CN101082599B

CN101082599B - 酶抑制剂的分析装置与方法

Info

Publication number: CN101082599B
Application number: CN2006100923318A
Authority: CN
Inventors: 林岳晖; 沈燕士
Original assignee: Apex Biotechnology Corp
Current assignee: Apex Biotechnology Corp
Priority date: 2006-06-01
Filing date: 2006-06-01
Publication date: 2010-10-13
Anticipated expiration: 2026-06-01
Also published as: CN101082599A

Abstract

本发明提供水溶液中酶抑制剂的分析装置与方法，包含电极试片与电化学检测仪，其中电极试片系仅供使用者进行单次分析。本发明亦可用来检测蔬果中的农药残留量。

Description

酶抑制剂的分析装置与方法

技术领域

本发明涉及一种酶抑制剂之分析装置与方法，尤其涉及以电化学分析法来检测酶抑制剂类型之农药。

背景技术

习知分析蔬果中农药残余量的方法有很多种，例如分光光度法、原子吸收光谱法、薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法、核磁共振波谱法、荧光法等，其中以气相色谱法和液相色谱法较为常用，因其具有良好的再现性、灵敏度、且可确定农药品种之优点。然而，此等方法均需专业技术人员在实验室进行大量试液的配制，无法简便地在农作物产地、市场、量贩超市等一般消费者的采购场所，由未经严格训练的人员进行快速的分析。

近年来已发展出利用生化反应及电化学技术来检测酶抑制剂类型之农药的方法，例如Gordon等人之美国专利(US6,406,876)及Marazuela等人所发表之论文(M.D.Marazuela，M.C.Moreno-Bondi，Anal.Chim.Acta，374(1998)19)，其所揭示之固定化酶技术不需要大量试液的配制。然而，固定化酶之缺点在于制造程序复杂成本高，且电极保存条件相当严谨，故必需由专业人员来进行分析。

因此，有必要提出一种新颖的方析装置及方法，免除习知严谨的技术要求，而可方便一般非专业人员在任意场所使用。

发明内容

利用一般农药具抑制酶活性的特性，本发明系提供一种简便的酶抑制剂分析方法与装置，以判断待测样品中农药的含量。

本发明包含提供第一酶、用以催化第一化合物的生化反应。第一酶的催化能力可被酶抑制剂所抑制，故观察第一酶被抑制程度的变化(即生化反应变慢的程度)，即可推算酶抑制剂的含量。本发明测量第一酶被抑制之程度包含：提供第三化合物与上述生化反应之产物(第二化合物)反应，以产生可进行电化学反应的第四化合物。然后，观察第四化合物所引发的电流变化而间接测得此生化反应变慢的程度，由此计算出酶抑制剂的含量。

本发明在一方面提供一种酶抑制剂的分析方法，包含：(a)提供单次分析剂量的第一酶；(b)提供第一样品，包含已知含量之酶抑制剂，酶抑制剂能抑制第一酶的催化能力；(c)提供电极试片，电极试片上直接涂有单次分析剂量的第一化合物；(d)混合第一酶与第一样品以形成溶液，并将溶液移转至电极试片上以使第一酶与第一化合物接触；(e)施加电压于电极试片上，并测量电流定义为第一活性量；(f)提供含未知含量之酶抑制剂的第二样品，以第二样品取代第一样品进行上述(a)至(d)之步骤，并测量电流定义为第二活性量；(g)藉由第一活性量与第二活性量以决定第二样品中酶抑制剂的含量。

本发明在另一方面提供一种酶抑制剂分析装置，包含：电极试片，其具有绝缘基板及仅含单次分析剂量的第一化合物，第一化合物直接覆盖在绝缘基板上；以及微处理器，与电极试片相连；当使用者将待测样品及第一酶与第一化合物接触时，将产生电流讯号，微处理器能处理电流讯号，以分析待测样品中抑制第一酶之酶抑制剂的含量。

此外，本发明还包含，于每次分析时，使用干燥形式呈现的各种单次分析剂量之试剂，此可免除多种大量试液的配置。而且，本发明之酶抑制剂分析方法与装置，更可用于判断样品中农药的是否含量超出门坎值。

附图说明

图1显示本发明的一实施例。

图2显示本发明含温度控制组件的一实施例。

图3显示本发明含温度补偿模块的一实施例。

图4显示依据本发明之方法所测得活性量对酶抑制剂浓度之图表。

主要组件符号说明

100 分析装置 110 容器

120 电化学检测仪 121 电极试片

122 微处理器 123 显示器

124 绝缘基板 125 电极系统

126 反应区 E₁ 第一酶

E₂ 第二酶 I 第一化合物

II 第二化合物 III 第三化合物

IV 第四化合物 B 缓冲盐类

200 温度控制组件 300 温度补偿模块

310 温度计 320 温度补偿处理韧体

具体实施方式

如前述，本发明提供一种分析装置及方法，用以分析水溶液中所含之酶抑制剂。由于一般农药具酶抑制剂成分，所以本发明可用来侦测样品中农药的含量。换言之，本发明可用于分析具有酶抑制剂的农药，其类型包含但不仅限于有机磷、以溴水处理过之硫代有机磷及氨基甲酸盐。

藉由以下范例说明本发明的各种化学试剂及其反应原理，应了解此范例系为解说本发明之内容，而非限制本发明之范围。

本发明所含之化学试剂包含：

第一化合物I：一种会进行水解反应的化合物，例如乙酰胆碱(Acetylcholine，以下简称为ACh)。

第二化合物II：为第一化合物I的水解产物。若第一化合物为ACh，第二化合物II即为胆碱(Choline)。

第一酶E₁：用于催化第一化合物I之水解反应，例如乙酰胆碱酯酶(简称AChE)。

第三化合物III：通常为氧化剂，用于氧化第二化合物II(即水解反应的产物)的氧化反应，并生成第四化合物IV与内胺盐(betaine)。第三化合物III的范例为氧分子(O₂)或铁氰化物Fe(CN)₆ ^3-。

第四化合物IV：用于产生电子，即施加合适之电压于第四化合物IV会产生电子。举例而言，若第三化合物III为氧分子(O₂)，第四化合物IV即为过氧化氢(H₂O₂)；若第三化合物III为铁氰化物(Fe(CN)₆ ^3-)，第四化合物IV即为亚铁氰化物(Fe(CN)₆ ^4-)。

第二酶E₂：用于催化第二化合物II之氧化反应，例如胆碱氧化酶(简称ChOx)。第二酶E₂系视需要使用。详言之，若此氧化反应之速率很慢而导致第二化合物II之浓度随时间产生明显的增加时，才需要使用第二酶E₂。

本发明所列举之范例涉及以下化学反应：

Figure DEST_PATH_G06192331820070918D000011

Figure DEST_PATH_G06192331820070918D000012

H₂O₂(IV)→H₂O+e^-

上述之第三化合物(III)若改为铁氰化物(Fe(CN)₆ ^3-)，则本发明之化学反应可如下所示，其中第一化合物I应为硫代乙酰胆碱酯(Acetylthiocholine，简称为ATC)，第二化合物II应为硫代胆碱(Thiocholine(II))。铁氰化物(Fe(CN)₆ ^3-)与硫代胆碱的反应产物为亚铁氰化物(Fe(CN)₆ ^4-)及二硫基双胆碱(Dithio-bis-(choline))：

Figure DEST_PATH_G06192331820070918D000013

Figure DEST_PATH_G06192331820070918D000014

(Fe(CN)₆ ^4-)(IV)→(Fe(CN)₆ ^3-)+e^-

由上述之反应式可知，施加适当之还原电压于第四化合物IV即可产生电流。然后，观察电流的变化可获得第四化合物IV的生成速率。如上述，由于第二化合物II氧化第三化合物III以形成第四化合物IV之氧化还原反应为快速进行的反应，故第四化合物IV的生成速率可代表第二化合物II的生成速率。因此，若提供含已知浓度之第一化合物I的标准样品进行反应，即可测得第二化合物II生成速率的标准值。由此可知，当测量含第一酶抑制剂的待测样品时，其所获得之第二化合物II生成速率应会低于此标准值，此乃因为第一酶E₁的催化能力受到第一酶抑制剂的抑制所致。由此，藉由观察第二化合物II生成速率的变化，即第四化合物IV生成速率的变化，便可得知待测样品中所含第一酶抑制剂的含量。应注意本发明之酶抑制剂系针对第一酶E₁，而非第二酶E₂。

本发明之原理已说明如上。以下详细说明本发明之装置与方法。如图1所示，分析装置100包含容器110及电化学检测仪120。容器110供盛装待测溶液。容器110内可视需要涂有单次分析剂量的第一酶E₁。电化学检测仪120包含电极试片121、微处理器122、及显示器123。电极试片121包含绝缘基板124；电极系统125，置于绝缘基板之上；以及反应区126，其上涂有单次分析剂量的第一化合物I及第二酶E₂、或视需要涂上第三化合物III(显示于图2及图3)。反应区126连接至电极系统125，电极系统125与微处理器122相连，微处理器122再连接至显示器123。因此，当使用者将第一酶E₁移转到反应区，使第一化合物I与第一酶E₁接触引发上述之反应，进而产生电流讯号时，电极系统125会将所侦测到的电流讯号传给微处理器122进行处理，然后藉由显示器123将结果显示出来。应注意，上述之化学试剂可直接涂布在容器110内侧表面或绝缘基板124之表面上，而且，在未反应前，均以干燥形式呈现并分别仅含单次分析剂量。电极试片121不能重复使用，反应完毕后即可抛弃。容器110或电极试片121所含之化学试剂并非以上述为限，使用者可视需要加入任何添加剂、如指示剂、缓冲盐类、表面活性剂等。这些添加剂也可涂布在容器110内，如图1所示之缓冲盐类B。

此外，第三化合物III除可为上述之固态，亦可为一种气体，例如氧气。当使用氧气作第三化合物III时，可于大气平衡环境下，直接利用空气中的氧气进行反应。或者，也可另外用藉由输送管给予适当量的氧气。

图2显示本发明之分析装置100可包含温度控制组件200，供控制反应区126的温度，使反应可在恒温状态下进行。图3则显示本发明分析装置100更可具有温度补偿模块300，包含温度计310及设定在微处理器122内的温度补偿处理韧体320。温度补偿模块300可用来感测上述化学反应实际进行之温度与理想反应温度之间差异，并依此计算此差异所造成之误差，其结果可呈现于显示器123上。

本发明之分析方法包含：

(a)提供第一样品，含有已知含量之第一酶抑制剂。已知含量包含零。

(b)混合第一样品与第一酶E₁，以形成水溶液。例如，可将此第一样品置入涂有第一酶E₁的容器中，并使其均匀混合。或者，第一酶E₁也事先放置于其它器皿，例如胶囊，使用时再直接倒入容器中与第一样品混合。第一酶E₁之含量为单次分析剂量。

(c)将此水溶液移转至电极试片121上以进行反应。如前述，电极试片121上涂有干燥的第一化合物I、第二酶E₂、及视需要的第三化合物III(例如K₃Fe(CN)₆)。若第三化合物III为氧气，则可利用空气中的氧气进行反应，或另外用藉由输送管给予适当量的氧气。同样的，电极试片121上的第一化合物I、第二酶E₂、及视需要之第三化合物III之含量也均为单次分析剂量。

(d)施加特定之电压于电极试片121上。例如第四化合物IV为H₂O₂时，电压为700mV，第四化合物IV为Fe(CN)₆ ^4-时，电压为为300mV。

(e)测量第四化合物IV所引发的电流，定义为第一活性量。使用者可在不同温度下分别测量多个第一样品，以取得各种状况下的第一活性量，以作为后续之定量分析使用。图4即显示在25℃下，数个第一样品所产生之第一活性量与其已知酶抑制剂含量的关系图。图4之信息可存于电化学检测仪之内存中供微处理器使用。

(f)提供第二样品，含有未知含量之第一酶抑制剂。第二样品可为浸泡过蔬果的水溶液。

(g)以第二样品取代第一样品进行(a)至(d)之步骤，并测量第四化合物IV所引发的电流，定义为第二活性量。

(h)比较第二活性量与第一活性量，以求得第二样品之第一酶抑制剂含量。可直接将第二活性量与第一活性量输入微处理器中进行处理，并将结果显示在显示器上。

(i)丢弃电极试片121。应注意此电极试片121不可重复使用。若所使用容器110也附有单次剂量的第一酶E₁，也应一并丢弃不可重复使用。

以下实施例说明一般使用者使用本发明之装置的方法。换言之，本发明可供不熟悉化学分析技术之人员使用，如下之实例。

实施例1

如图1所示，将待测样品倒入容器110中，充分摇晃使其均匀混合以形成水溶液。启动电化学检测仪120，将此水溶液滴入电极试片120之反应区126。电化学检测仪120将自动施予合适电压并同时测量反应所引发之电流，微处理器122计算待测样品中农药的含量，其结果以定量方式呈现于显示器123上。使用过之电极试片121予以丢弃。

实施例2

如图3所示，将待测样品倒入容器110中，并加入置放在胶囊内的药粉(含单次分析剂量的AChE与缓冲盐类B)，充分摇晃使其均匀混合以形成水溶液。启动电化学检测仪120，将此水溶液滴入电极试片121之反应区126。电化学检测仪120将自动测量反应所引发之电流并输入微处理器122。微处理器122会依据温度补偿模块300计算反应实际进行时之温度与理想温度的差异，并依此计算此差异所造成之误差，再将结果以图形或灯号呈现于显示器123上。使用过之电极试片121予以丢弃。

藉由以上较佳实施例之详述，系希望能更加清楚说明本发明之技术特征与精神，而上述所揭露的较佳实施例并非用以限制本发明之范围。相反地，该较佳实施例及其各种变更或均等性之安排，皆属本发明所欲受到保护之范围。因此，本发明所申请之专利范围应根据上述说明作最宽广的解释，并涵盖所有可能之变更与均等性之安排。

Claims

1.一种酶抑制剂的分析方法，包含：

(a)提供涂有单次分析剂量的第一酶于一容器内，该第一酶为干燥形式；

(b)提供第一样品，包含已知含量之酶抑制剂，该酶抑制剂能抑制该第一酶的催化能力；

(c)提供电极试片，该电极试片上直接涂有单次分析剂量的第一化合物；

(d)将该第一样品置入涂有该第一酶的该容器以混合该第一酶与该第一样品而形成溶液，并将该溶液移转至该电极试片上以使该第一酶与该第一化合物接触；

(e)施加电压于该电极试片上，并测量电流定义为第一活性量；

(f)提供含未知含量之该酶抑制剂的第二样品，以该第二样品取代该第一样品进行上述(a)至(d)之步骤，并测量电流定义为第二活性量；

(g)藉由该第一活性量与该第二活性量，以决定该第二样品中该酶抑制剂的含量。

2.如权利要求1所述之方法，其中该第一酶与该第一化合物之接触将产生第二化合物。

3.如权利要求2所述之方法，还包含提供单次分析剂量的第三化合物，用以与该第二化合物反应以生成第四化合物，该电压使该第四化合物产生电流。

4.如权利要求3所述之方法，还包含提供单次分析剂量的第二酶，用以催化该第三化合物与该第二化合物的反应。

5.如权利要求3所述之方法，还包含将该第三化合物直接涂布在该电极试片上。

6.如权利要求4所述之方法，还包含将该第二酶直接涂布在该电极试片上。

7.如权利要求1所述之方法，其中该酶抑制剂选自有机磷、以溴水处理过之硫代有机磷及氨基甲酸盐。

8.如权利要求1所述之方法，其中该第一化合物为乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)，该第一酶为乙酰胆碱酯酶(AChE)。

9.如权利要求1所述之方法，其中该(a)步骤还包含缓冲盐类，该缓冲盐类为干燥形式涂布在该容器内。

10.如权利要求3所述之方法，其中该第三化合物为氧，系由大气环境提供。

11.如权利要求3所述之方法，其中该第三化合物为铁氰化物。

12.一种酶抑制剂分析装置，包含：

电极试片，包含绝缘基板、及仅含单次分析剂量的第一化合物，该第一化合物直接覆盖在该绝缘基板上；

一容器，内涂有单次分析剂量的第一酶，该第一酶为干燥形式；及

微处理器，与该电极试片相连；

当使用者将待测样品及该第一酶与该第一化合物接触时，将产生电流讯号，该微处理器能处理该电流讯号，以分析该待测样品中抑制该第一酶之酶抑制剂的含量，且该容器在使用后丢弃不可重复使用。

13.如权利要求12所述之装置，其中该第一酶与该第一化合物之接触将产生第二化合物。

14.如权利要求13所述之装置，还包含单次分析剂量的第三化合物直接覆盖在该电极试片上，该第三化合物用以与该第二化合物反应以生成第四化合物，该电流讯号系该第四化合物所产生。

15.如权利要求14所述之装置，还包含提供单次分析剂量的第二酶直接覆盖在该电极试片上，该第二酶用以催化该第三化合物与该第二化合物的反应。

16.如权利要求12所述之装置，其中该第一化合物为乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)，该第一酶为乙酰胆碱酯酶(AChE)。

17.如权利要求14所述之装置，其中该第三化合物为铁氰化物。

18.如权利要求12所述之装置，还包含温度控制组件。

19.如权利要求12所述之装置，还包含温度补偿模块。

20.一种酶抑制剂的分析方法，包含：

(a)提供单次分析剂量的第一酶于一胶囊内，该第一酶为干燥形式；

(b)提供一样品，包含已知含量的酶抑制剂，该酶抑制剂能抑制该第一酶的催化能力；

(d)将该样品置入一容器，将该胶囊中的该第一酶倒入该容器中以混合该第一酶与该样品而形成溶液，并将该溶液移转至该电极试片上以使该第一酶与该第一化合物接触；及

(e)施加电压于该电极试片上，并测量电流定义为第一活性量。

21.如权利要求20所述之方法，其中该(a)步骤还包含提供缓冲盐类于该胶囊中。

22.一种酶抑制剂的分析方法，包含：

(b)提供一样品，包含已知含量之酶抑制剂，该酶抑制剂能抑制该第一酶的催化能力；

(d)将该第一样品置入涂有该第一酵素的该容器以混合该第一酶与该第一样品而形成溶液，并将该溶液移转至该电极试片上以使该第一酶与该第一化合物接触；

(f)丢弃该容器。