CN105277493B

CN105277493B - 检测dera酶催化醛缩反应液中氯乙醛含量及催化效率的方法

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Publication number: CN105277493B
Application number: CN201510613269.1A
Authority: CN
Inventors: 金志华; 吴志革; 金庆超; 杨郁; 蔡伟; 张鑫红; 戎凯; 罗伊丝
Original assignee: Ningbo Institute of Technology of ZJU
Current assignee: Ningbo Institute of Technology of ZJU
Priority date: 2015-09-23
Filing date: 2015-09-23
Publication date: 2018-05-01
Anticipated expiration: 2035-09-23
Also published as: CN105277493A

Abstract

本发明公开了一种检测DERA酶催化连续醛缩反应液中氯乙醛含量及催化效率的方法，检测反应液中氯乙醛含量的方法包括：(1)取反应上清液，加入2，4‑二硝基苯肼，在酸性条件下进行反应，获得样本反应液；(2)向样本反应液中加入碱液继续反应，获得样本待测液；(3)在520～535nm波长下测量样本待测液的吸光度，根据标准曲线计算反应上清液中氯乙醛的含量。然后根据计算参与催化反应的氯乙醛的消耗量来反映DERA酶的催化效率。在528nm下测量样本待测液的吸光度，在该波长下只有氯乙醛参与产生的产物的吸收峰，不存在乙醛参与产生的产物的干扰，测量结果稳定、其准确率和灵敏度均大大提高。

Description

检测DERA酶催化醛缩反应液中氯乙醛含量及催化效率的方法

技术领域

本发明涉及一种酶催化效率的检测方法，具体涉及一种检测DERA酶催化醛缩反应液中氯乙醛含量及催化效率的方法。

背景技术

他汀类药物是降血脂主要药物，其结构中均带有侧链(3R，5S)-二羟基酯结构，该结构可作为甲羟戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，抑制HMG-CoA向甲羟戊酸的还原性转化，进而降低低密度脂蛋白胆固醇的水平，从而达到降低血脂的目的。

他汀类药物虽然化学结构相对简单，但其制备过程难度较大，原因有两个，一是侧链(3R，5S)-二羟基酯具有2个手性中心，难以通过一步反应完成；二是侧链(3R，5S)-二羟基酯在他汀类分子中的对映体过量(e.e.)和非对映体过量(d.e.)值分别大于99.5％和99％，使得对映体的拆分比较困难。这些因素都导致他汀类药物侧链合成产率较低，成本较高。

生物催化是解决当前问题的重要途径。目前，已经发现有生物酶对羟醛缩合反应有催化效果，其中醛缩酶DERA能够催化乙醛和氯乙醛的连续醛缩反应，生成带有两个手性中心的6-氯-(3R，5S)-二羟基醛，在他汀类药物合成中具有巨大的潜在应用价值。

但不同的生物酶，甚至不同来源的DERA酶，对连续醛缩反应的催化效果均不相同。在寻找催化效果更佳的DERA酶的过程中，就需要对其产物进行检测，以评价DERA酶的催化效率。然而，由于利用DERA酶催化连续醛缩反应时，对其产物的检测非常困难，一般需要用到气相色谱等仪器，对仪器要求高，检测成本高，从而严重限制了改进DERA酶催化性能的研究。

通过检测DERA酶催化连续醛缩反应的上清液中未反应底物的含量，可以得出参与催化反应的底物的消耗量，从而可获得DERA酶的催化效率。

对于甲醛、乙醛等羰基化合物的检测方法，一般是先将甲醛在酸性条件下与2，4-二硝基苯肼反应，生产稳定的2，4-二硝基苯腙；然后可经环己烷萃取，用配有电子波或检测器的气相色谱仪测定2，4-二硝基苯腙的含量，得出甲醛的含量；还可将2，4-二硝基苯腙置于碱性条件下生成有色的醌类化合物，并在430nm左右波长下利用比色法测定醌类化合物的吸光度，也可以计算出甲醛的含量。

但DERA酶催化连续醛缩反应的反应体系中，含有乙醛和氯乙醛两种羰基化合物，乙醛和氯乙醛均能依次与2，4-二硝基苯肼、碱液发生反应，生成棕红色化合物。在测量含有两种棕红色化合物的样本待测液的吸光度时，本发明人发现，在430nm左右波长下测量时，检测结果极不稳定，准确率较差。

发明内容

本发明提供了一种检测DERA酶催化连续醛缩反应液中氯乙醛含量的方法，该方法具有检测结果准确、检测灵敏度高等特点。

一种检测DERA酶催化连续醛缩反应液中氯乙醛含量的方法，包括以下步骤：

(1)取反应上清液，加入2，4-二硝基苯肼，在酸性条件下进行反应，获得样本反应液；

(2)向样本反应液中加入碱液继续反应，获得样本待测液；

(3)在520～535nm波长下测量样本待测液的吸光度，根据标准曲线计算反应上清液中氯乙醛的含量。

传统方法在检测溶液中羰基化合物的含量时，一般是在430nm左右波长下测量样本待测液的吸光度。但本发明的上清液中含有乙醛和氯乙醛两种羰基化合物，乙醛和氯乙醛均能依次与2，4-二硝基苯肼、碱液发生反应，生成棕红色化合物。在测量含有两种棕红色化合物的样本待测液的吸光度时，发明人发现，在430nm左右波长下测量时，检测结果极不稳定，准确率较差。这是因为乙醛参与反应生成的棕红色化合物A，其特异性吸收峰在438nm处，而氯乙醛参与反应生成的棕红色化合物B，其特异性吸收峰却在520～535nm，这是出乎本领域技术人员常规认知之外的。同时棕红色化合物B在430nm波长下也具有与棕红色化合物A相近的吸收峰，两者的吸收峰彼此覆盖，使得在430nm左右波长下测量样本待测液的吸光度时，测量结果不准确。而本发明在520～535nm下测量样本待测液的吸光度，在该波长下只有棕红色化合物B的吸收峰，测量结果稳定、准确率和灵敏度均大大提高。

具体地，所述方法包括：

作为优选，2，4-二硝基苯肼的终浓度为0.0025％～0.005％，更为优选的终浓度为0.005％。根据本领域技术人员的常规认知，2，4-二硝基苯肼的加入量应为过量，大于反应液中乙醛与氯乙醛的总量。

作为优选，上清液与2，4-二硝基苯肼的反应时间为10～30min；更优选的反应时间为20min。

(2)向样本反应液中加入碱液继续反应，获得样本待测液；

作为优选，加入碱液后至pH为8～9。

作为优选，样本反应液与碱液的反应时间为5～20min；更优选的反应时间为10min。

(3)在520～535nm波长下测量样本待测液的吸光度，根据标准曲线计算反应上清液中氯乙醛的含量；

作为优选，在528nm波长下测量样本待测液的吸光度，因棕红色化合物B的最大吸收峰在528nm处。

所述标准曲线的建立方法为：

(a)制备一组氯乙醛浓度呈梯度分布的标准品；

(b)取各标准品，加入2，4-二硝基苯肼，在酸性条件下进行反应，再加入碱液继续反应，获得标准品待测液；

(c)在520～535nm的波长下测量标准品待测液的吸光度；

(d)根据氯乙醛浓度与吸光度绘制标准曲线。

本发明还提供了一种快速检测DERA酶催化效率的方法，包括以下步骤：

(1)在反应体系中加入DERA酶、乙醛和氯乙醛，经催化反应后取上清液；

(2)利用上述的方法检测上清液中氯乙醛的含量；

(3)计算得到DERA酶的催化效率K；

K＝(A-B)/A×100％

A为反应体系中氯乙醛的初始量，B为催化反应后反应体系中氯乙醛的量。

本发明通过检测上清液中未参与催化反应的氯乙醛的含量，计算出氯乙醛参与催化反应的消耗量，通过反应底物的消耗量来反映DERA酶的催化效率K。在相同的催化条件下，氯乙醛的消耗量越大，说明该DERA酶的催化效率越高，反之，则说明DERA酶的催化效率越低。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明发现氯乙醛与乙醛等其他常规羰基化合物不同，氯乙醛依次与2，4-二硝基苯肼、碱液发生反应生成的棕红色化合物B，其特异吸收峰在528nm处；在528nm下测量样本待测液的吸光度时，在该波长下只有棕红色化合物B的吸收峰，不存在棕红色化合物A(乙醛依次与2，4-二硝基苯肼、碱液发生反应生成)的干扰，测量结果稳定、其准确率和灵敏度均大大提高。

附图说明

图1为乙醛与2，4-二硝基苯肼衍生物的光谱扫描结果；

图2为氯乙醛与2，4-二硝基苯肼衍生物的光谱扫描结果；

图3为三种DERA酶催化连续醛缩反应活性的定性检测结果；

图4为氯乙醛浓度和528nm处吸光度的标准曲线示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式和附图对本发明作进一步说明。

1、溶液配制

(1)2，4-二硝基苯肼溶液(0.1％)：取2，4-二硝基苯肼1g，加乙醇1000mL，使其溶解，再缓缓加入盐酸10mL，摇匀，即得。

(2)氢氧化钾溶液(100g/L)：取100g氢氧化钾，加800mL蒸馏水溶解，定容至1L，即得。

2、乙醛与2，4-二硝基苯肼衍生物特异性吸收峰的确定

在24孔板的三个孔中分别加入对照蒸馏水、0.5mg/L乙醛溶液、1mg/L乙醛溶液各2mL，加入100μL 2，4-二硝基苯肼溶液，混匀，室温放置20min；加入100μL氢氧化钾溶液，混匀，放置10min。以对照蒸馏水为基线校准，分别对0.5mg/L和1mg/L的乙醛溶液参与反应生成的产物进行200-700nm的光谱扫描，确定乙醛与2，4-二硝基苯肼衍生物的特异性吸收峰在438nm处(如图1)。

3、氯乙醛与2，4-二硝基苯肼衍生物特异性吸收峰的确定

在24孔板的三个孔中分别加入对照蒸馏水、0.45mg/L、0.9mg/L的氯乙醛溶液2mL，加入100μL 2，4-二硝基苯肼溶液，混匀，室温放置20min，加入100μL氢氧化钾溶液，混匀，放置10min。反应方程式为：

以对照蒸馏水为基线校准，对0.45mg/L和0.9mg/L的氯乙醛溶液参与反应生成的产物进行200-700nm的光谱扫描，确定氯乙醛与2，4-二硝基苯肼衍生物的特异性吸收峰在528nm处(如图2)，不同于乙醛与2，4-二硝基苯肼的衍生物。

当反应体系中同时存在乙醛和氯乙醛时，乙醛与2，4-二硝基苯肼的衍生物对氯乙醛与2，4-二硝基苯肼产生的衍生物在528nm的吸光度不造成显著干扰；而氯乙醛与2，4-二硝基苯肼产生的衍生物对乙醛与2，4-二硝基苯肼的衍生物在438nm的吸光度却造成显著干扰。

4、DERA酶催化连续醛缩反应活性的定性检测

将分别表达大肠杆菌DERA_Eco(F200I)(参见文献：Directed evolution of anindustrial biocatalyst:2-deoxy-D-ribose 5-phosphate aldolase.StefanJennewein,Martin Schürmann,Michael Wolberg,Iris Hilker,Ruud Luiten,MarcelWubbolts and Daniel Mink.Biotechnol.J.2006,1,537–548)、嗜热菌DERA_pya(野生型)(参见申请号为2014105211494的中国专利文献)、嗜热菌DERA_pyas(I174V，V187I)(参见申请号为2014105211494的中国专利文献)的工程菌株在37℃条件下培养至OD₆₀₀＝0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，置于25℃下诱导培养12h，经Ni-NTA柱子纯化，分别得到三种DERA酶。

在1mL反应体系中分别加入20mg DERA酶、200mM乙醛和100mM氯乙醛，于25℃、200rpm震荡反应2h，反应方程式为：

取1μL上清液，稀释10000倍，将上述稀释液加入至24孔板，每孔2mL，加入100μL 2，4-二硝基苯肼溶液，混匀，室温放置20min，加入100μL氢氧化钾溶液，混匀，放置10min后进行颜色观察。

结果显示空白对照样品为深棕红色，而大肠杆菌DERA_Eco(F200I)、嗜热菌DERA_pya(野生型)，嗜热菌DERA_pya(I174V，V187I)三个样品的颜色呈浅黄色，并颜色依次从深向浅过渡(如图3)。颜色越深，说明未参与醛缩反应的氯乙醛的含量越高，醛缩反应的效率越低。由此可见，嗜热菌DERA_pyas(I174V，V187I)具有更好地催化醛缩反应的能力，与气相检测产物(6R,4S)-2,4-二羟基-6氯甲基吡喃结论(如表1)一致。

表1

5、DERA酶催化效率的检测

(1)建立标准曲线

分别配制0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、5mg/L、8mg/L、10mg/L的氯乙醛溶液，各取2mL上述浓度的氯乙醛溶液和蒸馏水分别加入到24孔板的八个孔中，加入100μL 2，4-二硝基苯肼溶液，混匀，室温放置20min，加入100μL氢氧化钾溶液，混匀，放置10min。以蒸馏水为对照，用紫外分光光度计分别测量各样品528nm波长下的吸光度，根据浓度和吸光度的建立标准曲线(见图4)，结果发现氯乙醛浓度和吸光度存在良好的线性关系。

(2)定量检测

将分别表达大肠杆菌DERA_Eco(F200I)、嗜热菌DERA_pya(野生型)、嗜热菌DERA_pyas(I174V，V187I)的工程菌株在37℃条件下培养至OD₆₀₀＝0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，置于25℃下诱导培养12h，经Ni-NTA柱子纯化，分别得到三种DERA酶。

在1mL反应体系中分别加入20mg DERA酶、200mM乙醛和100mM氯乙醛，于25℃、200rpm震荡反应2h。取1μL上清液，稀释10000倍，将将上述稀释液加入至24孔板，每孔2mL，加入100μL的2，4-二硝基苯肼溶液，混匀，室温放置20min，加入100μL氢氧化钾溶液，混匀，放置10min后，以对照蒸馏水为基准，用紫外分光光度计测量528nm波长下的吸光度，根据标准曲线计算上清液中氯乙醛的含量分别为93.1mM、82.4mM、59.5mM。

(3)计算得到DERA酶的催化效率K

设反应体系中氯乙醛的初始量为A，催化反应后反应体系中氯乙醛的量为B，根据公式

K＝(A-B)/A×100％

计算大肠杆菌DERA_Eco(F200I)、嗜热菌DERA_pya(野生型)、嗜热菌DERA_pyas(I174V，V187I)的催化效率K分别为6.9％、17.6％、40.5％。

Claims

1.一种快速检测DERA酶催化效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)检测上清液中氯乙醛的含量；

(3)计算得到DERA酶的催化效率K；

K＝(A-B)/A×100％

A为反应体系中氯乙醛的初始量，B为催化反应后反应体系中氯乙醛的量；

步骤(2)中，检测上清液中氯乙醛的含量的方法，包括以下步骤：

1)取反应上清液，加入2，4-二硝基苯肼，在酸性条件下进行反应，获得样本反应液；

2)向样本反应液中加入碱液继续反应，获得样本待测液；

3)在528nm波长下测量样本待测液的吸光度，根据标准曲线计算反应上清液中氯乙醛的含量；

所述标准曲线的建立方法为：

(a)制备一组氯乙醛浓度呈梯度分布的标准品；

(c)在528nm的波长下测量标准品待测液的吸光度；

(d)根据氯乙醛浓度与吸光度绘制标准曲线。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，2，4-二硝基苯肼的终浓度为0.0025％～0.005％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，反应时间为10～30min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，加入碱液后至pH为8～9。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，反应时间为5～20min。