CN102304558A

CN102304558A - 一种流动注射固定化酶抑制分析方法

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Publication number: CN102304558A
Application number: CN201110150051A
Authority: CN
Inventors: 郑艺华; 刘君; 马永志
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2011-05-25
Filing date: 2011-05-25
Publication date: 2012-01-04
Anticipated expiration: 2031-05-25
Also published as: CN102304558B

Abstract

本发明提供一种流动注射固定化酶抑制分析方法，利用具有循环回路的流动注射固定化酶分析系统，依据底物过量的酶反应进程曲线，得到有环境污染物抑制和无环境污染物抑制的响应信号差及其下降的过渡时刻两参数，参照标准关系曲线分析得到环境污染物的待测浓度；本发明的分析方法简便快速、自动化程度高、有效减少人为干扰，并能甄选和校正固定化酶；应用在存在抑制的酶促反应分析，尤其是农药残留、重金属等环境污染物的现场监测分析具有优势。

Description

一种流动注射固定化酶抑制分析方法

技术领域

本发明专利涉及一种酶抑制分析方法，尤其是用于分析环境污染物的流动注射固定化酶抑制分析方法，属于分析检测领域。

背景技术

环境污染物对环境的影响日趋严重，尤其以农药残留(有机磷和氨基甲酸脂类农药等)和重金属(汞、铜、铅等)等已成为危害人类健康的重大隐患，对这些环境污染物进行有效的检测和监控具有非常重要的现实意义。

目前，环境污染物常用的检测方法有色谱法、酶抑制法等。比较而言，酶抑制法准确性高、快速方便、检测速度快、操作简单、成本低，广泛应用于现场的定性和半定量测定，并已上升为国家标准(GB/T 18630-2002蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法酶抑制法)。酶抑制法是利用环境污染物作为酶抑制剂的性质，通过酶被环境污染物抑制的程度来分析，即通过检测抑制前后酶活度的变化，进而判断环境污染物是否存在以及含量。

已知的酶抑制分析方法使用相对抑制率来对环境污染物进行间接描述：

I = \frac{(E_{0} - E)}{E_{0}} \times 100 % = \frac{(V_{0} - V)}{V_{0}} \times 100 % - - - (1)

式中I为相对抑制率，％；E₀为无环境污染物抑制时的酶活度；E为某一浓度环境污染物抑制的酶活度。V₀为无环境污染物抑制时的酶促反应响应；V为某一浓度环境污染物抑制的酶促反应响应。

基于已知的酶抑制分析方法，目前已有相关专利公开和授权(有机磷杀虫剂浓度的测定方法，中国专利，200510038059.0；酶抑制剂的分析方法与模块，中国专利，200510089748.4；酶抑制剂的分析装置与方法，中国专利，200610092331.8；定量分析酶抑制剂的检测装置及方法，200610144572.2；乳中农药残留的快速检测方法，中国专利，200710085390.7)。已知酶抑制分析方法对环境污染物的分析流程大同小异，可根据设定的相对抑制率的阈值进行环境污染物阳性的判断；如果使用事先制定的环境污染物浓度-相对抑制率的标准关系，也可得到环境污染物的量；按照相对抑制率的定义，为了分别得到有无环境污染物的酶促反应响应信号，均需重复测试分析。

固定化酶提高了酶的稳定性，并且可回收和重复使用，在生物、化工及环境等领域广泛应用，流动注射固定化酶分析方法是流动注射分析中发展比较成熟的技术，基于相对抑制率的流动注射固定化酶抑制分析方法，已出现了许多实用化的系统。以已知的采用参比消除干扰、用于农药残留检测的流动注射固定化酶抑制分析方法为例(用于有机磷农药残留快速检测的酶法量热式流动注射分析检测仪.仪器仪表学报，2005，26(7)：733-737；探测农药残留用的量热式生物传感器，01253887.6；以同种失活酶作参比的农药残留酶法检测方法及其装置，02137683.2)，其反应酶柱和参比酶柱分别放置同批次对农药敏感的固定化酶，但参比酶柱中的固定化酶已被大剂量的农药人工钝化、失活，作为参比消除非特异性干扰，其分析方法包括下列步骤：第一步系统首先引入定量底物，进行酶促反应测试，得到无抑制的响应热信号；第二步反应酶柱定时间通入样液，此时反应酶柱中的固定化酶与样液接触而被抑制；第三步是重复第一步的流程以得到抑制后的响应热信号；最后基于得到的有无抑制状态的响应热信号，按式(1)数据处理后得到相对抑制率，进一步与农药残留浓度-相对抑制率的标准关系比较得到农药残留的量。此分析方法虽可实现自动流程处理，但检测过程包含重复步骤，需多次切换流路、稳定基线及更换试剂，流程复杂、耗时长、易引入干扰，并且为消除非特异性干扰，参比酶柱中放置的是已人工钝化、失活的固定化酶，需单独制备，消耗了额外的时间和成本，携带不便，对现场检测应用尤为不利。

发明内容

本发明提供一种简便快速、基于酶抑制的流动注射固定化酶分析方法，能精简分析流程，节约测试时间，提高自动化程度，有效减少人为干扰来源；并且检测和参比采用同批次的固定化酶，同样能消除非特异性干扰，进一步节省时间和经济成本；另外，本发明的分析方法通过获知固定化酶的初始酶活度，能甄选固定化酶并校正酶活度的波动。

本发明提出一种流动注射固定化酶抑制分析方法，该方法的原理为：根据酶促反应理论，对于底物-酶反应体系，当起始底物浓度[S]₀远大于酶的米氏常数K_m，即存在[S]₀＞＞K_m，其典型的酶促反应进程曲线如图1所示，开始时酶促反应按零级反应规律进行，此阶段的反应速度与底物浓度无关，是与酶活度对应的常数，反应速度在图1表现为不随时间变化的水平线，随酶促反应的进行，底物不断消耗，底物浓度[S]逐渐减少，反应速度开始受底物的制约和影响，在时刻T，酶促反应由零级反应向一级反应过渡，反应速度随底物浓度[S]的减少逐渐下降，如图1所示斜线，相同反应条件下等酶活度的酶对底物的消耗程度随时间的变化相同，固定反应条件及初始底物的浓度和量，则酶促反应由零级反应向一级反应过渡的时刻仅由酶活度决定，即图1中曲线由水平线开始向斜线转变的过渡时刻T关联酶活度，并且存在如图3所示的不同过渡时刻和初始酶活度的对应关系，当存在环境污染物时，固定化酶被抑制，酶活度下降，相同反应条件下，同量的底物水解需要更多地时间，故酶促反应由零级反应滞后进入一级反应区域，过渡时刻T将增大。另外，在相同反应条件下，酶促反应的响应信号与反应速度成正比，即响应信号随时间的变化也符合上述酶反应进程规律，图2示意了相同反应条件下有抑制和无抑制的酶促反应进程曲线，图中有抑制和无抑制的响应信号差为ΔV＝V_u-V_i，此响应信号差ΔV与环境污染物抑制引起的酶活度差成正比，并存在如图4所示不同初始酶活度固定化酶时的响应信号差-环境污染物浓度标准关系。另外，无抑制的酶促反应进程曲线中的过渡时刻T_u小于有抑制的酶促反应进程曲线对应的过渡时刻T_i，在过渡时刻T_u，V_u率先下降导致响应信号差ΔV减少，则过渡时刻T_u能被确定，结合过渡时刻-初始酶活度标准关系和响应信号差-环境污染物浓度标准关系，可得到环境污染物的浓度。进一步举例说明，假定酶被一定浓度的环境污染物抑制后，以未抑制的酶作参比，得到有环境污染物抑制和无环境污染物抑制的响应信号差为ΔV₃，并且ΔV₃在过渡时刻T₃下降，则可以根据图3所示过渡时刻-初始酶活度的标准关系得到过渡时刻T₃对应酶的初始酶活度为E₃，然后根据图4所示响应信号差-环境污染物浓度的标准关系，得到在初始酶活度为E₃的条件下，响应信号差ΔV₃对应的环境污染物浓度为C，即根据酶促反应进程曲线得到有环境污染物抑制和无环境污染物抑制的响应信号差ΔV₃及其下降的过渡时刻T₃两参数，参照标准关系分析得到环境污染物的待测浓度为C。

为实现发明目的，基于上述原理，本发明的技术方案为：采用具有循环回路的流动注射固定化酶分析系统，其反应器的流出液能通过循环流路重新流入反应器，从而在进行分析时，反应底物能循环流过反应器持续进行酶促反应，系统采用检测和参比两个回路，两回路为孪生结构，检测反应器和参比反应器中放置对环境污染物敏感的同批次固定化酶(例如，可以使用乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、鸡肝脂酶作为对农药敏感的酶进行农药残留检测，使用脲酶作为对重金属敏感的酶进行重金属测试)，并设置恒温器，保证酶促反应在设定温度进行，在一定流量、温度、pH等分析条件下，使用检测器(例如，热传感器、光传感器等)全程监测检测反应器和参比反应器的响应信号差，分析方法包括下列步骤：第一步，检测回路和参比回路分别通入样液和缓冲液，并循环流过检测反应器和参比反应器一定时间，对检测反应器中的固定化酶进行予抑制，样液中含有的待测环境污染物是酶的抑制剂，故检测反应器中的固定化酶受抑制而活度下降，则检测反应器和参比反应器中固定化酶的活度存在差异，酶活度的差异反映了样液中的待测环境污染物对酶的抑制程度；第二步，检测回路和参比回路同时引入定量、定浓度的过量底物，并且底物的初始浓度大于或等于固定化酶米氏常数的100倍，底物循环流过检测反应器和参比反应器持续进行酶促反应，检测器得到检测反应器和参比反应器的响应信号差，此响应信号差与检测反应器和参比反应器中固定化酶的活度差异成正比，判断检测反应器和参比反应器中的响应信号差开始下降的时刻并作为过渡时刻，如果得到的过渡时刻过大或不能得到有效的过渡时刻，则说明本批次的固定化酶已失效，需更换不同批次的固定化酶重新进行分析；最后根据上述步骤得到的检测反应器和参比反应器中的响应信号差及其过渡时刻两参数进行数据处理和分析，通过参照过渡时刻-初始酶活度的标准关系得到过渡时刻对应的固定化酶的初始酶活度，参照响应信号差-环境污染物浓度的标准关系得到此初始酶活度下检测反应器和参比反应器响应信号差对应的待测环境污染物的浓度，数据处理和分析过程可以通过计算机或单片机同步自动完成。

在本发明的分析方法中，过渡时刻-初始酶活度的标准关系是指相同分析条件下，变换不同初始酶活度的固定化酶(已知初始酶活度)，重复上述分析步骤(第一步和第二步)得到对应过渡时刻的数据，进一步得到的过渡时刻-初始酶活度的关系，其中第一步中检测回路通入的是缓冲液，参比回路通入的是含大剂量环境污染物的样液，其循环流过参比反应器对其中的固定化酶进行一定时间的予抑制，使参比反应器中的固定化酶人工钝化、失活。

在本发明的分析方法中，响应信号差-环境污染物浓度的标准关系是指相同分析条件下，变换不同环境污染物浓度的样液(已知环境污染物浓度)，重复上述分析步骤(第一步和第二步)得到对应响应信号差的数据，进一步得到的响应信号差-环境污染物浓度的关系，其中检测反应器和参比反应器中放置的同批次固定化酶的初始酶活度为已知。

本发明的有益效果是：无需重复测试，流程简单、节省时间，且自动化程度高，不易引入人为干扰；制作和储存等原因，不同批次的固定化酶活度会存在一定偏差，本发明的分析方法能较好实现修正，并排除失效的固定化酶批次；由于检测和参比均使用同批次固定化酶，能消除非特异性干扰。

附图说明

图1示意了酶促反应进程曲线

图2示意了有抑制和无抑制反应时酶促反应进程曲线

图3示意了过渡时刻-初始酶活度标准关系

图4示意了不同初始酶活度时响应信号差-环境污染物标准关系

图5显示了敌敌畏分析时，不同过渡时刻与初始酶活度的标准关系

图6显示了初始酶活度为1.38U/g时，敌敌畏浓度与热电动势信号的标准关系

具体实施方式

如前述，本发明提供一种流动注射固定化酶抑制分析方法，用于分析环境污染物。籍由以下用来分析样品中敌敌畏农药含量的范例来说明本发明之内容，而非限制本发明之范围。

使用具有循环回路的量热式生物传感器分析测定样品中有机磷农药敌敌畏的浓度，量热式生物传感器系统具备孪生的检测回路和参比回路，检测反应器和参比反应器为Ф7×60mm的圆柱形反应器，其中放置同批次的固定化鸡肝脂酶，流量为1.5mL/min，反应温度设定在37℃，使用pH 6.4、0.025M的柠檬酸缓冲液，通过引入200mM的底物，检测反应器和参比反应器中持续发生酶促反应。

系统进行样品分析前，事先制定标准关系。制定过渡时刻-初始酶活度标准关系，系统运行在上述分析条件，稳定工况下，首先参比反应器和检测反应器中分别循环通入含100mg/L敌敌畏的样液和缓冲液5分钟，使参比反应器中的固定化酶被人工钝化、灭活；然后检测回路和参比回路同时引入2mL底物，循环流过检测反应器和参比反应器，作为检测器的热电堆得到检测反应器和参比反应器间的热电动势，当热电动势开始下降时，记录酶促反应持续的时间作为过渡时刻；通过变换不同酶活度的固定化酶，重复上述步骤，得到对应的过渡时刻，以此制定相应的过渡时刻-初始酶活度的标准关系，如图5所示。制定环境污染物浓度-响应信号差的标准关系，使用一定初始酶活度的固定化酶，系统运行在上述分析条件，稳定工况下，首先检测反应器和参比反应器中分别循环通入含已知敌敌畏浓度的样液和缓冲液5分钟；然后检测回路和参比回路同时引入2mL底物，循环流过检测反应器和参比反应器，作为检测器的热电堆得到检测反应器和参比反应器间的热电动势；通过变换不同敌敌畏浓度的样液，重复上述步骤，得到对应的热电动势，以此制定出相应的环境污染物浓度-响应信号差的标准关系；改变固定化酶的初始酶活度，重复得到不同初始酶活度固定化酶下环境污染物浓度-响应信号差的标准关系。图6给出了为使用初始酶活度为1.38U/g的固定化鸡肝酯酶，敌敌畏浓度与热电动势信号的标准关系。

使用本发明的方法分析样品中敌敌畏农药含量，系统运行在上述分析条件，稳定工况下，首先检测反应器和参比反应器中分别循环通入含待测敌敌畏的样液和缓冲液5分钟；然后检测回路和参比回路同时引入2mL底物，循环流过检测反应器和参比反应器，作为检测器的热电堆得到检测反应器和参比反应器间的热电动势，当热电动势开始下降时，记录酶促反应持续的时间作为过渡时刻，如过渡时刻大于1000秒，或者得不到有效的过渡时刻，则说明本批次的固定化酶已失效，需更换不同批次的固定化酶重新进行分析；最后根据得到的过渡时刻，参照过渡时刻-初始酶活度标准关系得到对应的初始酶活度，以此初始酶活度作为限制条件，根据得到的热电动势，参照环境污染物浓度-响应信号差的标准关系得到对应的敌敌畏浓度。采用本方法分析样品中的敌敌畏，结果表明在0.01～0.5mg/L的浓度范围具有较好的线性关系，检测限达到0.05mg/L，满足0.2mg/L的国家标准，整个分析测试时间小于20分钟。

Claims

1.一种流动注射固定化酶抑制分析方法，采用具有循环回路的流动注射固定化酶分析系统，反应底物能循环流过反应器持续进行酶促反应，系统采用检测和参比两个回路，两回路为孪生结构，检测反应器和参比反应器中放置对环境污染物敏感的同批次固定化酶，在一定流量、温度、pH等分析条件下，使用检测器全程监测检测反应器和参比反应器的响应信号差，其特征在于，该分析方法包括下列步骤：

(a)检测回路和参比回路分别通入样液和缓冲液，并循环流过检测反应器和参比反应器一定时间，对检测反应器中的固定化酶进行予抑制；

(b)检测回路和参比回路同时引入定量、定浓度的过量底物，底物循环流过检测反应器和参比反应器持续进行酶促反应，检测器得到检测反应器和参比反应器的响应信号差，判断检测反应器和参比反应器响应信号差开始下降的时刻并作为过渡时刻；

(c)通过参照过渡时刻-初始酶活度的标准关系得到过渡时刻对应的固定化酶的初始酶活度，参照响应信号差-环境污染物浓度的标准关系得到此初始酶活度下检测反应器和参比反应器中的响应信号差对应的待测环境污染物的浓度。

2.如权利要求1所述的一种流动注射固定化酶抑制分析方法，其特征在于，步骤(b)中使用的过量底物的初始浓度大于或等于固定化酶米氏常数的100倍。

3.如权利要求1所述的一种流动注射固定化酶抑制分析方法，其特征在于，步骤(c)中使用的过渡时刻-初始酶活度的标准关系是指相同分析条件下，变换不同初始酶活度的固定化酶(已知初始酶活度)，重复分析步骤(a)(b)得到对应过渡时刻的数据，进一步得到的过渡时刻-初始酶活度的关系，其中步骤(a)中检测回路通入的是缓冲液，参比回路通入的是含大剂量环境污染物的样液，其循环流过参比反应器对其中的固定化酶进行一定时间的予抑制，使参比反应器中的固定化酶人工钝化、失活。

4.如权利要求1所述的一种流动注射固定化酶抑制分析方法，其特征在于，步骤(c)中使用的响应信号差-污染物浓度的标准关系是指相同分析条件下，变换不同环境污染物浓度的样液(已知环境污染物浓度)，重复分析步骤(a)(b)得到对应响应信号差的数据，进一步得到的响应信号差-环境污染物浓度的关系，其中检测反应器和参比反应器中放置的同批次固定化酶的初始酶活度为已知。

5.如权利要求1所述的一种流动注射固定化酶抑制分析方法，其特征在于，步骤(c)可以通过计算机或单片机同步自动完成。