CN102507470B - 联用酶反应过程分析法和终点平衡法测定酶底物量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种联用终点平衡法和酶反应动力学过程分析法处理酶反应过程数据测定酶底物量的方法；连续记录的酶反应曲线中相邻数据间信号变化超过仪器噪声两倍者为有效数据；测定加入少量酶液前的检测信号，校正酶液稀释效应得校正后起点信号；酶反应曲线中有效数据不多于7个或校正后起点信号与所记录最后数据之差绝对值小于仪器噪声50倍时用终点平衡法确定反应终点信号，有效数据多于七个、校正后起点信号与所记录最后数据之差绝对值大于仪器噪声50倍且底物消耗比例达到要求时用酶反应过程分析法预测反应终点信号；用校正后起点信号与反应终点信号之差的绝对值为测量指标，据标准品响应曲线确定待测底物浓度；该方法适用于可连续监测的不可逆酶反应体系。
Description
技术领域
本发明涉及用于临床检验、卫生检验等领域酶法分析测定酶底物量的数据处理方法；其特征是独立测定加入酶启动反应前的检测信号为未校正起点信号，校正随后加入的工具酶溶液稀释效应得到校正后起点信号；据连续监测酶反应曲线中有效数据量、底物消耗比例和校正后起点信号与所记录最后信号之差绝对值三个特征选择用终点平衡法还是用酶反应过程分析法分析数据确定反应终点信号，以校正后起点信号和反应终点信号之差为反应体系底物消耗造成的检测信号净变化；优化工具酶活性、记录酶反应曲线的时间和记录间隔，使不高于终点平衡法线性上限90％底物浓度对应酶反应曲线可用反应过程分析法预测反应终点信号，即两种数据分析方法可测线性范围存在交叉；两种数据分析方法建立反应体系检测信号净变化对底物浓度响应完全相同，就使得两种方法的线性响应线段连成更宽的线性相应范围；其应用优势是保障高分析效率且工具酶消耗低成本的条件下可测线性范围更宽，而此前的所有酶法分析测定底物的数据方法在相同实验测定条件下的可测线性范围都较窄。
背景技术
酶法分析测定底物量广泛用于临床检验和卫生检验等领域。经典酶法分析测定底物量主要有两种方法学，需对应的信号测量和数据处理方法[见Clinica Chimica Acta，1980，105(3)：351-360；Methods of Enzymatic Analysis，Vol.I.Fundamentals(3rd Ed.By Bergmeyer，H.U.1983，ISBN 978-3527260416，Wiley VCH，Weinheim，Germany)；Microchimica Acta，2009，164(1)：1-6]。第一种是终点平衡法，其分别测定启动酶反应前反应体系的检测信号和酶反应完全后反应体系的检测信号，以二者之差为酶反应消耗底物造成的检测信号净变化(附图1)，而且这种检测信号净变化同待测底物浓度成正比。第二种是经典动力学法，其利用底物浓度较低时初速度同底物浓度成正比，测定不同样品在相同工具酶作用下初速度推测对应底物浓度。终点平衡法的优点是实验设计和数据处理方法简单，对多种干扰因素有抗性；其缺点是工具酶用量很大才能保障分析效率和可测线性范围。经典动力学法优势是分析效率很高，但干扰因素多结果可靠性低，且可测上限受到工具酶米氏常数的限制。这些经典酶法分析方法都不够满意，实践中还需可测范围宽、效率高、成本低、抗干扰能力强的酶法分析新方法。
最近报道了一类不依赖于酶反应初速度的酶法分析动力学新方法，称为酶反应动力学过程分析法或动力学过程分析法[Analytical Bioanalytical Chemistry，2003，375(6)：756-762；Journal of Medical Colleges of PLA，2005，20(6)：338-344；Journal of Zhejiang University ScienceB，2006，7(6)：497-502；西安交通大学学报医学版，2006，27(3)：300-303；Analytical Sciences，2007，23(4)：439-444；Microchimica Acta，2009，164(1)：1-6]。该动力学过程分析法依赖于连续监测酶反应曲线；用以反应时间为自变量的积分速度方程经过恰当数据转换后非线性最小二乘拟合酶反应曲线预测反应终点信号而不直接实验测定反应终点信号；独立测定启动酶反应前的起点信号，以二者之差为酶反应消耗底物造成的检测信号净变化。该方法属于动力学方法，分析效率高且可测上限很高，工具酶用量少而对酶活性变化及其抑制剂干扰有抗性；工具酶活性越高则在保障分析效率的条件下可测上限越高；其可测上限可高于工具酶米氏常数的几倍，也可高于仪器直接测量的最大检测信号对应的可测底物浓度；可用于存在明显产物抑制作用的工具酶反应体系，明显优于酶法分析测定底物的经典动力学方法。
在酶反应过程中，检测信号变化大于仪器噪声2倍以上的数据才属于有效数据。这种酶反应过程分析法预测反应终点信号的方法属于曲线拟合测定参数，其要求有足够量有效数据且被分析数据中底物消耗比例高于设定界限才能可靠测定参数。在此酶反应动力学过程分析法中，为保障可测上限则工具酶活性不能太低，常用记录间隔难以很短(一般为10秒左右以便多体系平行自动分析)，为保障单个样品分析效率工具酶反应时间不能太长，这些要求造成当缺乏足够有效数据用于分析时此新动力学方法不能用。所以，酶反应动力学过程分析法测量底物的下限远高于终点平衡法，这限制了此新动力学方法测定底物的实用性。另一方面，当被分析酶反应曲线中起点和终点检测信号净变化太小时，仪器噪声相对比例太大，酶反应动力学过程分析法预测反应终点信号的精度很低，这也是其明显的缺点之一。
此酶反应动力学过程分析法测定底物量需反应起点信号和反应终点信号用于获得酶作用下反应体系检测信号净变化，其所需检测信号的指标与终点平衡法所用指标完全相同，但其通过分析工具酶反应完成前数据预测反应终点信号而不是直接实验测定反应终点信号。所以，其可用较低的工具酶活性和较短的反应记录时间获得很高的待测底物浓度可测上限。终点平衡法直接测定工具酶反应完成后信号，故需要尽可能高的工具酶活性才能保障分析效率和可测上限，但无论如何其可测上限不可能超过仪器直接测量信号的上限。分析适量工具酶作用恰当时间后的酶反应过程数据，此酶反应动力学过程分析法测定高浓度底物有明显优势，而终点平衡法测定低浓度底物有最明显优势。所以，优化实验条件连续监测工具酶反应过程，当来自反应曲线的有效数据量、底物消耗比例和反应体系检测信号净变化都满足此酶反应动力学过程分析法测定底物含量的要求时，可预测反应终点信号而不直接实验测定反应终点信号；当缺乏足够有效数据时实际上工具酶反应已经完成，就可用终点平衡法直接测定反应终点信号；只要反应体系检测信号净变化大于仪器噪声的50倍，通过酶反应动力学过程分析法测定酶底物量能有合理的精度；优化工具酶用量和反应时间可使终点平衡法线性上限对应的反应体系检测信号净变化大于仪器噪声50倍。任何分析方法的线性测量范围都有限故线性响应部分是线段而非直线；优化工具酶用量和/或酶反应时间，使得酶反应动力学过程分析法和终点平衡法的线性测量范围存在交叉，两种方法就可联用测定酶底物含量(附图2)，从而用较低工具酶活性和较短记录时间，获得比单用任一方法处理数据都更宽的线性响应范围。
这种联用策略对相同工具酶催化下不同样品对应的反应曲线，可据反应曲线中数据特征选择用终点平衡法还是反应过程分析法确定反应终点信号；对任一实验反应曲线只需要一种数据分析方法而不需要同时用两种方法分析；两种数据处理方法联用显著拓宽了线性范围。
为简化酶反应动力学过程分析方法预测反应终点信号，需将多底物反应体系中非待测底物的浓度设置在最高待测底物浓度的10倍以上，既促进反应不可逆进行，又可简化反应为单底物，便于获得所需以反应时间为自变量的积分速度方程用于酶反应动力学过程分析预测反应终点信号。对于涉及多个工具酶的反应体系，通常将除了待测底物以外的其它底物或辅助底物浓度设置在待测底物浓度最大值的10倍以上，然后列出所有工具酶参与反应的微分速度方程或米氏方程，用迭代数值积分计算模拟设定参数下的工具酶反应曲线；用不同参数组合计算的模拟酶反应曲线最小二乘拟合实验测定的酶反应曲线；对应最佳拟合的参数组合中的反应终点信号就是所需参数。因此，此联用策略对偶联酶反应体系也适用。
发明内容
本发明目的是联用终点平衡法和酶反应过程分析法，据连续监测工具酶反应曲线中数据特征判断是否可用酶反应动力学过程分析预测反应终点信号。本发明的技术方案可采用固定反应时间和记录酶反应曲线的间隔，优化工具酶活性使在终点平衡法上限80％左右底物浓度下的酶反应曲线适合用酶反应过程分析法预测反应终点信号；也可固定所用工具酶活性而延长反应时间，使得在终点平衡法上限80％左右底物浓度下的酶反应曲线适合用酶反应过程分析法预测反应终点信号。显然，第一种策略成本高而第二种策略效率低；实践中可根据工具酶成本考虑采用何种策略优化条件以实现两种数据处理方法的联用。
此联用方法关键是使得两种方法测定底物浓度的线性范围存在交叉区域；当通过优化工具酶活性或监测工具酶反应时间实现两种方法联用后，其应用特征在于：
(一)、取一定量所需缓冲液加入试管或比色杯或可连续监测酶反应过程仪器的样品池内，在其中加入待测底物样品；混匀后在20～37℃恒温5～10分钟；
(二)、将浓度优化的工具酶溶液或偶联的工具酶溶液，在同样温度下恒温3～7分钟；
(三)、如步骤(一)所得溶液在试管中则将其尽可能完全转移到比色杯或可连续监测酶反应仪器样品池；记录样品池中溶液的光吸收或相应检测信号为未校正起点信号；当检测与底物浓度成正比信号时，此未校正起点信号包含来自待测底物和本底的信号；当检测与产物浓度成正比信号时，此未校正起点信号为来自待测样品的本底信号；
(四)、在步骤(三)中已经测量未校正起点信号的样品池内溶液中直接加入步骤(二)中预热的一定量工具酶溶液，立即混匀得到工具酶反应体系；
(五)、延迟10～20秒，以1～60秒间隔监测步骤(四)所得酶反应体系与底物或产物成比例的检测信号，共记录2～15分钟或能满足分析效率要求的恰当时间；
(六)、去掉相邻数据间信号变化小于仪器噪声2倍数据得到有效数据及酶反应曲线；
(七)、将单一酶单底物反应微分速度方程积分成以反应时间为自变量积分速度方程，将偶联工具酶反应的微分速度方程组用于迭代数值积分计算模拟反应曲线后最小二乘拟合实验测定反应曲线；如有底物或产物抑制则在积分速度方程中包含其抑制效应；
(八)、如所记录反应曲线中有效数据量多余七个、底物消耗比例高于酶反应过程分析法要求的下限且反应体系检测信号净变化大于仪器噪声50倍，用以反应时间为自变量的积分速度方程分析反应过程或相应微分速度方程组的迭代数值积分计算模拟反应曲线拟合实验测定反应曲线预测反应终点信号，否则用终点平衡法确定反应终点信号；如所记录反应曲线中有效数据量少于七个，则用所记录最后一个数据为反应终点信号；如所记录反应曲线中有效数据量等于七个，则用所记录最后一个信号反应终点信号；
(九)、据所用工具酶溶液和步骤(三)的样品池中溶液量计算加入工具酶对未校正起点信号的稀释效应，将未校正起点信号扣除稀释效应后即得到校正后起点信号；
(十)、测定产物信号时将步骤(八)所得反应终点信号减去步骤(九)所得校正后起点信号，测定底物信号时将步骤(九)所得校正后起点信号减去步骤(八)所得反应终点信号，得工具酶消耗底物所造成检测信号净变化；用标准品确定检测信号净变化对酶反应体系中待测标准品浓度的响应曲线并用于确定反应体系中待测底物浓度；据步骤(一)中缓冲液量、样品量和步骤(四)中工具酶溶液量换算出样品中的待测底物浓度。
本发明的关键环节是固定监测反应时间和记录间隔优化工具酶的用量，或固定工具酶用量而优化监测反应时间，使得在终点平衡法线性上限80％左右底物浓度下的酶反应曲线可用反应过程分析法预测反应终点信号，从而保障两种方法测定底物浓度的线性范围存在交叉区域而实现两种方法的联用。
附图说明
图1 记录吸收时终点平衡法所需测定的检测信号示意图
A0：启动工具酶反应前反应体系吸收；测定产物吸收信号时为非产物的其它物质吸收，测定底物吸收信号时为底物吸收和本底之和；
Am：反应完全后的最大产物吸收信号(含本底)
Ab：来自非待测底物的其它物质吸收信号或本底；
图2优化工具酶活性实现终点平衡法和反应过程分析法联用原理示意图
a.低活性工具酶时两种数据处理方法的响应曲线；
b.提高工具酶活性后两种数据处理方法的响应曲线及联用方法的实现；
□终点平衡法线性上限；○酶反应过程分析法线性下限；
图3本发明的联用方法用于芳香酯酶测定苯酚乙酸酯线性范围示意图
在25℃用1.0mmol/L苯酚乙酸酯在pH 7.4含2.0mmol/L氯化钙的50mmol/LTris-HCl缓冲液中测定270nm产物吸收增加初速度标定其活性；每分钟生成1微摩尔苯酚的酶量为一个单位；测定底物含量的缓冲液同测定酶活性；芳香酯酶固定在20U/L，此浓度芳香酯酶在270nm吸收小于0.015。反应过程分析法细节见文献AnalBioanal Chem，2003，375(6)：756-762。
图4本发明的联用方法用于醇脱氢酶测定乙醇的线性范围示意图
醇脱氢酶反应体系缓冲液、NAD+氨基脲浓度、氨基脲浓度、醇脱氢酶活性、反应温度和酶反应过程分析法预测终点吸收的方法完全参照文献(Anal Sci，2007，23(4)：439-444)；测定乙醇含量时监测反应总时间固定在15分钟。
应用实施例
实施例1：联用终点平衡法和酶反应动力学过程分析法测定苯酚乙酸酯
人血清经过85％硫酸铵沉淀，沉淀中芳香酯酶用50mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解，经相同缓冲液平衡的DEAE-纤维素离子交换层析，0.10mol/L到1.0mol/L NaCl浓度梯度洗脱纯化；苯酚乙酸酯过60目硅胶柱去除对人血清芳香酯酶有抑制作用的杂质；人血清芳香酯酶纯化后在20U/L时测定苯酚乙酸酯；其酶法分析测定苯酚乙酸酯操作步骤如下：
(一)、在试管中加入含2.0mmol/L CaCl2的50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)共0.90ml，及不同浓度的苯酚乙酸酯水溶液样品100μl，25℃水浴恒温5分钟后将上述溶液尽可能完全转移进入石英比色杯，在270nm测定未校正起点吸收；
(二)、人血清芳香酯酶溶于上述Tris-HCl缓冲液达2000U/L；酶液25℃恒温5分钟；
(三)、加入10μl芳香酯酶液到比色杯中，摇动混匀；延迟15秒，以15秒间隔连续监测270nm吸收变化，共监测5.0分钟；将最大吸收限制在1.250以内；
(四)、将与前一个记录数据相比光吸收增加不到0.002的数据去掉得到反应曲线；
(五)、据操作中液体用量计算稀释效应为1％，扣除稀释效应得到校正后起点吸收；
(六)、当校正后起点吸收与反应5.0分钟吸收相差大于0.100时用酶反应过程分析法预测反应终点吸收，芳香酯酶的米氏常数固定为0.86mmol/L，产物相对于底物的消光系数固定在1.31(mmol/L)-1·cm-1；当校正后起点吸收与反应5.0分钟吸收相差小于或等于0.100时用反应5.0min吸收为反应终点吸收；计算每个待测样品或标准品对应的检测信号净变化；
(七)、用标准品测定吸收净变化对苯酚乙酸酯的响应；单用终点平衡法或酶反应过程分析法、用本发明的联用方法所得响应曲线如附图3；据标准曲线所得苯酚乙酸酯水解过程中的毫摩尔消光系数为1.30(mmol/L)-1·cm-1，与设定值一致；
(八)、用标准曲线计算所用未知浓度样品对应反应体系的苯酚乙酸酯浓度；反应体系中的浓度乘以10.1就换算为样品中的苯酚乙酸酯浓度；
(九)、所述条件下，终点平衡法测定苯酚乙酸酯线性上限对应吸收净变化约0.130，对应苯酚乙酸酯终浓度约为0.10mmol/L，其线性下限对应吸收净变化接近0.013，相当于0.010mmol/L苯酚乙酸酯；酶反应动力学过程分析法的线性下限对应吸收净变化接近0.100，相当于约0.080mmol/L苯酚乙酸酯，但线性上限对应吸收净变化大于1.700，对应反应体系苯酚乙酸酯超过1.30mmol/L；用本发明的联用方法分析数据，可测线性范围从0.010mmol/L到1.30mmol/L苯酚乙酸酯，该线性范围显著宽于单用任一数据处理方法。
实施例2：联用终点平衡法和酶反应动力学过程分析法测定乙醇
所用醇脱氢酶反应缓冲液为0.20mol/L焦磷酸钠(含75.0mmol/L氨基脲，pH 9.2，NAD+终浓度为3.0mmol/L；详细设置全同文献Anal Sci，2007，23(4)：439-444)；所用Sigma公司的酵母醇脱氢酶(A7011)终浓度为50U/L；当用酶反应过程分析法预测反应终点吸收时数据处理方法完全同文献(Anal Sci，2007，23(4)：439-444)；其应用中代表性操作步骤如下：
(一)、在试管中加入上述含NAD+焦磷酸钠缓冲液1.380ml及样品100μl，25℃水浴恒温5分钟后将上述溶液尽可能完全转移进入石英比色杯，在340nm测定未校正起点吸收；
(二)、将酵母醇脱氢酶用上述焦磷酸钠缓冲液稀释到3750U/L后25℃恒温5分钟；
(三)、加入20μL恒温后的酵母醇脱氢酶到比色杯中，摇动混匀；延迟15秒，以15秒间隔连续监测340nm吸收变化，共监测15.0分钟；将最大吸收限制在1.300以内；
(四)、将与前一个记录数据相比光吸收增加不到0.002的数据去掉得到反应曲线；
(五)、据操作中液体用量计算稀释效应为1.4％，扣除稀释效应得到校正后起点吸收；
(六)、当校正后起点吸收与反应15.0分钟吸收相差大于0.150时用酶反应过程分析法预测反应终点吸收，设定NADH毫摩尔消光系数约为6.31(mmol/L)-1·cm-1，所需醇脱氢酶动力学参数和中间产物乙醛稳态浓度近似方程完全参照文献(Anal Sci，2007，23(4)：439-444)；当校正后起点吸收与反应15.0分钟吸收相差小于或等于0.150时用反应15.0min吸收为反应终点吸收；计算每个待测样品或标准品的吸收净变化；
(七)、用标准品测定吸收净变化对乙醇的响应；单用终点平衡法或酶反应过程分析法、用本发明的联用方法所得响应曲线如附图4；据标准曲线所得NADH毫摩尔消光系数为6.29(mmol/L)-1·cm-1，与设定值一致；
(八)、用标准曲线计算所用未知浓度样品对应反应体系的乙醇浓度；反应体系中的浓度乘以15.0就换算为样品中的乙醇浓度；
(九)、所述条件下终点平衡法线性上限的吸收净变化约0.200，对应乙醇终浓度约0.030mmol/L，其线性下限对应吸收净变化接近0.012，相当于0.002mmol/L乙醇；酶反应动力学过程分析法线性下限对应吸收净变化接近0.120，相当于0.020mmol/L乙醇，线性上限对应吸收净变化约1.860，接近0.30mmol/L乙醇；用本发明的联用方法分析数据，可测线性范围从0.002mmol/L到0.30mmol/L乙醇，该线性范围显著宽于单用任一数据处理方法。
Claims (4)
1.一种测定酶底物量的联用方法，其特征是根据每条酶反应曲线中数据特征选择用酶反应过程分析法或终点平衡法分析酶反应数据，并按如下步骤进行：
(一)、取一定量所需缓冲液加入试管或用于连续监测酶反应过程所用仪器的样品池中，在其中加入待测底物样品；混匀后在20～37℃恒温5～10分钟；
(二)、预定酶溶液的加样量小于步骤(一)中样品和缓冲液合计体积的2％；将酶溶液在20～37℃恒温3～7分钟；
(三)、如步骤(一)所得含样品的混合溶液在试管中则将其尽可能完全转移到用于连续监测酶反应过程所用仪器的样品池中；记录样品池中溶液的光吸收或相应检测信号为未校正起点信号；当检测信号与待测底物浓度成正比时，此未校正起点信号包含来自待测底物和本底的信号；当检测信号与产物浓度成正比时，此未校正起点信号为来自待测样品的非待测物质产生的本底信号；
(四)、在步骤(三)中已测量未校正起点信号样品池内溶液中，直接加入步骤(二)中预热的酶溶液，立即混匀得到酶反应体系；
(五)、延迟10～20秒，以1～60秒固定间隔检测上述酶反应体系中与底物或产物成正比的信号，共记录2～15分钟或满足效率要求的合适时间；
(六)、将与前一个记录数据相比光吸收变化不到0.002的数据去掉，所得剩余数据为有效数据并构成反应曲线；测量光吸收的仪器噪声设为0.001；
(七)、将单一酶单底物反应微分速度方程积分成以反应时间为自变量的积分速度方程；在上述酶反应的积分速度方程中，如底物或产物有抑制作用则应包含在所用速度方程中；
(八)、当所记录反应曲线中有效数据量不多于七个或未校正起点信号与所记录终点信号之差的绝对值小于仪器噪声的50倍时，用终点平衡法确定反应终点信号；当反应曲线中有效数据量多于七个、未校正起点信号与所记录终点信号之差的绝对值大于仪器噪声50倍且待测底物消耗比例高于酶反应过程分析法要求的下限即底物消耗比例40％时，用酶反应过程分析法预测反应终点信号；当反应曲线中有效数据量多于七个、未校正起点信号与所记录终点信号之差的绝对值大于仪器噪声的50倍但待测底物消耗比例低于酶反应过程分析法要求的下限时，反应体系待测底物浓度超出该联用方法测定酶底物量的线性范围；
(九)、据步骤(四)中酶溶液和步骤(三)样品池中溶液量计算加入酶溶液的稀释效应对未校正起点信号的影响，将步骤(三)中所得未校正起点信号扣除稀释效应后获得校正后起点信号；
(十)、将步骤(八)所得反应终点信号减去校正后起点信号得酶作用下产物增加所造成的检测信号净变化；将校正后起点信号减去反应终点信号得酶作用下底物消耗所造成的检测信号净变化；用标准品确定检测信号净变化对酶反应体系中待测底物浓度的响应曲线，此响应曲线用于确定反应体系中来自样品的待测底物浓度；据步骤(一)中缓冲液、样品和步骤(四)中酶溶液的用量换算出样品中的待测底物浓度。
2.据权利要求1所述测定酶底物量的联用方法，其特征在于：
(一)、权利要求1中步骤(四)所加入的酶溶液体积小于步骤(一)中样品和缓冲液合计体积总和的2％；
(二)、据权利要求1中步骤(一)和步骤(四)酶溶液用量产生的稀释效应校正起点信号；如权利要求1中步骤(一)样品和缓冲液合计1.0毫升而步骤(四)中加入酶溶液量为5.0微升，对所得未校正起点信号的稀释系数为0.5％，即将此未校正起点信号乘以0.995得到校正后起点信号；如权利要求1中步骤(一)所用样品量加上缓冲液量合计为1.0毫升但步骤(四)中加入酶溶液量为10.0微升，对未校正起点信号的稀释系数为1％，即将此未校正起点信号乘以0.99得到校正后起点信号；其余酶溶液用量下的稀释效应及校正计算则类推。
3.据权利要求1所述测定酶底物量的联用方法，其特征在于：
(一)、酶反应过程分析法预测反应终点信号时选择反应曲线中达到稳态反应的第一个数据为起点而所记录的最后数据为终点进行分析；酶反应过程分析法中以待测底物初始浓度或最大产物浓度及酶活性为未知参数，预测其反应终点信号至少需七个有效数据且酶反应体系检测信号净变化需大于仪器噪声的50倍；当酶反应曲线中有效数据量少于七个时，表明到记录终点时酶反应完全即待测底物消耗完全，故所记录的最后信号就是反应终点信号；
(二)、当有效数据量及待测底物消耗比例满足要求后用校正后起点信号和所记录最后信号之差的绝对值来选择所需数据分析方法；用待测底物标准品确定酶反应体系检测信号净变化大于仪器噪声50倍的终点平衡法测定该待测底物浓度的线性上限；用终点平衡法线性上限对应检测信号净变化的80％～90％为参考值；校正后起点信号和所记录最后信号之差绝对值大于此参考值选用酶反应过程分析法分析数据，小于或等于此参考值则用终点平衡法分析数据；
(三)、当校正后起点信号和所记录最后信号之差绝对值大于仪器噪声50倍且有效数据量多于七个时，以终点附近三个数据对应平均速度为终点瞬时速度，起点附近三个数据的平均速度为起点瞬时速度，以终点瞬时速度除以起点瞬时速度表示待测底物终点浓度相对于待测底物起点浓度的比例；在单底物酶及偶联酶反应体系，用酶反应过程分析法预测反应终点信号对待测底物消耗比例的最低要求是待测底物终点浓度或终点瞬时速度对待测底物起点浓度或起点瞬时速度的比值应小于60％，即待测底物消耗比例需大于40％；
(四)、酶反应时间、酶活性及记录间隔优化目标是使待测底物起点浓度达到终点平衡法测定该待测底物浓度的线性上限80％时所记录的酶反应曲线中待测底物最大消耗比例大于40％；固定酶反应总时间为10分钟且记录间隔为10秒，逐步提高酶活性使待测底物起点浓度达到终点平衡法测定该待测底物浓度线性上限80％对应的反应曲线中待测底物最大消耗比例大于40％，或固定酶活性而逐步延长反应时间使待测底物起点浓度达到终点平衡法测定该待测底物浓度线性上限80％的反应曲线中待测底物最大消耗比例大于40％；
(五)、对任一酶反应曲线，只需据其有效数据量、底物消耗比例和校正后起点信号与所记录最后数据之差的绝对值判断用终点平衡法或酶反应动力学过程分析法确定反应终点信号，但不需要用两种方法分析相同反应曲线。
4.据权利要求1所述测定酶底物量的联用方法，其特征在于：
(一)、对单一酶反应体系，将除待测底物外其它底物浓度设置在反应体系最大可测底物浓度10倍以上，便于将其反应简化为单底物且不可逆反应；
(二)、对有多个酶偶联作用的反应体系，用所有酶反应的微分动力学方程组，设定一组所需参数，其中包括反应终点信号，迭代数值积分计算一条模拟的反应曲线；用合理范围内参数的各种组合迭代数值积分计算模拟的反应曲线；将这些计算的模拟反应曲线与实验反应曲线最小二乘拟合，达到最好拟合的模拟反应曲线所用参数组合中的反应终点信号为分析偶联酶反应过程预测所得的反应终点信号。
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