CN105802925A - 一种cyp119酶突变体及其应用 - Google Patents

一种cyp119酶突变体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105802925A
CN105802925A CN201610173586.0A CN201610173586A CN105802925A CN 105802925 A CN105802925 A CN 105802925A CN 201610173586 A CN201610173586 A CN 201610173586A CN 105802925 A CN105802925 A CN 105802925A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
cyp119
styrene
mutant
cis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610173586.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105802925B (zh
Inventor
张春
王钦
王力
韦思平
刘平先
杨亚
苟惠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southwest Medical University
Original Assignee
Southwest Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southwest Medical University filed Critical Southwest Medical University
Priority to CN201610173586.0A priority Critical patent/CN105802925B/zh
Publication of CN105802925A publication Critical patent/CN105802925A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105802925B publication Critical patent/CN105802925B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
    • C12N9/0081—Cholesterol monooxygenase (cytochrome P 450scc)(1.14.15.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/15—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced iron-sulfur protein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.15)
    • C12Y114/15006—Cholesterol monooxygenase (side-chain-cleaving) (1.14.15.6), i.e. cytochrome P450scc

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种CYP119酶突变体，以野生型CYP119酶的氨基酸序列为参考序列，含有T214V突变位点以及选自S148P、I161T、和K199E所组成的组中的至少一个的突变位点。本发明提供的CYP119突变酶催化效率更高。在常温下，突变体酶催化苯乙烯环氧化反应的催化能力较野生型能够提高近6倍，较单突变体T214V提高近2倍。此外，还能催化除以往文献报道的底物外的其它一系列底物发生环化氧化。因此本发明所提供的CYP119酶突变体极大的提高了CYP119酶的催化反应效果和应用范围，具有广泛的应用前景。

Description

一种CYP119酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种CYP119酶突变体及其应用。
背景技术
CYP119酶(cytochromeP450119)来自黄石公园火山口分离的嗜酸嗜热硫矿硫叶菌(Sulfolobussolfataricus)，因此该酶具耐酸抗高温等作用。目前文献报道CYP119酶在过氧化氢或假单孢氧还蛋白-还原酶(Pd/PdR)和辅酶NADPH条件下能催化月桂酸羟基化和苯乙烯环氧化的反应，该反应绿色环保具有较高应用前景。由于该酶的天然底物未能确定，因此，利用苯乙烯作为CYP119酶的底物进行环氧化反应时，其催化效率较低。OrtizdeMontellano小组报道，CYP119野生型酶在常温下催化苯乙烯环氧化反应的过氧化氢酶途径中，催化常数仅为0.6min-1，其突变体T214V能明显改善与苯乙烯的结合能力，过氧化氢途径下的苯乙烯环氧化反应速率比野生型提高了近3倍。LauraS.Koo(2000)小组将野生型酶进行突变，发现突变体T214V能明显改善与苯乙烯的结合能力。前期研究发现，将该酶的反应条件进行优化，能够获得在TBHP为辅助氧化剂，pH7.5的磷酸缓冲液中野生型CYP119酶催化苯乙烯环氧化反应的催化常数为：15.7±0.4min-1，单突变体T214V催化苯乙烯环氧化反应的催化常数为：31.6±1.4min-1。现有的CYP119突变体虽然从一定程度上提高了酶的催化效率，但是催化效率仍比较低下，不能满足实际生产的需要。因此，有必要深入研究CYP119酶催化底物的机制，开发具有更高催化效率的CYP119酶的编码序列，为提高CYP119酶的产业化应用价值提供有效手段。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种具有更高底物催化效率的CYP119酶的新突变体。
本发明的第二个目的在于提供CYP119酶突变体的应用。
为达到以上目的，本发明的发明人对CYP119酶的蛋白序列以及蛋白构象和酶活性中心的特点进行了研究，通过构建突变文库的方式开发了一种新的CYP119酶突变体，以野生型CYP119酶的氨基酸序列为参考序列，含有T214V突变位点以及选自S148P、I161T、和K199E所组成的组中的至少一个的突变位点。
其中，以野生型CYP119酶的氨基酸序列为参考序列表示以目前本领域已经公知的野生型CYP119酶的氨基酸序列中氨基酸的种类和排列方式为参考。
其中，野生型CYP119酶的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。
其中，所述T214V突变位点代表以SIQIDNO.3所示的氨基酸序列为参考序列，第214位氨基酸处存在一个突变，突变的形式为由苏氨酸T突变为缬氨酸V。
其中，所述S148P突变位点代表以SIQIDNO.3所示的氨基酸序列为参考序列，第148位氨基酸处存在一个突变，突变的形式为由丝氨酸S突变为脯氨酸P。
其中，所述I161T突变位点代表以SIQIDNO.3所示的氨基酸序列为参考序列，第161位氨基酸处存在一个突变，突变的形式为由异亮氨酸I突变为苏氨酸T。
其中，所述K199E突变位点代表以SIQIDNO.3所示的氨基酸序列为参考序列，第199位氨基酸处存在一个突变，突变的形式为由赖氨酸K突变为谷氨酸E。
本领域技术人员可以理解的是，对以上述所列举的四个突变位点为基础的，其他位点的氨基酸进行的没有影响所述CYP119酶突变体功能的其他突变所获得的突变体均应属于本发明的保护范围。
优选的情况下，当所述CYP119酶突变体是以野生型CYP119酶的氨基酸序列为参考序列，含有突变位点T214V、S148P、I161T和K199E时，所获得的四突变体S148P/I161T/K199E/T214V具有最佳催化效率提高效果。
可选的，所述CYP119酶突变体具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。
本发明的一个方面还提供了编码所述的CYP119酶突变体的核苷酸序列。
值得注意的是，由于密码子具有简并性，因此能够编码本发明所述CYP119酶突变体的核苷酸序列均属于本发明的保护范围。
优选的，所述CYP119酶突变体的编码核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
本发明还提供了所述基因的表达单元、重组载体或表达系统。
其中，所述表达单元为可以用于基因表达CYP119酶突变体的DNA序列、RNA序列等。
其中，所述重组载体为携带有所述CYP119酶突变体的编码核苷酸序列的用于保存、携带或者在目的生物中表达所述CYP119酶突变体酶的基因的核苷酸序列。
其中，所述表达系统可以为用于表达所述CYP119酶突变体蛋白的宿主细胞或生物体，所述宿主细胞优选为微生物细胞。
本发明的一个方面还提供了所述CYP119酶突变体的应用。所述应用包括CYP119酶突变体在催化月桂酸羟基化反应和苯乙烯及苯乙烯类似物的环氧化反应中的应用。
所述苯乙烯类似物包括但不限于：顺式对甲基-β-甲基苯乙烯(cis-4-methyl-β-methylstyrene)，顺式间甲基-β-甲基苯乙烯(cis-3-methyl-β-methylstyrene)，顺式对甲氧基-β-甲基苯乙烯(cis-4-methoxy-β-methylstyrene)，顺式间甲氧基-β-甲基苯乙烯(cis-3-methoxy-β-methylstyrene)，顺式对氯-β-甲基苯乙烯(cis-4-chloro-β-methylstyrene)，顺式间氯-β-甲基苯乙烯(cis-3-chloro-β-methylstyrene)，顺式对溴-β-甲基苯乙烯(cis-4-bromo-β-methylstyrene)，顺式间溴-β-甲基苯乙烯(cis-3-bromo-β-methylstyrene)中的至少一种。
上述苯乙烯类似物均不是野生型CYP119酶的常规已知催化底物，此前本领域也没有关于CYP119酶及其突变体对上述底物的催化反应的相关报道，本发明的发明人通过研究发现，本发明所提供的突变体能够适用于上述底物的环氧化反应，并能取得较好的酶促反应效果。极大的扩展了CYP119酶的应用范围。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述应用为催化苯乙烯环氧化。
其中，在所述应用中，酶催化的底物为苯乙烯和/或苯乙烯类似物，酶的最适pH范围为7.0-8.5，反应温度为35℃-70℃，反应在供氧剂TBHP存在下进行。
优选的，当酶的催化底物为苯乙烯时，酶的最适pH范围为8.5，反应温度为70℃，反应在供氧剂TBHP存在下进行。
特别优选的，在本发明所提供的方法中，相对于1mmol/L的所述催化底物，酶的用量为12.5μmol/L，供氧剂TBHP与酶催化底物的摩尔比为1:1。
本发明提供的CYP119酶突变体催化效率更高。在常温下，突变体酶催化苯乙烯环氧化反应的催化能力较野生型能够提高近6倍，较单突变体T214V提高近2倍。此外，本发明所提供的酶突变体还能催化除以往文献报道的底物外的其它一系列底物发生环化氧化。可见本发明所提供的CYP119突变体不但极大的提高了CYP119酶的催化反应效果也在很大程度上扩展了酶的应用范围，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为CYP119突变酶催化苯乙烯环氧化反应的GC检测结果。
A，底物苯乙烯进样(浓度为4mM)；B,反应温度为35℃，底物浓度4mM，PH＝7.5，反应时间5min，突变酶催化苯乙烯环氧化反应；C，反应温度为70℃，底物浓度4mM，PH＝8.5，反应时间5min，突变酶催化苯乙烯环氧化反应。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
1CYP119突变文库构建及突变酶的表达
1.1CYP119酶的突变文库的构建：根据pET30a-CYP119载体，利用GeneMorphIIrandommutagenesiskit(Stratagene,LaJolla,CA)进行突变。将PCR产物进行双酶切并连接到pET30a载体上，构建pET30a-CYP119M质粒。将该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS。挑选阳性克隆进行大量测序，对于出现提前终止子密码、无义突变、同义突变、碱基缺失成移码突变的克隆去掉，测序之后根据酶的蛋白构象特点以及活性中心位点挑选突变靠近活性中心附近并具有可能影响催化效率的克隆进行下一步表达。
1.2突变克隆的表达：将突变阳性质粒，接种于2mL双抗LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。取100μl过夜培养的菌液于50mL双抗的TB培养基。加入250μl/LTraceElement，37℃，震荡培养至OD0.6。加入0.4mMIPTG，32℃，诱导24h。12000rpm，4℃离心10min，弃上清，加入1mLpH7.4，50mMPBS溶液充分悬浮菌体(此步骤仅将离心后获得有红色菌体沉淀的样品用于下一步纯化操作)。将样品置于冰水上，超声破胞，50％功率，3s-3s，20min分两次破完。破胞后在55℃水浴中加热15min，12000rpm，4℃，离心40min，取上清液即为粗酶液。
1.3CYP119突变酶的纯化及筛选
采用Ni-NTA柱，利用10mM-80mM咪唑梯度浓度对粗酶液进行梯度洗脱，最后利用150mM咪唑洗脱目的蛋白。将收集的洗脱液用Ultra-1510K浓缩至200μL左右，酶液呈现鲜红色或红黑色，-80℃保存。
2突变文库的筛选
2.1根据突变酶与CO结合后特征光谱变化进行筛选
将纯化的一系列突变酶，在紫外分光光度计下扫描，记录该酶在417nm附近的特征峰吸光度值。加入过量Na2S2O4，通入CO直至饱和，记录450nm时的吸光度数据。根据通入CO前后，突变酶特征峰值的变化情况，对突变酶文库进行第一轮筛选。
2.2突变酶催化苯乙烯环氧化反应的筛选
反应条件为：温度为35℃，苯乙烯溶解在乙腈中，使其终浓度为5mM，CYP119突变酶12.5μM。反应缓冲体系为50mMbis-Trisbuffer,pH7.5，总体系200μL。在35℃下预热2min后加入TBHP(5mM)起始反应。10min后，用正己烷200μL淬灭反应，充分混匀后离心，分取正己烷层，用GC-MS检测底物的转化率。GC-MS的检测条件：ThermoScientificITQ900,手性柱CP-chirasl-DexCB：80℃，1min；80-110℃，2℃/min升高；110℃保持1min。在此条件下筛选得到四突变体S148P/I161T/K199E/T214V，对苯乙烯环氧化反应具有较高的转化率。
结果表明，在延长反应时间至30min后，四突变体S148P/I161T/K199E/T214V在催化苯乙烯环氧化反应时具有最高的转化率99％。因此，进一步研究该突变体的动力学常数，以便与野生型酶和其它突变酶进行比较。
3突变酶对底物苯乙烯的动力学实验。
动力学实验条件：设置梯度浓度苯乙烯(溶解在乙腈中)，反应温度为35℃。反应缓冲体系为50mMbis-Trisbuffer,pH7.4。总体系80μL。TBHP加入启动反应，30s后立即用720μL乙腈淬灭反应，于HPLC检测产物。液相色谱检测条件：戴安(DionexU-3000)，C18柱，30％ddH2O，70％乙腈作为流动相，检测波长220nm,流速：1mL/min。
根据米氏常数分析获得四突变体S148P/I161T/K199E/T214V的催化常数为63.0±0.2min-1。较野生型酶催化苯乙烯效率提高了近6倍。较以前文献报道的T214V突变体催化效率提高了近2倍。野生型CYP119酶和突变体催化常数的比较如表1所示：
表1野生型CYP119酶和突变体催化常数的比较
实施例2
反应条件：温度分别为35℃(图1B)和70℃(图1B)，苯乙烯溶解在乙腈中，使其终浓度为4mM，CYP119突变酶12.5μM。35℃时反应缓冲体系为50mMbis-Trisbuffer，pH7.5，总体系200μL。70℃时，反应缓冲体系为50mMglycinebuffer，pH8.5，总体系200μL。分别在35℃(图1B)和70℃(图1B)下预热2min后加入TBHP(4mM)起始反应。5min后，用正己烷200μL淬灭反应，充分混匀后离心，分取正己烷层，用GC检测，相对丰度结果如图1所示。
图1中：A，底物苯乙烯进样(浓度为4mM)；B,反应温度为35℃，底物浓度4mM，PH＝7.5，反应时间5min，突变酶催化苯乙烯环氧化反应；C，反应温度为70℃，底物浓度4mM，PH＝8.5，反应时间5min，突变酶催化苯乙烯环氧化反应。
实施例3
按照与实施例1相同的方法，利用突变体S148P/I161T/K199E/T214V催化苯乙烯类似物，转化率结果如表2所示。
表2突变体S148P/I161T/K199E/T214V催化其它底物环氧化反应结果
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种CYP119酶突变体，其特征在于，以野生型CYP119酶的氨基酸序列为参考序列，含有T214V突变位点以及选自S148P、I161T、和K199E所组成的组中的至少一个的突变位点。
2.根据权利要求1所述的CYP119酶突变体，其特征在于，以野生型CYP119酶的氨基酸序列为参考序列，含有突变位点T214V、S148P、I161T和K199E。
3.根据权利要求2所述的CYP119酶突变体，其特征在于，具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。
4.编码权利要求1-3中任意一项所述的CYP119酶突变体的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于，如SEQIDNO.2所示。
6.含有权利要求4或5所述核苷酸序列的表达单元、重组载体或表达系统。
7.权利要求1-3中任意一项所述的CYP119酶突变体在催化月桂酸羟基化反应和苯乙烯及苯乙烯类似物的环氧化反应中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述苯乙烯类似物包括：顺式对甲基-β-甲基苯乙烯，顺式间甲基-β-甲基苯乙烯，顺式对甲氧基-β-甲基苯乙烯，顺式间甲氧基-β-甲基苯乙烯，顺式对氯-β-甲基苯乙烯，顺式间氯-β-甲基苯乙烯，顺式对溴-β-甲基苯乙烯和顺式间溴-β-甲基苯乙烯中的至少一种。
9.根据权利要求7-8中任意一项所述的应用，其特征在于，酶催化的底物为苯乙烯和/或苯乙烯类似物，酶的最适pH范围为7.0-8.5，反应温度为35℃-70℃，反应在供氧剂TBHP存在下进行。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，酶的催化底物为苯乙烯，酶的最适pH为8.5，反应温度为70℃，反应在供氧剂TBHP存在下进行。
CN201610173586.0A 2016-03-24 2016-03-24 一种cyp119酶突变体及其应用 Active CN105802925B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610173586.0A CN105802925B (zh) 2016-03-24 2016-03-24 一种cyp119酶突变体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610173586.0A CN105802925B (zh) 2016-03-24 2016-03-24 一种cyp119酶突变体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105802925A true CN105802925A (zh) 2016-07-27
CN105802925B CN105802925B (zh) 2019-06-25

Family

ID=56454376

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610173586.0A Active CN105802925B (zh) 2016-03-24 2016-03-24 一种cyp119酶突变体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105802925B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109468287A (zh) * 2018-11-22 2019-03-15 浙江华睿生物技术有限公司 一种羟化酶突变体
CN110241095A (zh) * 2019-06-05 2019-09-17 西南医科大学 一种cyp119酶及其突变体和用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031890A (zh) * 2014-05-30 2014-09-10 泸州医学院 Cyp119-t213g/t214v突变酶及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031890A (zh) * 2014-05-30 2014-09-10 泸州医学院 Cyp119-t213g/t214v突变酶及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张春 等: "突变体CYP119 T213G催化苯乙烯不对称环氧化反应研究", 《中国化学会第29届学术年会摘要集——第22分会：化学生物学》 *
李静 等: "细胞色素P450 119酶及其突变酶催化活性的探究", 《第八届全国化学生物学学术会议论文摘要集》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109468287A (zh) * 2018-11-22 2019-03-15 浙江华睿生物技术有限公司 一种羟化酶突变体
CN109468287B (zh) * 2018-11-22 2020-10-16 浙江华睿生物技术有限公司 一种羟化酶突变体
CN110241095A (zh) * 2019-06-05 2019-09-17 西南医科大学 一种cyp119酶及其突变体和用途
CN110241095B (zh) * 2019-06-05 2022-11-01 西南医科大学 一种cyp119酶及其突变体和用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN105802925B (zh) 2019-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Watts et al. Discovery of a substrate selectivity switch in tyrosine ammonia-lyase, a member of the aromatic amino acid lyase family
Fong et al. Directed evolution of D-2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase to new variants for the efficient synthesis of D-and L-sugars
CN112280761B (zh) 一种重组转氨酶和所述重组转氨酶的突变体及其应用
CN109182284A (zh) 一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用
Shima et al. Characterization of a heme-dependent catalase from Methanobrevibacter arboriphilus
Cao et al. Enhancing the thermostability of highly active and glucose-tolerant β-glucosidase Ks5A7 by directed evolution for good performance of three properties
CN112877307B (zh) 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用
CN111321132B (zh) 一种反应专一性提高的腈水解酶突变体及其应用
CN104774813A (zh) 一种亮氨酸脱氢酶及其制备方法和应用
CN101845447A (zh) 一种β-琼胶酶编码基因及基因获取方法
CN104093836A (zh) 烃合成酶基因及其利用
Brack et al. Discovery of novel tyrosine ammonia lyases for the enzymatic synthesis of p‐Coumaric acid
Meng et al. Identification and rational engineering of a high substrate‐tolerant leucine dehydrogenase effective for the synthesis of L‐tert‐leucine
CN105802925A (zh) 一种cyp119酶突变体及其应用
CN109370998B (zh) 一种催化效率提高的ω-转氨酶突变体I215F
CN104726435B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶突变体、其重组表达质粒及转化的工程菌株
CN110904088B (zh) 耐高温d-阿洛酮糖3-差向异构酶、突变体及其应用
CN104031892A (zh) 一种亮氨酸脱氢酶和编码该脱氢酶的基因
CN110241095B (zh) 一种cyp119酶及其突变体和用途
CN104031890B (zh) Cyp119‑t213g/t214v突变酶及其用途
Uhrigshardt et al. Purification and characterization of the first archaeal aconitase from the thermoacidophilic Sulfolobus acidocaldarius
CN104059893B (zh) Cyp119‑t213g酶及其纯化方法
Xu et al. Modulating the pH profile of vanillin dehydrogenase enzyme from extremophile Bacillus ligniniphilus L1 through computational guided site-directed mutagenesis
CN112760298A (zh) 一种细胞色素p450bm3氧化酶突变体及其制备方法和应用
Chen et al. Kinetic study and molecular dynamics simulation of two novel mannose isomerases

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant