CN102796803A - 一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法及该方法在果蔬农药残留快速检测中的应用,所述的在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法即在酶抑制反应后将有色的果蔬样液排走,使之不进入快速检测中的显色反应体系,从而排除果蔬本底色对最终检测结果的干扰。所述的在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法在果蔬农药残留快速检测中的应用,由于酶抑制反应、酶催化底物水解反应全部都在同一个封闭的反应器内进行,因此环境因素变化带来的影响也控制在最低限度,使得检测结果相对更准确。
Description
技术领域
本发明涉及一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法及其在果蔬农药残留快速检测中的应用,属农药残留快速检测领域。
背景技术
使用酶抑制法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留已经有50余年的历史,其基本原理是根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性。根据这一毒理学原理,目前果蔬中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测主要采用胆碱酯酶作为检测用酶,并同时采用光度法来检测该酶被抑制的程度,从而判断出样品中农药残留的高低。
然而,果蔬样品本身通常带有颜色,即本底色,为保证样品中可能含有的微量农药残留尽可能地被萃取出来,在提取样品溶液过程中一般要经过切碎、搅打等混合操作,因此果蔬样液中也会有颜色。虽然目前在光度法快速检测农药残留时,已扣除了样液颜色引起的吸光度值,但由于果蔬样液颜色较深时,可能会超过光度计的有效测量极限,即便未超极限,本底过高也会给检测带来严重干扰,导致检测结果准确度差或根本无法检测。
发明内容
本发明的目的之一为了解决上述的技术问题而提供一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法及其在果蔬中农药残留量快速检测的应用,该排除果蔬本底色干扰的方法应用后,对果蔬中农药残留量检测的准确性高,并且检测结果不受果蔬本底色的干扰。
本发明的技术方案
一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法,具体操作步骤如下:
(1)、将待测果蔬样品溶液推入固定化有农药快速检测所用酶的反应器内,于该农药快速检测所用酶的最适温度范围内进行酶抑制反应;
所述的农药快速检测所用酶为胆碱酯酶、非胆碱酯酶的B-酯酶、酪氨酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶或乙酰乳酸合酶;
其中所述的胆碱酯酶可为乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶;
其中农药快速检测所用酶在反应器中的固定化方法可以采用物理吸附、包埋、共价结合、交联或两种以上固定化方法的结合使用,如:吸附+交联、吸附+包埋等;本发明的实施例中仅以物理吸附中的离子交换吸附或共价结合中碳二亚胺法进行举例,但并不限于其他的固定化方法在本发明中的应用;
(2)、步骤(1)中酶抑制反应完成后将足量的缓冲液持续推入该固定化有农药快速检测所用酶的反应器,将经酶抑制反应后的果蔬样品溶液持续带出固定化有农药快速检测所用酶的反应器至废液池,直至待测果蔬样品溶液颜色全部被带走为止,从而实现了排除果蔬农药残留快速检测中果蔬本底色的干扰。
上述的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法在果蔬农药残留快速检测中的应用,具体包括如下步骤:
(1)、将待测果蔬样品溶液推入固定化有农药快速检测所用酶的反应器内,于农药快速检测所用酶的最适温度范围内的某个恒定温度下进行酶抑制反应;
所述的固定化有农药快速检测所用酶的反应器,该反应器可以实现液体自由进出反应器,而固定化的农药快速检测所用酶不能流出反应器;
所述的农药快速检测所用酶为胆碱酯酶、非胆碱酯酶的B-酯酶、酪氨酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶或乙酰乳酸合酶;
其中所述的胆碱酯酶可为乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶;
所述的待测果蔬样品溶液的制备过程如下:
切碎的果蔬按料液质量体积比1:1-5加入磷酸盐缓冲液混合,在室 温下搅拌,经过滤后获得的滤液即为待测果蔬样品溶液;
(2)、步骤(1)酶抑制反应后将足量的磷酸盐缓冲液持续推入该固定化有农药快速检测所用酶的反应器,将经酶抑制反应后的果蔬样品溶液带出固定化有农药快速检测所用酶的反应器至废液池,直至待测果蔬样品溶液颜色全部被带走为止,而固定化的农药快速检测所用酶留在反应器中;
(3)、步骤(2)果蔬样品溶液颜色全部被带走后,将底物推入固定化有农药快速检测所用酶的反应器中,于农药快速检测所用酶的最适温度范围内进行酶催化水解反应;
(4)、步骤(3)酶催化水解反应完成后推入适量磷酸盐缓冲液,将固定化有农药快速检测所用酶的反应器中酶催化水解反应产生的产物全部带出至显色池中,加入显色剂与其进行显色反应后,测定吸光度值A3;
(5)、将等比例的磷酸盐缓冲液和显色液推入显色池混合,作为空白对照,测得吸光度值A1;
待测果蔬样品溶液和对照样液都使用该吸光度值作为空白对照吸光度;
(6)、用等量的磷酸盐缓冲液代替待测果蔬样品溶液作为对照样液,重复上述步骤(1)至步骤(4),测定显色池中的显色反应后所得的对照样液的吸光度值A2;
(7)、通过上述的测定结果,计算农药快速检测所用酶的抑制率,并根据国标GBT5009.199-2003进行判断农药超标或符合标准
抑制率=[(A2-A1)-(A3-A1)]/(A2-A1)*100%;
其中,A1为空白对照的吸光度值;
A2为对照样液的吸光度值;
A3为待测果蔬样品溶液最终经显色反应后的吸光度值。
另外,本发明仅以农药快速检测所用的乙酰胆碱酯酶为例,应用本发明的在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法在果蔬农药残留量快速检测方面进行应用。但并不限制其他适用于农药快速检测所用的非胆碱酯酶的B-酯酶、酪氨酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶或乙酰乳酸合酶等酶应用本发明的在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法在果蔬农药残留量快速检测方面的应用,只是在使用其他适用于农药快速检测所用的非胆碱酯酶的B-酯酶、酪氨酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶或乙酰乳酸合酶等酶时,对于其作用的底物及显色所用的显色液,缓冲液等都要根据所用的酶进行相应的调整,但整个机理是一致的。
本发明的有益技术效果
本发明的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法,由于是将果蔬残留农用检测所用的酶进行固定化后再进行酶抑制反应,并且在酶抑制反应后用足量的缓冲液持续推入该固定化有农药快速检测所用酶的反应器,将酶抑制反应后的样品溶液带出固定化有农药快速检测所用酶的反应器,因此使得样品溶液本底色即随之被带走,并进一步的到达了避免果蔬本身颜色对农药残留量快速检测过程中后续检测结果的影响。
进一步,本发明的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法在果蔬农药残留快速检测中,由于通过酶抑制反应后,将待测的果蔬样液排空,使样液脱离与底物的水解反应及显色反应产物的接触,因此由于含有残留农药的待测样品溶液颜色物质与最终反应产物完全被物理隔离,可完全排除待测果蔬样液本身颜色对检测结果的干扰。
进一步,本发明的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法在果蔬中农药残留量快速检测中的应用,由于酶抑制反应、酶催化底物水解反应全部都在同一个封闭的反应器内进行,因此环境因素变化带来的影响也控制在最低限度,使得检测结果相对更准确。
具体实施方式
下面通过实施例,对本发明进一步详细描述,但不用来限制本发明的范围。
所述方法如无特别说明,均为常规方法。所述材料如无特别说明,均能从公开商业途径购买得到。
本发明的各实施例中所用的试剂的配制如下:
1、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液:按每升计算,分别取11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸二氢钾,用蒸馏水溶解后并定容至1000mL即可;
2、显色剂溶液:分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和15.6mg碳酸氢钠,用20mL,pH8.0的磷酸盐缓冲溶液溶解,4℃冰箱中保存;
3、底物溶液:取25.0mg硫代乙酰胆碱,加3.0mL蒸馏水溶解,摇匀后置4℃冰箱中保存备用,保存期不超过两周;
4、乙酰胆碱酯酶溶液:根据酶的活性情况,用pH8.0的磷酸盐缓冲溶液溶解,3min的吸光度变化值应控制在0.3以上。摇匀后置4℃冰箱中保存备用,保存期不超过四天。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进一步阐述,但并不限制本发明。
实施例1
一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法,下面仅以本底色较深的生菜举例进行说明,具体操作步骤如下:
(1)、将5ml待测生菜样品溶液推入固定化有乙酰胆碱酯酶的反应器内,于35℃下进行15min的酶抑制反应;
所述的固定化有乙酰胆碱酯酶的反应器中酶在反应器中的固定化过程如下:采用离子交换吸附将乙酰胆碱酯酶固定在40-60目的大孔径阳离子交换树脂颗粒D113(安徽皖东树脂科技有限公司)上,然后装载于反应器内;或采用碳二亚胺法将乙酰胆碱酯酶直接固定在活化后的反应器内表面上;
所述的反应器为直径为6mm,高度为30mm的圆柱体,两端装有带有滤网的塞子;
所述的待测生菜样品溶液的制备过程如下:
将生菜样品(经气相色谱检测没有有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的生菜)切成1cm左右见方碎片,用精确度为0.01g电子台秤称取样品2.0g,加入10.0mLpH8.0磷酸缓冲溶液,振荡搅拌1~2min,静置3~5min,经四层纱布或棉花过滤后,获得待测生菜样品溶液;
(2)、将足量的pH8.0磷酸盐缓冲液持续推入该固定化有乙酰胆碱酯酶的反应器,将酶抑制反应后的生菜样品溶液带出反应器至废液池,生菜样品溶液的颜色也随之被带走,从而到达了生菜农药残留快速检测中排除生菜本底色干扰的效果。
应用实施例1
将实施例1所述的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法应用于生菜农药残留快速检测中,具体包括如下步骤:
(1)、将5ml待测生菜样品溶液推入装有0.5g固定化乙酰胆碱酯酶的圆柱体反应器内,于35℃下进行15min的酶抑制反应;
所述的固定化有乙酰胆碱酯酶的反应器中酶在反应器中的固定化过程如下:采用离子交换吸附将乙酰胆碱酯酶固定在40-60目的大孔径阳离子交换树脂颗粒上,然后装载于反应器内;
所述的待测生菜样品溶液的制备过程如下:
将生菜样品(经气相色谱检测没有有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的生菜)切成1cm左右见方碎片,用精确度为0.01g电子台秤称取样品2.0g,加入10.0mLpH8.0磷酸缓冲溶液,振荡搅拌1~2min,静置3~5min,过滤,获得待测生菜样品溶液;
(2)、将足量的pH8.0磷酸盐缓冲液持续推入该固定化有胆碱酯酶的反应器,将经酶抑制反应后的待测生菜样品溶液带出反应器至废液池,直至待测生菜样品溶液的颜色也随之全部被带走;
(3)、步骤(2)待测生菜样品溶液的颜色被全部带走后将0.1mL的硫代乙酰胆碱底物溶液推入固定化有乙酰胆碱酯酶的反应器中,控制温度为35℃停留3min,乙酰胆碱酯酶催化硫代乙酰胆碱底物发生水解反应;
(4)、步骤(3)乙酰胆碱酯酶催化底物水解反应结束后,将3ml的pH8.0的磷酸盐缓冲液持续推入到固定化有乙酰胆碱酯酶的反应器中,步骤(3)固定化的乙酰胆碱酯酶催化底物发生水解反应产生的底物的水解产物则被磷酸盐缓冲液带出固定化有乙酰胆碱酯酶的反应器并进入到显色池中;
同时将0.1mL二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)显色液推入到显色池中与上述的乙酰胆碱酯酶催化底物发生水解反应产生的底物的水解产物进行显色反应,待显色反应3min后,于412nm处用722s分光光度计(上海悦丰仪器仪表有限公司)测定吸光度值A3为0.855;
(5)、将3ml的pH8.0的磷酸盐缓冲液和0.1ml的二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)显色液溶液分别推入显色池混合,作为空白对照,于412nm处测得吸光度值A1为0.060;
(6)、用5ml的pH8.0的磷酸盐缓冲液代替待测生菜样品溶液作为对照样液,重复上述步骤(1)至步骤(4),于412nm处测定显色池中的显色反应后所得的对照样液的吸光度值A2为0.874;
(7)、通过上述的步骤(4)、(5)及步骤(6)的测定结果,进行计算待测生菜样品对乙酰胆碱酯酶的抑制率,并根据国标GBT5009.199-2003进行判断农药超标或符合标准;
抑制率=[(A2-A1)-(A3-A1)]/(A2-A1)*100%=(0.874-0.855)/(0.874-0.060) *100%=2.33%;
根据GBT5009.199-2003标准判断,该待测生菜样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留未超标,与气相色谱的阴性结果吻合。
由此可见,本发明的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法在生菜农药残留快速检测中应用后,由于有效地排除了待测生菜样品溶液本身颜色干扰,因此可以快速地得到更准确的结果。
对照实施例1
采用国家标准GB/T5009.199-2003快速检验方法,对生菜农药残留快速检测,步骤如下:
待测生菜样品溶液的制备同实施例2;
取2.5mL待测生菜样品溶液放入试管中,加入0.lmL乙酰胆碱酯酶液、0.1mL DTNB显色剂,摇匀后于37℃放置15min,之后加入0.lmL硫代乙酰胆碱底物摇匀,在412nm下记录初始吸光度A1为1.076,反应3min时的吸光度A2为1.439,由于本底过高,其吸光度变化仅为0.363;用2.5mL缓冲溶液替代样液获得对照溶液反应3min的吸光度变化为0.865=0.930-0.065,因此计算抑制率=(0.865-0.363)/0.865=58.03%,根据GB/T5009.199-2003标准判断,抑制率>50%,该样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留超标,这与气相色谱的阴性检测结果不吻合,此为假阳性。
通过上述的实施例2的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法在生菜农药残留快速检测中应用后与气相色谱检测及采用国家标准GB/T5009.199-2003快速检验方法进行检测的结果对比分析可知,本发明的一种在果蔬农药残留快速检测中排除本底色干扰的方法应用于生菜农药残留快速检测中,由于其排除了生菜样品本身颜色的干扰,从而使得测定结果更精确。
另外,本发明的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法仅给出了在生菜农药残留快速检测中的应用,但并不限于此,本发明可以适用于其他果蔬样品,特别是具有本底色的果蔬样品,且特别是本底色较深的果蔬样品中农药残留量的快速检测。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法,其特征在于具体包括如下步骤:
(1)、将待测果蔬样品溶液推入固定化有农药快速检测所用酶的反应器内,于该农药快速检测所用酶的最适温度范围内进行酶抑制反应;
所述的农药快速检测所用酶为胆碱酯酶、非胆碱酯酶的B-酯酶、酪氨酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶或乙酰乳酸合酶;
其中所述的胆碱酯酶为乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶;
所述的固定化有农药快速检测所用酶的反应器,该反应器可以实现液体自由进出反应器,而固定化的农药快速检测所用酶不能流出反应器;
(2)、将足量的缓冲液持续推入该固定化有农药快速检测所用酶的反应器,将步骤(1)进行酶抑制反应后的果蔬样品溶液持续带出固定化有农药快速检测所用酶的反应器至废液池,直至待测果蔬样品溶液颜色全部带走为止。
2.如权利要求1所述的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法,其特征在于所述的固定化有农药快速检测所用酶的反应器中的农药快速检测所用酶在反应器中的固定化方法如下:
采用离子交换吸附将农药快速检测所用酶固定在40-60目的大孔径弱酸性离子交换树脂颗粒上,然后装载于反应器内;
或采用碳二亚胺法将农药快速检测所用酶直接固定在活化后的反应器内表面上。
3.如权利要求1所述的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法,其特征在于所述的待测果蔬样品溶液的制备过程如下:
切碎的果蔬按料液质量体积比1:1-1:5加入pH与农药快速检测所用酶相适应的磷酸盐缓冲液混合,在室温下搅拌,过滤后获得的滤液即为待测果蔬样品溶液。
4.如权利要求1、2或3所述的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法在果蔬农药残留快速检测中的应用。
5.如权利要求1、2或3所述的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法在果蔬农药残留快速检测中的应用,其特征在于具体包括如下步骤:
(1)、将待测果蔬样品溶液推入固定化有农药快速检测所用酶的反应器内,于农药快速检测所用酶的最适温度范围内进行酶抑制反应;
(2)、将足量的磷酸盐缓冲液持续推入该固定化有农药快速检测所用酶的反应器,并持续将步骤(1)酶抑制反应后的样品溶液带出固定化有农药快速检测所用酶的反应器至废液池,直至待测果蔬样品溶液颜色全部带走为止;
(3)、步骤(2)待测果蔬样品溶液颜色全部带走后将底物推入固定化有农药快速检测所用酶的反应器中,于农药快速检测所用酶的最适温度范围内进行酶催化水解反应;
(4)、步骤(3)酶催化水解反应完成后推入磷酸盐缓冲液,将固定化有农药快速检测所用酶的反应器中酶催化水解反应产生的产物全部带出至显色池中,加入显色剂与其进行显色反应后,测定吸光度值A3;
(5)、将等比例的磷酸盐缓冲液和显色液推入显色池混合,作为空白对照,测得吸光度值A1;
(6)、用等量的磷酸盐缓冲液代替待测果蔬样品溶液作为对照样液,重复上述步骤(1)至步骤(4),测定显色池中的显色反应后所得的对照样液的吸光度值A2;
(7)、通过上述的测定结果,计算农药快速检测所用酶的抑制率,并根据国标GBT5009.199-2003进行判断农药超标或符合标准;
抑制率=[(A2-A1)-(A3-A1)]/(A2-A1)*100%;
其中,A1为空白对照的吸光度值;
A2为对照样液的吸光度值;
A3为待测果蔬样品溶液最终经显色反应后的吸光度值。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121128 |