pH7.5条件下，在不同TBHP浓度下催化苯甲硫醚反应结果
Figure BDA0002085353670000061
本实施例针对供养剂TBHP的浓度进行摸索，最终确定了最优化的条件即：TBHP量为底物浓度的10倍(本实施例中底物浓度为2mmol·L-1)，35℃，pH值为7.5。CYP119野生型酶催化苯甲硫醚氧化反应的GC检测结果图见图1A-1E。
实施例3 CYP119野生型酶分别催化苯甲硫醚氧化反应、苯乙硫醚的效果验证
反应条件：温度35℃，底物苯甲硫醚2mmol·L-1，酶7μmol·L-1。反应缓冲体系为50mmol·L-1bis-Tris buffer，pH 7.5，总体系200μL。在35℃下预热10min后加入TBHP(20mmol·L-1)起始反应。见图1A-1E。
1小时后，用200μL CH2Cl2淬灭反应，加入1.5μL 0.25moL的苯乙酮，并萃取三次。用GC检测底物的转化率。GC-MS的检测条件：Thermo Scientific ITQ900,DB-1MS柱(30m×0.25mm)，90℃2min；90-210℃，10℃/min升高至210℃；210℃保持1min。在该条件下获得野生型CYP119酶催化苯甲硫醚氧化为苯甲基亚砜和苯甲基砜，其产率分别为苯甲基亚砜59.3％和苯甲基砜30.3％。
采用上述相同的方法利用野生型酶CYP119催化苯乙硫醚，获得乙基苯基亚砜和乙基苯基砜的产率分别为：71.64％，14.28％。
实施例4 CYP119酶突变体T213G+F153G催化硫醚类底物的方法建立
反应条件为：温度为35℃，底物苯甲硫醚2mmol·L-1，分别加入各种酸20mmol·L-1(乙酸、正庚酸、正辛酸、3-苯丙酸、4-苯丁酸)、酶7μmol·L-1。反应缓冲体系为50mmol·L- 1bis-Tris buffer，pH 7.5，总体系200μL。在35℃下预热10min后加入TBHP(20mmol·L-1)起始反应。
1小时后，用200μL CH2Cl2淬灭反应，加入1.5μL 0.25moL的苯乙酮，并萃取三次。用GC检测底物的转化率。GC-MS的检测条件：Thermo Scientific ITQ900,DB-1MS柱(30m×0.25mm)，90℃2min；90-210℃，10℃/min升高至210℃；210℃保持1min。在该条件下获得突变酶催化苯甲硫醚和苯乙硫醚氧化结果见表2，3。CYP119突变酶T213G+F153G在正辛酸作用下催化苯甲硫醚氧化反应的GC检测结果图见2A-图2B。
本实施例比较T213G+F153G突变体添加不同酸的催化苯甲硫醚和苯乙硫醚底物的产率结果见表2-表4。
表2突变体酶T213G+F153G催化苯甲硫醚
序号 有机酸 亚砜产率(％) 砜的产率(％)
1 不加酸 75.11 11.26
2 乙酸 66.07 22.35
3 正庚酸 80.38 18.61
4 正辛酸 90.03 9.40
5 3-苯丙酸 68.96 15.82
6 4-苯丁酸 59.29 13.30
表3突变体酶T213G+F153G催化苯乙硫醚
序号 有机酸 亚砜产率(％) 砜的产率(％)
1 不加酸 81.30 8.80
2 乙酸 67.79 16.48
3 正庚酸 66.86 13.83
4 正辛酸 80.16 8.97
5 3-苯丙酸 60.59 17.03
6 4-苯丁酸 67.11 19.62
表4野生型酶催化苯甲硫醚
序号 有机酸 亚砜产率(％) 砜的产率(％)
1 不加酸 59.25 30.26
2 乙酸 45.45 49.43
3 正庚酸 53.58 28.94
4 正辛酸 79.13 15.40
5 3-苯丙酸 47.79 37.92
6 4-苯丁酸 47.25 40.88
上述对比实验结果说明，正辛酸的加入提高了突变酶催化苯甲硫醚底物的产率，但是在催化苯乙硫醚底物中不明显，见表2、表3。
表4的结果说明在CYP119酶野生型进行反应的体系中，加入正辛酸后，产率变化不明显，但化学选择性有明显提高。
实施例5 CYP119酶突变体T213G+F153G分别催化苯甲硫醚、苯乙硫醚氧化反应的效果验证
实施例1得到的CYP119酶突变体T213G+F153G在催化苯甲硫醚时，在反应体系中加入终浓度为20mmol·L-1正辛酸，其余条件参照实施例3的反应条件，能获得苯甲基亚砜和苯甲基砜的产率分别为90.0％，9.4％。
采用上述相同的方法利用突变体T213G/F153G催化苯乙硫醚，获得乙基苯基亚砜和乙基苯基砜的产率分别为80.2％，9.0％。
实施例6 CYP119野生型酶和突变酶对底物苯甲硫醚的动力学实验
动力学实验条件：设置梯度浓度苯甲硫醚(溶解在乙腈中)，反应温度为35℃。反应缓冲体系为50mmol·L-1bis-Tris buffer,pH 7.4。总体系100μL。TBHP(浓度为底物的10倍)，(突变体酶T213G+F153G在做动力学实验时，加入辛酸，浓度与底物相同)。加入启动反应，30s后立即用200μL CH2Cl2淬灭反应，于GC检测产物。
CYP119野生型催化苯甲硫醚的米氏方程见图3A，突变体酶T213G+F153G在正辛酸条件下催化苯甲硫醚的米氏方程见图3B。根据米氏常数分析获得CYP119野生型酶的催化常数为1549.23±94.1min-1，CYP119酶突变体T213G+F153G在加入正辛酸的催化常数为3687.3±316.2min-1。较野生型酶催化苯甲硫醚效率提高了2.38倍。
表5野生型CYP119酶和突变体催化常数的比较
Figure BDA0002085353670000091
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 西南医科大学
<120> 一种CYP119酶及其突变体和用途
<130> KHP191112179.2
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtatgact ggtttagtga gatgagaaag aaagacccag tgtattatga cggaaacata 60
tggcaggtgt tttcctatag gtacacaaag gaggttttaa acaacttttc gaaattctcc 120
tcagatctta caggttacca cgaaaggctt gaggacctaa ggaacggtaa aataaggttc 180
gacatcccca ctaggtatac catgctgacc tcagatcccc ctctccatga tgagttaaga 240
tcaatgtcag cagatatatt ctcgcctcaa aagctacaga cacttgagac atttattagg 300
gagaccacca gaagcctatt agactcaatt gaccctaggg aagacgacat agtgaagaag 360
ttagctgttc cactaccaat aatagttatc tcaaaaatat tgggtctccc aattgaagat 420
aaggagaagt tcaaagagtg gtcagactta gtcgcattca ggttgggtaa gcctggagaa 480
atatttgagc taggtaagaa gtaccttgag ttaataggtt atgtgaagga tcatctaaat 540
tcagggaccg aagtggtcag cagagttgtc aactcaaacc tctcagacat agagaaactc 600
ggatacatta ttttacttct catagcgggt aatgagacta caactaactt aatatcaaac 660
tctgttattg acttcactag gtttaacctg tggcagagga taagggaaga gaacctctac 720
cttaaggcta tcgaagaggc tttaaggtat tctcctcctg tgatgaggac tgtaagaaag 780
actaaggaaa gagtgaaatt gggtgatcag actattgaag agggagagta cgttagagta 840
tggatagcct cagcaaacag ggacgaggag gtgtttcatg acggagagaa gttcatccct 900
gacaggaatc cgaacccaca cttaagcttt gggtctggaa tacatctgtg tttaggtgct 960
cctttggcta gattagaggc aagaatagca attgaggaat tttcaaaaag gtttaggcac 1020
attgagatat tggatactga aaaagttcca aatgaagtgc tgaatggtta taagagacta 1080
gtggtcaggt tgaagagtaa tgaataa 1107
<210> 2
<211> 368
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Tyr Asp Trp Phe Ser Glu Met Arg Lys Lys Asp Pro Val Tyr Tyr
1 5 10 15
Asp Gly Asn Ile Trp Gln Val Phe Ser Tyr Arg Tyr Thr Lys Glu Val
20 25 30
Leu Asn Asn Phe Ser Lys Phe Ser Ser Asp Leu Thr Gly Tyr His Glu
35 40 45
Arg Leu Glu Asp Leu Arg Asn Gly Lys Ile Arg Phe Asp Ile Pro Thr
50 55 60
Arg Tyr Thr Met Leu Thr Ser Asp Pro Pro Leu His Asp Glu Leu Arg
65 70 75 80
Ser Met Ser Ala Asp Ile Phe Ser Pro Gln Lys Leu Gln Thr Leu Glu
85 90 95
Thr Phe Ile Arg Glu Thr Thr Arg Ser Leu Leu Asp Ser Ile Asp Pro
100 105 110
Arg Glu Asp Asp Ile Val Lys Lys Leu Ala Val Pro Leu Pro Ile Ile
115 120 125
Val Ile Ser Lys Ile Leu Gly Leu Pro Ile Glu Asp Lys Glu Lys Phe
130 135 140
Lys Glu Trp Ser Asp Leu Val Ala Phe Arg Leu Gly Lys Pro Gly Glu
145 150 155 160
Ile Phe Glu Leu Gly Lys Lys Tyr Leu Glu Leu Ile Gly Tyr Val Lys
165 170 175
Asp His Leu Asn Ser Gly Thr Glu Val Val Ser Arg Val Val Asn Ser
180 185 190
Asn Leu Ser Asp Ile Glu Lys Leu Gly Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Ile
195 200 205
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210 215 220
Phe Thr Arg Phe Asn Leu Trp Gln Arg Ile Arg Glu Glu Asn Leu Tyr
225 230 235 240
Leu Lys Ala Ile Glu Glu Ala Leu Arg Tyr Ser Pro Pro Val Met Arg
245 250 255
Thr Val Arg Lys Thr Lys Glu Arg Val Lys Leu Gly Asp Gln Thr Ile
260 265 270
Glu Glu Gly Glu Tyr Val Arg Val Trp Ile Ala Ser Ala Asn Arg Asp
275 280 285
Glu Glu Val Phe His Asp Gly Glu Lys Phe Ile Pro Asp Arg Asn Pro
290 295 300
Asn Pro His Leu Ser Phe Gly Ser Gly Ile His Leu Cys Leu Gly Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Arg Ile Ala Ile Glu Glu Phe Ser Lys
325 330 335
Arg Phe Arg His Ile Glu Ile Leu Asp Thr Glu Lys Val Pro Asn Glu
340 345 350
Val Leu Asn Gly Tyr Lys Arg Leu Val Val Arg Leu Lys Ser Asn Glu
355 360 365
<210> 3
<211> 1107
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtatgact ggtttagtga gatgagaaag aaagacccag tgtattatga cggaaacata 60
tggcaggtgt tttcctatag gtacacaaag gaggttttaa acaacttttc gaaattctcc 120
tcagatctta caggttacca cgaaaggctt gaggacctaa ggaacggtaa aataaggttc 180
gacatcccca ctaggtatac catgctgacc tcagatcccc ctctccatga tgagttaaga 240
tcaatgtcag cagatatatt ctcgcctcaa aagctacaga cacttgagac atttattagg 300
gagaccacca gaagcctatt agactcaatt gaccctaggg aagacgacat agtgaagaag 360
ttagctgttc cactaccaat aatagttatc tcaaaaatat tgggtctccc aattgaagat 420
aaggagaagt tcaaagagtg gtcagactta gtcgcaggta ggttgggtaa gcctggagaa 480
atatttgagc taggtaagaa gtaccttgag ttaataggtt atgtgaagga tcatctaaat 540
tcagggaccg aagtggtcag cagagttgtc aactcaaacc tctcagacat agagaaactc 600
ggatacatta ttttacttct catagcgggt aatgagggta caactaactt aatatcaaac 660
tctgttattg acttcactag gtttaacctg tggcagagga taagggaaga gaacctctac 720
cttaaggcta tcgaagaggc tttaaggtat tctcctcctg tgatgaggac tgtaagaaag 780
actaaggaaa gagtgaaatt gggtgatcag actattgaag agggagagta cgttagagta 840
tggatagcct cagcaaacag ggacgaggag gtgtttcatg acggagagaa gttcatccct 900
gacaggaatc cgaacccaca cttaagcttt gggtctggaa tacatctgtg tttaggtgct 960
cctttggcta gattagaggc aagaatagca attgaggaat tttcaaaaag gtttaggcac 1020
attgagatat tggatactga aaaagttcca aatgaagtgc tgaatggtta taagagacta 1080
gtggtcaggt tgaagagtaa tgaataa 1107
<210> 4
<211> 368
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Tyr Asp Trp Phe Ser Glu Met Arg Lys Lys Asp Pro Val Tyr Tyr
1 5 10 15
Asp Gly Asn Ile Trp Gln Val Phe Ser Tyr Arg Tyr Thr Lys Glu Val
20 25 30
Leu Asn Asn Phe Ser Lys Phe Ser Ser Asp Leu Thr Gly Tyr His Glu
35 40 45
Arg Leu Glu Asp Leu Arg Asn Gly Lys Ile Arg Phe Asp Ile Pro Thr
50 55 60
Arg Tyr Thr Met Leu Thr Ser Asp Pro Pro Leu His Asp Glu Leu Arg
65 70 75 80
Ser Met Ser Ala Asp Ile Phe Ser Pro Gln Lys Leu Gln Thr Leu Glu
85 90 95
Thr Phe Ile Arg Glu Thr Thr Arg Ser Leu Leu Asp Ser Ile Asp Pro
100 105 110
Arg Glu Asp Asp Ile Val Lys Lys Leu Ala Val Pro Leu Pro Ile Ile
115 120 125
Val Ile Ser Lys Ile Leu Gly Leu Pro Ile Glu Asp Lys Glu Lys Phe
130 135 140
Lys Glu Trp Ser Asp Leu Val Ala Gly Arg Leu Gly Lys Pro Gly Glu
145 150 155 160
Ile Phe Glu Leu Gly Lys Lys Tyr Leu Glu Leu Ile Gly Tyr Val Lys
165 170 175
Asp His Leu Asn Ser Gly Thr Glu Val Val Ser Arg Val Val Asn Ser
180 185 190
Asn Leu Ser Asp Ile Glu Lys Leu Gly Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Ile
195 200 205
Ala Gly Asn Glu Gly Thr Thr Asn Leu Ile Ser Asn Ser Val Ile Asp
210 215 220
Phe Thr Arg Phe Asn Leu Trp Gln Arg Ile Arg Glu Glu Asn Leu Tyr
225 230 235 240
Leu Lys Ala Ile Glu Glu Ala Leu Arg Tyr Ser Pro Pro Val Met Arg
245 250 255
Thr Val Arg Lys Thr Lys Glu Arg Val Lys Leu Gly Asp Gln Thr Ile
260 265 270
Glu Glu Gly Glu Tyr Val Arg Val Trp Ile Ala Ser Ala Asn Arg Asp
275 280 285
Glu Glu Val Phe His Asp Gly Glu Lys Phe Ile Pro Asp Arg Asn Pro
290 295 300
Asn Pro His Leu Ser Phe Gly Ser Gly Ile His Leu Cys Leu Gly Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Arg Ile Ala Ile Glu Glu Phe Ser Lys
325 330 335
Arg Phe Arg His Ile Glu Ile Leu Asp Thr Glu Lys Val Pro Asn Glu
340 345 350
Val Leu Asn Gly Tyr Lys Arg Leu Val Val Arg Leu Lys Ser Asn Glu
355 360 365

Claims (5)

1.一种CYP119酶的突变体，其特征在于，所述突变体为在如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的基础上，仅存在突变位点T213G和F153G。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.权利要求1-2任一所述的突变体在催化月桂酸羟基化反应、苯乙烯及苯乙烯类似物的环氧化反应、或硫醚类底物的氧化反应中的应用。
4.权利要求1-2任一所述的突变体在催化硫醚类底物氧化反应中增加亚砜生成，减少砜生成中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，在催化硫醚类底物氧化反应体系中，加入正辛酸。
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