CN104031890B - Cyp119‑t213g/t214v突变酶及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶学领域，具体涉及一种CYP119酶的突变酶及其用途。本发明要解决的技术问题是现有的CYP119酶的对映选择性不高的问题。本发明解决该技术问题的技术方案是提供了一种野生型CYP119酶的双突变体。该CYP119酶的双突变体的突变方式为T213G和T214V。该双突变体在常温和高温下均能有效催化苯乙烯环氧化反应，同时能获得较野生型酶明显更高的对映选择性，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于酶学领域，具体涉及一种CYP119酶的突变酶及其用途。
背景技术
对映异构体为分子量和结构完全相同，但行驶功能完全不同的两种化合物，然而，对于对映异构体的拆分非常困难。催化剂的对映选择性即体现了其催化底物生成单一对映异构体的能力，因此，对应选择性的提高，有利于获得单一对映异构体。提高酶的对映选择性为获得单一手性化合物具有重要意义。CYP119酶(cytochrome P450119)来自黄石公园火山口分离的嗜酸嗜热硫矿硫叶菌(Sulfolobus solfataricus)，因此该酶具耐酸抗高温等作用。研究表明CYP119酶能催化月桂酸和苯乙烯等底物发生环氧化反应，该反应绿色环保具有较高应用前景。由于该酶的天然底物未能确定，因此，利用苯乙烯作为CYP119酶的底物进行环氧化反应时，获得的对映选择性不高。Ortiz de Montellano小组[1,2]报道，CYP119野生型酶在常温下催化苯乙烯环氧化反应的过氧化氢酶途径中，S和R构型的环氧苯乙烷之比约为3:1。其突变体T214V在过氧化氢途径下的苯乙烯环氧化反应速率比野生型有所提高，但其对映选择性与野生型相比几乎无变化。后来Rabe KS等[3]，考察了CYP119酶催化苯乙烯环氧化反应的最佳温度和PH值，结果表明，温度为70℃，TBHP为辅助氧化剂，pH8.5的甘氨酸缓冲液为野生型CYP119酶催化苯乙烯环氧化反应的最佳反应条件,但是随着温度的升高，其对映选择性降低。在70℃时，CYP119酶催化苯乙烯环氧化反应产物S和R构型的环氧苯乙烷之比降低为2:1。故本领域急需要解决其对映选择性不高的难题。
[1]Koo L.S.,Tschirret-Guth R.A.,Straub W.E.,et al.J.Biol.Chem.2000,275,14112–14123.
[2]Koo L.S.,Ortiz de Montellano.J.Biol.Chem.,2002,124,5684-5691.
[3]Rabe KS,Kiko K,Niemeyer CM.Chemical biology chemical.2008,9,420-425
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有的CYP119酶的对映选择性不高的问题。本发明解决该技术问题的技术方案是提供了一种野生型CYP119酶的双突变体。
该CYP119酶的双突变体的突变方式为T213G和T214V。
进一步的，上述的CYP119酶的双突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了上述CYP119酶的双突变体的编码基因。
进一步的，上述CYP119酶的双突变体的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
本发明也还提供了含有上述编码基因的载体。
同时，本发明提供了上述载体的宿主细胞。
此外，本发明提供了上述CYP119酶的双突变体在制备环氧化反应催化剂中的用途。
其中，上述的环氧化反应的底物为月桂酸或苯乙烯。也可以是月桂酸或苯乙烯的类似物或衍生物。
本发明的有益效果在于：本发明创造性地提供了一种CYP119酶的213G和214V的双突变体，该双突变体在常温和高温下均能有效催化苯乙烯环氧化反应，同时能获得较野生型酶明显更高的对映选择性。具有很好的应用前景。
附图说明
图1、苯乙烯及R-，S-环氧苯乙烷标准品GC-MS图谱，此图反映了底物苯乙烯和环氧化产物的保留时间。
图2、双突变酶在35℃下催化苯乙烯环氧化反应的结果，此图表明了在35℃下，苯乙烯环氧化反应生成的两个对映异构体产物的积分面积比值，从而可计算得出其对映选择性数据。
图3、双突变酶在70℃下催化苯乙烯环氧化反应的结果，此图表明了在70℃下，苯乙烯环氧化反应生成的两个对映异构体产物的积分面积比值，从而可计算得出其对映选择性数据。
图4环氧苯乙烷离子碎片峰，具有了了环氧苯乙烷的特征离子峰，表明检测产物存在。
具体实施方式
本研究小组根据前人结果，进行了CYP119酶的213G和214V的双突变，根据本研究结果发现，双突变体在常温和高温下催化苯乙烯环氧化反应，均能获得较野生型酶更高的对映选择性。以下结合具体实施方式的描述对本发明进行具体说明。
实施例一CYP119-T213G/T214V酶表达载体构建
CYP119酶野生型的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，氨基酸序列为SEQ ID No.6所示(Wright RL,Harris K,Solow B,White RH,Kennelly PJ.Cloning of a potentialcytochrome P450from the Archaeon Sulfolobus solfataricus.FEBS Letters,1996,384:235-239.)。
CYP119酶的突变，由于要对其进行T213G和T214V的的双突变，故根据含有CYP119野生型基因的载体pET30a-CYP119(SEQ ID No.7)载体设计突变位点的引物序列。引物序列为：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，加粗并加下划线处表示突变位点。
扩增CYP119-T213G/T214V酶的上游引物(SEQ ID No.3)：
5'TTCTCATAGCGGGTAATGAGGGTGTTACTAACTTAATATCAAA3'；
扩增CYP119-T213G/T214V酶的下游引物(SEQ ID No.4)：
5'TTTGATATTAAGTTAGTAACACCCTCATTACCCGCTATGAGAA3'。
利用Quickchange Lighting Site-directed Mutagenesis Kit定点突变试剂盒，按照说明书操作进行定点突变，然后转化大肠杆菌DH5a。挑选阳性克隆测序，确认是否完成突变及突变后位点的准确性。
测序结果表明，定点突变完成，突变位点准确，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。编码的CYP119-T213G/T214V酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
CYP119-T213G/T214V酶的氨基酸序列(SEQ ID No.2)如下：
1 MYDWFSEMRK KDPVYYDGNI WQVFSYRYTK EVLNNFSKFS SDLTGYHERL EDLRNGKIRF
61 DIPTRYTMLT SDPPLHDELR SMSADIFSPQ KLQTLETFIR ETTRSLLDSI DPREDDIVKK
121 LAVPLPIIVI SKILGLPIED KEKFKEWSDL VAFRLGKPGE IFELGKKYLE LIGYVKDHLN
181 SGTEVVSRVV NSNLSDIEKL GYIILLLIAG NEGVTNLISN SVIDFTRFNL WQRIREENLY
241 LKAIEEALRY SPPVMRTVRK TKERVKLGDQ TIEEGEYVRV WIASANRDEE VFHDGEKFIP
301 DRNPNPHLSF GSGIHLCLGA PLARLEARIA IEEFSKRFRH IEILDTEKVP NEVLNGYKRL
361 VVRLKSNE
实施例二CYP119-T213G/T214V酶表达载体纯化
将pET30a-CYP119-T213G/T214V质粒转化BL21(DE3)plysS大肠杆菌感受态细胞。挑选阳性单菌落，接种于5mL双抗LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。取2mL过夜培养的菌液于1L双抗的TB培养基。加入250μl/L Trace Element，37℃，震荡培养至OD0.6。加入0.4mMIPTG，32℃，诱导45h。
(3)12000rpm，4℃离心10min，弃上清，加入20mL PH7.4，50mM PBS溶液充分悬浮菌体。将样品置于冰水上，超声破胞，50％功率，3s-3s，20min分两次破完。破胞后在55℃水浴中加热15min，12000rpm，4℃，离心40min，取上清液即为粗酶液。
CYP119-T213G/T214V酶的纯化
纯化所需试剂配方：
平衡液I：50mM PBS，PH7.4，5mM咪唑
平衡液II：50mM PBS，0.5M NaCl，PH7.4，5mM咪唑
洗脱液I：50mM PBS，PH7.4，20mM咪唑
洗脱液II：50mM PBS，PH7.4，80mM咪唑
纯化步骤：
1)平衡液I洗脱5个柱体积。
2)用灭菌的0.22μm过滤膜过滤粗酶液，上柱。
3)平衡液I洗5个柱体积。
4)平衡液II洗5个柱体积。
5)洗脱液I洗6个柱体积。
6)洗脱液II洗5个柱体积，收集洗脱液。
将收集的洗脱液II用 Ultra-1510K浓缩至800μL左右，再用50mM PBS，PH7.4置换缓冲液3次，浓缩至600μL左右，酶液呈现鲜红色或红黑色。将浓缩酶稀释201倍后，紫外分光光度计测得A415＝0.3165，据此算出酶量为15.78mg/L。-80℃保存。
经过此纯化后，蛋白的纯度达90％以上，满足后续工作的要求。
实施例三CYP119-T213G/T214V突变酶催化苯乙烯环氧化反应的对映选择性研究
以叔丁基过氧化氢(TBHP)为辅助氧化剂，在反应温度分别为35℃和70℃时催化苯乙烯环氧化反应，测定其在低温和高温下催化苯乙烯的对映选择性。
温度为35℃时的反应条件为：苯乙烯溶解在乙腈中，使其终浓度为8mM，叔丁基过氧化氢8mM，CYP119-T213G/T214V酶40μM。反应缓冲体系为50mM bis-Tris buffer,pH7.5，总体系200μL。反应10min时用200μL CH2Cl2淬灭反应。等体积CH2Cl2萃取3次，用GC-MS进行产物的检测。
反应温度为70℃时的反应条件为：苯乙烯溶解在pH8.5甘氨酸溶液中，使其终浓度为8mM，叔丁基过氧化氢8mM。CYP119-T213G/T214V酶40μM。反应缓冲体系为甘氨酸缓冲液PH＝8.5，总体系200μL。反应10min时，用200μL CH2Cl2淬灭反应。等体积CH2Cl2萃取3次，用GC-MS进行产物的检测。
将标准品苯乙烯，S-环氧苯乙烷，R-环氧苯乙烷进行GC-MS分析，以确定底物和产物的保留时间。GC-MS的检测条件：Thermo Scientific ITQ900,手性柱CP-chirasl-DexCB：80℃，1min；80-110℃，2℃/min升高；110℃保持1min。R-环氧苯乙烷保留时间：14.57min左右，S-环氧苯乙烷保留时间：15.36min左右，苯乙烯的保留时间为4.7min左右(图1,4)。根据反应产物的检测，获得R-环氧苯乙烷与S-环氧苯乙烷的峰面积(图2,3)，计算催化苯乙烯环氧化反应的对映选择性数据。
上述实验结果表明在35℃时，双突变体催化苯乙烯环氧化产物S：R＝5.8:1；在70℃时，双突变体催化苯乙烯环氧化产物S：R＝4.6:1。相对于现有的CYP119酶，无论在高温或是低温下反应，对映选择性均具有显著的提高。
Claims (7)
1.CYP119酶的双突变体，其突变方式为T213G和T214V，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的CYP119酶的双突变体的编码基因。
3.根据权利要求2所述的CYP119酶的双突变体的编码基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
4.含有权利要求2或3所述的基因的载体。
5.含有权利要求4所述的载体的宿主细胞。
6.权利要求1所述的CYP119酶的双突变体在制备环氧化反应催化剂中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的环氧化反应的底物为月桂酸或苯乙烯。
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