JP2004170392A - 残留農薬測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 比較的容易なクリーンアップ工程で農作物中からの農薬成分の精製・抽出を行った測定溶液について、帰属農作物により変化する因子を補正するためのデータベースと、被検農薬毎に変化する因子を補正するためのデータベースと、被検農薬毎のコリンエステラーゼ阻害能に関するデータベースとを用意し、検出成分への影響と測定ノイズが極力少ない反応・検出系を用いてコリンエステラーゼ活性測定を行った測定結果と、理想溶液中での測定結果との比較値からミカエリス・メンテンスの動力学的処理に基づいた該農薬成分の定量計算を行う。
【選択図】 図1
Description
vnで表される酵素活性の比:R.A.(Relative activity)の逆数:R.A.−1は(3)式で表すことができ、(3)式を展開した(4)式により、未知の農薬濃度 [I] を知ることが可能となる。
(1)まず、検査対象となる農作物の抽出成分を溶解した測定溶液中と、理想溶液中とでコリンエステラーゼ活性測定を行い、被検農薬又は、被検農薬以外の成分によるコリンエステラーゼ活性変化の程度をそれぞれの測定での活性比較から、相対活性値(R.A.:Relative activity)として求める。予め、農薬を全く含まない該農作物抽出溶液中と、理想溶液中でのコリンエステラーゼの最大反応速度、ミカエリス定数の比率により決定される活性測定を行い、Lineweaver-Burk plot法による解析結果より、それぞれの溶液中での最大反応速度の比率を第1の補正係数:α及び、その時のそれぞれの溶液中でのミカエリス定数の比率により決定される第2の補正係数:βを求める。次いで、被検農薬のコリンエステラーゼ阻害能を示す定数(阻害定数:Ki)と、反応溶液中での基質の濃度とをミカエリス・メンテンス型酵素拮抗阻害の反応速度式に基づく計算式に代入することで、測定溶液中に含まれる前記農薬濃度を一時的に算出する。さらに、農作物元体からの測定溶液に至るまでの被検農薬の回収率に係る第3の補正係数:γと、農作物元体からの測定溶液に至るまでの希釈倍率とを用いて、検査対象となる農作物中に含まれるコリンエステラーゼ阻害性農薬濃度を算出する。
(2)前記コリンエステラーゼは、厳密には、アセチルコリンエステラーゼ又はブチリルコリンエステラーゼであり、該酵素の由来は特に限定されないが、好適には電気ウナギ由来のアセチルコリンエステラーゼを使用するのがよい。
(3)被検対象物質が、厳密には、アセチルコリンエステラーゼ又はブチリルコリンエステラーゼに対して高い阻害能を有するN−メチルカルバメート系殺虫剤、ホスフェート型有機リン系殺虫剤、チオノ型有機リン系殺虫剤の酸化生成物及びジチオ型有機リン系殺虫剤の酸化生成物であるコリンエステラーゼ阻害性農薬であるとよい。
(4)農作物からの該コリンエステラーゼ阻害性農薬の抽出・精製方法が、有機溶媒での抽出後、大夾雑物のろ過分離、順層クロマトグラフィーとその通過物の減圧乾固のみを施した程度の比較的簡易な前処理方法を備えるとよい。
(5)理想溶液は、コリンエステラーゼ活性測定におけるpHを、コリンエステラーゼ活性の至適pHに調整するための緩衝液と、適量な電解質のみを含むのがよい。
(6)測定溶液は、前記前処理方法により得られる減圧乾固成分を前記理想溶液により溶解し、調製するとよい。
(7)前記測定溶液中に含まれる帰属農作物由来のコリンエステラーゼの最大反応速度を変化させる成分に係り、Lineweaver-Burk plot法による解析結果により求められ、帰属農作物毎に異なる第1の補正係数:αと、帰属農作物毎に作成したαのデータベースを構築するのがよい。
(8)前記測定溶液中に含まれる帰属農作物由来のコリンエステラーゼのミカエリス定数を変化させる被検農薬以外の成分に係り、Lineweaver-Burk plot法による解析結果により求められ、帰属農作物毎に異なる第2の補正係数:βと、帰属農作物毎に作成したβのデータベースを構築するのがよい。
(9)農薬を添加した理想溶液中で、前記方法によりコリンエステラーゼ活性測定し、Dixon plots法による解析結果より得られた被検農薬のコリンエステラーゼ阻害能を示す定数:Kiと、該コリンエステラーゼ阻害性農薬毎に作成したKiのデータベースを構築するのがよい。
(10)一時的に算出された測定溶液中での該被検農薬濃度を、元体中での該濃度に補正せしめるために適用され、前記前処理方法により検査対象となる農作物から測定溶液に回収されるまでの被検農薬の回収率に係る第3の補正係数:γと、該被検農薬毎に作成したγのデータベースを構築するのがよい。
mMとなるよう添加するとよい。また、アセチルチオコリンの水溶液は、常温、照射下においても緩やかに加水分解してチオコリンとなり、発色剤との共存により自然発色するため、遮光容器に入れ5 ℃以下の冷却槽中で保存することが好ましい。
plot法による解析結果より得られた、前記アセチルコリンエステラーゼに対する種々の農薬についての阻害定数:Kiは表2のとおりである。
2 第二工程
3 第三工程
4 第四工程
5 第五工程
6 第六工程
Claims (7)
- コリンエステラーゼ活性低下の程度から農作物中に含まれるコリンエステラーゼ阻害性農薬を測定する方法において、(1)比較的簡易な前処理方法で得られる試料の抽出溶液中でコリンエステラーゼ活性測定を行い、農薬非共存下の理想溶液中で同様の測定を行った結果との比較を行うことで求まるコリンエステラーゼ活性阻害の程度示す測定値を、(2)予め求めデータベース化した帰属農作物毎に決まる第1と第2の補正係数:αとβとにより補正した数値と、(3)予め求めデータベース化した農薬毎に異なるコリンエステラーゼ阻害能を示す定数:Kiと、(4)予め求めたコリンエステラーゼの触媒特性に関する定数:Kmと、(5)測定溶液中での基質の濃度とを、ミカエリス・メンテンス型酵素の拮抗阻害反応に基づく動力学的計算式に代入することで、抽出溶液中に含まれる前記農薬濃度を一時的に算出し、さらに、(6)予め求めデータベース化した被検農薬毎に決まる第3の補正係数:γを使用して補正する技術的手段を講じることによって、農作物中に残留するコリンエステラーゼ阻害性農薬の定量分析、半定量分析を行うことを特徴とする残留農薬測定方法。
- 帰属農作物中からの前記農薬の抽出・精製方法が、有機溶媒での抽出後、大夾雑物のろ過分離、順層クロマトグラフィーとその通過物の減圧乾固のみを施した程度の比較的簡易なもので構成される前処理方法を備えてなる請求項1記載の残留農薬測定方法。
- 前記理想溶液は、測定系におけるpHをコリンエステラーゼ活性の至適pHに調整するための緩衝液と、試料に元々含まれるイオン種が測定系に混入した場合のイオン強度変化の影響を緩和するための多量の電解質を含むものを使用してなる請求項1記載の残留農薬測定方法。
- 前記抽出溶液は、前記比較的簡易な前処理方法により得られる減圧乾固成分を、前記理想溶液に溶解したものを使用してなる請求項2記載の残留農薬測定方法。
- 前記第1と第2の補正係数:αとβは、前記測定溶液中に含まれる、帰属農作物由来の被検農薬以外のコリンエステラーゼ活性を変化させる成分に係わり、帰属農作物毎にコリンエステラーゼ酵素触媒特性をLineweaver-Burk plots法による解析により調べ、データベース化したもので、αは農薬非共存下の抽出溶液中での酵素触媒反応の最大反応速度を理想溶液中での酵素触媒反応の最大反応速度で除した値で、βは農薬非共存下の抽出溶液中でのコリンエステラーゼのミカエリス定数を理想溶液中でのコリンエステラーゼのミカエリス定数で除した値とする請求項1記載の残留農薬測定方法。
- 前記第3の補正係数:γは、前記比較的容易な前処理方法により、前記コリンエステラーゼ阻害性農薬が、前記抽出溶液に回収される率を農薬毎に調べ、データベース化してなる請求項1記載の残留農薬測定方法。
- 前記農薬毎に異なるコリンエステラーゼ阻害能を示す定数は、農薬を添加した理想溶液中でコリンエステラーゼ活性測定し、Dixon plots法による解析結果より得られたものを使用してなる請求項1記載の残留農薬測定方法。
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