CN102353670A - 利用酶抑制法检测含硫蔬菜中农药残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用酶抑制法检测含硫蔬菜中农药残留的方法，步骤为：(1)制备标准溶液；(2)制备样品；(3)对照组测试：于烧杯中加入缓冲液，逐滴加入乙酸或者氢氧化钠，pH值调至9；加入酶溶液、显色剂，摇匀后于37℃放置15min；再加入底物液摇匀，用光谱仪检测在410nm波长下反应3分钟的吸光度变化值ΔA₀(4)于另一烧杯中加入含硫蔬菜样品提取液，操作同步骤(3)；用光谱仪检测在410nm波长下反应3分钟的吸光度变化值ΔA₁(5)计算酶抑制率(％)＝「(ΔA₀-ΔA₁)/ΔA₀」×100；当酶的抑制率≥50％时，表示含硫蔬菜中残留农药。本发明通过调节蔬菜样品液的pH值，消除了含硫蔬菜中硫化物对农药残留检测的干扰，可以快速、简便、准确地检测含硫蔬菜的农药残留程度，成本低廉，适用于现场检测。

Description

利用酶抑制法检测含硫蔬菜中农药残留的方法

技术领域

本发明涉及检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的方法，尤其涉及用酶抑制法检测含硫蔬菜中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的方法。

背景技术

随着人民生活水平的提高，农药在蔬菜水果中的残留问题引起了人们普遍的关注。有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂运用广泛，占到杀虫剂用量的70％以上。目前，我国有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的检测方法主要有气相色谱法、薄层色谱法和酶抑制法。色谱法定量准确，灵敏度高，但分析仪器昂贵，测定时间长，而且需要专业技术人员操作，只适用于实验室分析；薄层色谱法检测方法复杂，操作难度较大；酶抑制检测法可实现快速检测有机农药残留，因其具有检测速度快、成本低、操作简单的优点，适合现场快速检测，得到了广泛应用。酶抑制法检测农药残留的原理是：在一定的条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药是乙酰胆碱酯酶的底物乙酰胆碱的结构类似物，对胆碱酯酶催化水解的功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。利用这一特性，在酶反应实验中加入底物和显色剂观察颜色的变化或测定酶与某种特定化合物反应的物理化学信号的变化，可快速评估出蔬菜中的有机磷或氨基甲酸酯类农药残留程度。

但是，使用酶抑制法快速检测洋葱、大蒜、青葱、韭菜等含硫蔬菜中农药残留时，含硫蔬菜中的硫化物与有机磷和有机氯类农药性质相似，不易除去，会出现假阳性现象，造成误判。目前消除含硫蔬菜假阳性的方法只有加热法和微波处理法两种。加热法是将蔬菜样品提取液进行加热处理，使特殊物质发生变化，使之不再能抑制酶的活性，从而使假阳性的现象得以消除。虽然假阳性可以在一定程度上消除假阳性对检测结果的影响，但是该方法操作较复杂，且每种蔬菜的加热温度不同，不易控制，不便于现场检测的推广。

微波处理法是在处理前对样品液采用微波处理，用微波炉进行加热，通过优化微波时间，既避免产生硫化物，又能达到足够的回收率，从而消除含硫蔬菜中硫化物对残留测定的干扰。该方法与加热方法相比较简单，但是微波炉加热过程中样品液的蒸发会造成结果的不准确。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测含硫蔬菜中农药残留的方法，本发明是在酶抑制法基础上进行改进，以消除含硫蔬菜中硫化物对残留测定的干扰，达到消除假阳性的目的，从而准确、快速地检测含硫蔬菜中的农药残留。

本发明通过如下技术方案予以实现。

(1)制备标准溶液

按照国家标准配制缓冲液、显色剂、底物液和酶溶液：

pH8.0缓冲溶液的制备：将无水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾用蒸馏水溶解，无水磷酸氢二钾的质量∶磷酸二氢钾的质量∶蒸馏水的体积为12mg∶4mg∶1ml；

显色剂的制备：将二硫代二硝基苯甲酸和碳酸氢钠放入缓冲溶液中溶解，二硫代二硝基苯甲酸的质量∶碳酸氢钠的质量∶缓冲溶液的体积为10mg∶1mg∶1ml～10mg∶1mg∶2ml，置于4℃冰箱中保存；

酶溶液的制备：根据酶的活性情况，用缓冲液溶解，例如取2mg活性为265U/mg的乙酰胆碱酯酶，用100ml缓冲液溶解；

底物液的制备：按照硫代乙酰胆碱的质量∶蒸馏水的体积为8mg∶1ml～9mg∶1ml的比例配置成底物液，摇匀后置于4℃冰箱中保存、备用；

(2)制备样品

称取含硫蔬菜，去皮，称取样品，放入烧杯或提取瓶中，加入缓冲溶液，样品的质量∶缓冲溶液的体积为1g∶5ml，振荡1～2min，倒出提取液，静置3～5min，待用；

(3)对照组测试

于1只烧杯中加入缓冲液，逐滴加入乙酸或者氢氧化钠，以改变PH值到9；再加入酶溶液、显色剂，摇匀后于37℃放置15min；再加入底物液摇匀，缓冲液与酶溶液、显色剂、底物液的体积为2.5∶1∶1∶1，此时碱液开始显色反应，立即放入样品池中，用光谱仪检测在410nm波长下反应3分钟的吸光度变化值ΔA₀，记录数据；

(4)对含硫蔬菜样品农药检测

于1只烧杯中加入步骤(2)的含硫蔬菜样品提取液，其它操作与步骤(3)对照组测试相同；用光谱仪检测在410nm波长下反应3分钟的吸光度变化值ΔA₁，记录数据；

(5)计算酶抑制率，进行结果判定

按照以下标准公式进行计算：

酶抑制率(％)＝「(ΔA₀-ΔA₁)/ΔA₀」×100

其中，ΔA₀是对照组反应3分钟的吸光度变化值，ΔA₁是样品组反应3分钟的吸光度变化值；

当含硫蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50％时，表示蔬菜中含有有机磷或氨基甲酸酯类农药存在。

所述步骤(5)的含硫蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50％的样品需要重复检验2次以上。

所述步骤(5)的含硫蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50％的样品，用其它方法进一步确定具体农药品种及含量。

所述步骤(1)的底物液置于4℃冰箱中保存、备用，保存期不超过两周。

本发明的有益效果是，消除了利用酶抑制法检测含硫蔬菜农药残留的假阳性，是对酶抑制法检测农药残留的改进。经过调节待测样品液的PH值的前处理过程后，乙酰胆碱酯酶的活性不再被抑制，假阳性现象得以消除。本发明提高和扩展了酶抑制法的适用范围和准确度，对利用酶抑制法进行现场检测蔬菜农药具有推广意义。该发明可以快速、简便、准确地检测含硫蔬菜的农药残留程度，且成本低廉，适用于现场检测。

具体实施方式

下面通过对加入已知农药浓度的无公害大蒜样品提取液的农药残留检测，对本发明做进一步描述。

本发明提供的检测含硫蔬菜中农药残留的方法，是首先调节待测样品液的pH值，再利用酶抑制法检测含硫蔬菜中的农药残留，最后，根据待测样品液对乙酰胆碱酯酶的抑制率来判定是否含有有机磷和氨基甲酸酯类农药。

本发明的检测方法除调节待测样品液的PH值外，均与国标GB/T5009.199-2003相同。

实施例

一、标准溶液的制备

(1)pH8.0缓冲溶液的制备：分别取5.95g无水磷酸氢二钾与1.6g磷酸二氢钾，用500ml蒸馏水溶解。

(2)显色剂的制备：分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和15.6mg碳酸氢钠，用20ml缓冲溶液溶解，4℃冰箱中保存。

(3)酶溶液的制备：取2mg活性为265U/mg的乙酰胆碱酯酶，用100ml缓冲液溶解。

(4)底物液的制备：取50mg硫代乙酰胆碱，加6.0ml蒸馏水溶解，摇匀后置4℃冰箱中保存备用，保存期不超过两周。

二、样品制备

取无公害大蒜，去皮，称取20g，放入烧杯或提取瓶中，加入100ml缓冲溶液，振荡1～2min，倒出提取液，静置3～5min，待用。

三、加入已知农药浓度的大蒜样品提取液的农药检测

对照组测试：先于1只烧杯中加入2.5ml缓冲液，逐粒加入氢氧化钠，以改变pH值到9，再加入0.1ml酶液，0.1ml缓冲剂，摇匀后于37℃放置15min。加入0.1ml底物液摇匀，此时碱液开始显色反应，应立即放入样品池中，用光谱仪检测在410nm波长下反应3分钟的吸光度变化值ΔA₀。经实验测得ΔA₀＝2.094。

加入已知农药浓度的大蒜样品测试：取3只烧杯，先分别加入样品提取液2.5ml，再各加入100μg/ml的甲胺磷农药标液20μl、25μl、50μl，分别记为1#、2#、3#，逐粒加入氢氧化钠，以改变pH值到9，在每只烧杯分别加入0.1ml酶液，0.1ml显色剂，摇匀后于37℃放置15min。分别加入0.1ml底物液摇匀，此时碱液开始显色反应，立即放入样品池中，分别用光谱仪检测在410nm波长下反应3分钟的吸光度变化值ΔA₁，并计算酶抑制率，记录数据见表1。

表1

甲胺磷	1#	2#	3#
				吸光度变化值ΔA1	1.122	1.165	1.064
酶抑制率(％)	46.418	44.365	49.188

再分别对加入100μg/ml的乐果农药标液25μl、50μl、150μl，分别记为1#、2#、3#的无公害大蒜样品提取液和分别对加入100μg/ml的敌百虫农药标液10μl、50μl、100μl，分别记为1#、2#、3#的无公害大蒜样品提取液进行农药检测，记录在410nm波长下反应3分钟的吸光度变化值ΔA₁，并计算酶抑制率，分别记录数据见表2、表3。

表2

乐果	1#	2#	3#
				吸光度变化值ΔA1	1.092	0.957	0.805
酶抑制率(％)	47.851	54.298	61.557

表3

敌百虫	1#	2#	3#
				吸光度变化值ΔA1	1.705	1.426	0.837
酶抑制率(％)	18.577	31.901	60.012

最后，根据酶抑制率的数据进行结果判定。当大蒜提取液对酶的抑制率≥50％时，表示大蒜中含有有机磷或氨基甲酸酯类农药存在。抑制率≥50％的样品需要重复检验2次以上。对抑制率≥50％的大蒜，可用其它方法进一步确定具体农药品种及含量。对于酶的抑制率＜50％时，表示大蒜中含有有机磷或氨基甲酸酯类农药属于极微量，均在安全食用范围之内。从本实施例可以看出，按照本发明的方法检测含硫蔬菜的农药残留，甲胺磷的最低检测限为2μg/ml，乐果的最低检测限为2μg/ml，敌百虫的最低检测限为4μg/ml。

本发明通过调节样品液的pH值，消除了对含硫蔬菜假阳性的影响，与目前的酶抑制法快速检测含硫蔬菜过程中对消除硫化物对残留测定的干扰所采取的加热法和微波处理法相比，具有快速、简便、准确和成本低的优点，更加适合于现场检测。

Claims (4)

1.一种利用酶抑制法检测含硫蔬菜中农药残留的方法，具有如下步骤：

(1)制备标准溶液

按照国家标准配制缓冲液、显色剂、底物液和酶溶液：

pH8.0缓冲溶液的制备：将无水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾用蒸馏水溶解，无水磷酸氢二钾的质量∶磷酸二氢钾的质量∶蒸馏水的体积为12mg∶4mg∶1ml；

显色剂的制备：将二硫代二硝基苯甲酸和碳酸氢钠放入缓冲溶液中溶解，二硫代二硝基苯甲酸的质量∶碳酸氢钠的质量∶缓冲溶液的体积为10mg∶1mg∶1ml～10mg∶1mg∶2ml，置于4℃冰箱中保存；

酶溶液的制备：根据酶的活性情况，用缓冲液溶解，例如取2mg活性为265U/mg的乙酰胆碱酯酶，用100ml缓冲液溶解；

底物液的制备：按照硫代乙酰胆碱的质量∶蒸馏水的体积为8mg∶1ml～9mg∶1ml的比例配置成底物液，摇匀后置于4℃冰箱中保存、备用；

(2)制备样品

称取含硫蔬菜，去皮，称取样品，放入烧杯或提取瓶中，加入缓冲溶液，样品的质量∶缓冲溶液的体积为1g∶5ml，振荡1～2min，倒出提取液，静置3～5min，待用；

(3)对照组测试

于1只烧杯中加入缓冲液，逐滴加入乙酸或者氢氧化钠，以改变PH值到9；再加入酶溶液、显色剂，摇匀后于37℃放置15min；再加入底物液摇匀，缓冲液与酶溶液、显色剂、底物液的体积为2.5∶1∶1∶1，此时碱液开始显色反应，立即放入样品池中，用光谱仪检测在410nm波长下反应3分钟的吸光度变化值ΔA₀，记录数据；

(4)对含硫蔬菜样品农药检测

于1只烧杯中加入步骤(2)的含硫蔬菜样品提取液，其它操作与步骤(3)对照组测试相同；用光谱仪检测在410nm波长下反应3分钟的吸光度变化值ΔA₁，记录数据；

(5)计算酶抑制率，进行结果判定

按照以下标准公式进行计算：

酶抑制率(％)＝「(ΔA₀-ΔA₁)/ΔA₀」×100

其中，ΔA₀是对照组反应3分钟的吸光度变化值，ΔA₁是样品组反应3分钟的吸光度变化值；

当含硫蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50％时，表示蔬菜中含有有机磷或氨基甲酸酯类农药存在。

2.根据权利要求1的利用酶抑制法检测含硫蔬菜中农药残留的方法，其特征在于，所述步骤(5)的含硫蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50％的样品需要重复检验2次以上。

3.根据权利要求1的利用酶抑制法检测含硫蔬菜中农药残留的方法，其特征在于，所述步骤(5)的含硫蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50％的样品，用其它方法进一步确定具体农药品种及含量。

4.根据权利要求1的利用酶抑制法检测含硫蔬菜中农药残留的方法，其特征在于，所述步骤(1)的底物液置于4℃冰箱中保存、备用，保存期不超过两周。