CN101173889A - 联用积分法和初速度法测定酶活性的方法 - Google Patents

Abstract

一种联用积分法和初速度法测定酶活性的方法；对单一酶反应体系在低于米氏常数10倍的预设底物浓度下连续监测反应3到10分钟，当起始底物浓度高于预设底物浓度70％且初速度仍在其线性范围内时测定经典初速度，当80％记录时段内底物消耗比例高于积分法所需下限时用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合反应曲线确定最大反应速度，再将最大反应速度计算成预设底物浓度93％时的初速度，并使经典初速度和计算初速度对酶量响应曲线斜率相同；当80％记录时段内偶联酶反应体系底物消耗比例高于积分法所需下限时用对应的数值积分速度方程，迭代拟合酶反应曲线确定初速度，否则直接测定经典初速度；优化监测反应的总时间是两种方法联用的保障。

Description

联用积分法和初速度法测定酶活性的方法

技术领域

本发明涉及用于临床检验、卫生检验等领域测定酶活性的方法，其特征是用经典初速度法测定低活性酶反应体系的初速度，用积分法测定高活性反应体系的酶反应最大速度，通过换算成优化底物浓度下的初速度，使积分法和初速度法的响应曲线变成同一条直线，从而用较低的底物浓度获得更高的线性响应上限和更宽的线性响应范围，并保障分析效率。

背景技术

测定酶活性是临床检验和环境卫生检验等领域的常规工作。目前测定酶活性常用初速度法，但需用尽可能高的底物浓度以获得较高的线性响应上限和较宽的线性响应范围。当底物溶解度有限，或高浓度底物有抑制或激活作用，或底物成本限制时，经典初速度法的线性范围较窄。用积分速度方程分析酶反应过程可测定酶活性，此即积分法。经典积分法为降低计算工作量将积分速度方程转换成线性形式，但所用方程的自变量含随机误差，且易受反应起点误差等的影响，可靠性太低而无法应用。随着常规计算能力的显著提高，用以反应时间为自变量的积分速度方程非线性拟合酶反应动力学过程曲线成为新的酶反应动力学过程分析方法，此即新积分法，其所用底物浓度更低而线性响应上限更高。积分法要求被分析数据中底物消耗比例越高越好，其初始底物浓度越低则对底物消耗最低比例要求也越低，但其下限一般在40％左右。因此，当待测样品活性低时，就需很长的测定时间记录酶反应的动力学过程，使得其分析效率无法得到保证。另外，现有偶联酶反应体系都要求偶联工具酶活性尽可能高，否则线性上限很低，而用积分法分析偶联酶反应动力学过程至今没有成为常规方法。

经典初速度法测定酶活性的最大优势是分析效率高，而积分法的最大优势是在更低的底物浓度下线性响应上限却更高。理论上预期，将积分法与初速度法联用有望在较低底物浓度下既提高测定效率，又显著提高线性响应上限，从而有效拓宽线性响应范围。这种策略已尝试过(见Biochem J，1975，149：305-312；Biochem J，1982；203：117-123；Biochem J，1985；228：55-60)，但这些尝试中，当被分析的酶反应曲线中底物消耗比例超过50％以后反而偏差越来越大，尤其对反应起点误差和初始底物浓度误差也很敏感，不能常规应用。

此前尝试的联用方法中所用积分速度方程的自变量都不是反应时间，都含有随机误差和系统误差，这可能是其可靠性低的原因。但如用以反应时间为自变量的积分速度方程分析酶反应过程，有望使积分法测定酶活性对反应起点误差不明感，在底物消耗比例较高时可靠性更高，从而可同经典初速度法联用测定酶活性而拓宽线性响应范围，并保障分析效率。

发明内容

本发明目的是联用积分法和经典初速度法测定酶活性，从而用中等底物浓度获得更高的线性响应上限和更宽的线性响应范围，并保障分析效率。

本发明的技术方案是：用中等底物浓度，在酶活性足够高时，对偶联酶反应用积分法测定初速度、对单一酶反应用积分法测定最大反应速度再换算成优化初始底物浓度下的初速度；在酶活性较低时，直接用经典初速度法测定酶活性。此联用方法的关键是两种方法测定酶活性对酶量线性响应斜率相同，对两种方法都能测定的酶样品给出相同的酶活性，其特征在于：

(一)、取一定量所需缓冲液加入试管内，再加入一定量底物溶液；单一酶反应体系的初始底物浓度在待测酶米氏常数0.10到10倍之间；对偶联一个工具酶的偶联酶反应体系，待测酶的底物浓度设置与用经典初速度法完全相同(即待测酶的底物浓度高于对应米氏常数的10倍，偶联工具酶的指示底物浓度为检测仪器线性响应范围的上限或尽可能高)；

(二)、将上述溶液混匀后在选定温度(25～37℃)下恒温5～10分钟；

(三)、在上述溶液中加入待测酶液，立即混匀，迅速将反应混合物转移到比色杯(或其它可连续监测酶反应过程的检测器样品室)；

(四)、延迟15秒，以1～30秒间隔记录对待测底物或产物线性响应的检测信号(如光吸收)，共记录3分钟以上(10分钟以内)获得底物或产物随时间变化的反应曲线(偶联酶反应体系用1秒间隔记录)，监测反应的时间不超过10分钟；

(五)、数据过滤，去掉相邻数据点中对应的检测信号变化小于仪器检测噪声2倍的数据(即去掉底物或产物浓度无显著变化的数据)；

(六)、将单一酶单底物反应微分速度方程积分成以反应时间为自变量的形式，将偶联一个工具酶的微分速度方程数值积分成以反应时间为自变量的形式(数值积分步长0.1秒)，如存在产物抑制则在此积分速度方程中需包含产物抑制的效应。

如监测反应过程中逐渐增加的瞬时吸收Ai，被测物质摩尔消光系数为ε，反应体系最大吸收为Am，本底为Ab，酶对底物的米氏常数为Km；当用硫代丁酰胆碱为底物(加巯基显色剂)测定血清丁酰胆碱酯酶(单一酶)反应的产物吸收增加过程(来自硫代丁酰胆碱巯基水解生成的反应产物吸收的增加过程)，可用如下的积分速度方程非线性拟合：

-ln(Am-Ai)+Ai/(ε×Km)＝a+b×t    [1]

当用丙酮酸和NADH为底物测定乳酸脱氢酶反应的底物消耗(NADH吸收下降)过程，可用如下积分速度方程非线性拟合反应曲线：

-ln(Ai-Ab)-Ai/(ε×Km)＝a+b×t    [2]

当用γ-谷氨酰基对硝基苯胺和双甘肽为底物测定存在产物竞争性抑制的γ-谷氨酰基转移酶(GGT)活性，设产物γ-谷氨酰双甘肽的抑制常数同另一个产物对硝基苯胺的摩尔消光系数乘积为Aki，用包含产物抑制的如下积分速度方程非线性拟合反应曲线：

-Km×(Aki+Am-Ab)/Aki×ln(Am-Ai)+(1/ε-Km/Aki)×(Am-Ai)＝a+b×t  [3]

对上述单一酶反应体系，数据转换后用以反应时间为自变量的积分速度方程非线性拟合反应曲线，所得对应的速度(即方程[3]中系数b)为最大反应速度。此方程不同于此前报道的GGT反应动力学机制模型(Biochem J，1976，157：609-617)，适用于分析底物浓度低于酶Km的反应曲线。当所用底物浓度高于酶Km时，用文献报道的模型与用此模型所得结果相近。

当用丙氨酸加α-酮戊二酸为谷丙转氨酶(ALT)底物，以NADH为指示底物，偶联乳酸脱氢酶(LDH)，用数值积分速度方程迭代拟合反应曲线确定ALT活性(VALT)，所用方程组如下：

$\left\{\begin{array}{cc}\mathrm{VNADH}=\mathrm{VLDH}/(1+{\mathrm{Km}}_{\mathrm{NADH}}/\mathrm{NADH}1+\mathrm{Kmpyr}/\mathrm{PYR}1+\mathrm{Kmab}/(\mathrm{NADH}1\×\mathrm{PYR}1))& \left[4\right]\\ \mathrm{NADH}2=\mathrm{NADH}1-V_{\mathrm{NADH}}*\mathrm{dt}& \left[5\right]\\ \mathrm{PYR}2=\mathrm{PYR}1-V_{\mathrm{NADH}}*\mathrm{dt}+V_{\mathrm{ALT}}*\mathrm{dt}& \left[6\right]\end{array}\right.$

其中，NADH1表示前一记录点对应的NADH浓度，NADH2表示据当前的丙酮酸(PYR)浓度、NADH浓度和LDH活性递归推算的下一记录点的NADH浓度，PYR1表示前一记录点对应的PYR浓度，PYR2表示按照当前设定的参数和反应速度推算下一点的PYR浓度；V_NADH表示NADH浓度下降速度，Km_NADH表示LDH对NADH的米氏常数，Kmpyr表示LDH对PYR的米氏常数，Kmab，表示两个米氏常数的交叉项；dt为数值积分所用步长；当用猪心LDH为工具酶时，上述参数定义和设置详见J Biol Chem，1962；237(5)：1668-1675。

(七)、当所设定记录的单一酶反应过程数据对应的最高底物浓度高于酶作用前的70％，且分析底物消耗10％范围内数据的平均速度仍然在经典初速度法的线性范围内，则用经典初速度法确定底物消耗低于10％范围内的平均速度为经典初速度表示酶活性；

(八)、当反应进行到预设记录总时间80％时(设定记录时间为6分钟则此时间为4.5分钟左右)，如单一酶体系的底物消耗比例已经高于积分法要求的下限(约40％)，则以最大反应速度及初始底物浓度(或最大产物浓度、本底等相当物理量)为参数，其余动力学和热力学参数固定为已知常数，用以反应时间为自变量的积分速度方程非线性拟合反应曲线确定给出最好拟合的最大反应速度为待测参数；当偶联一个工具酶的偶联酶反应体系的指示底物消耗已大于积分法要求的下限(约75％)时，则以待测酶反应初速度和偶联酶指示底物浓度为参数，用对应数值积分速度方程(数值积分步长0.1秒)迭代拟合反应曲线，达到最好拟合的待测酶反应初速度为待测参数；此即用积分法测定的酶活性；积分法分析单一酶或偶联酶反应曲线测定酶活性要求的底物消耗比例随着所用初始底物浓度相对于酶米氏常数的大小不同而不同，一般底物浓度越高则要求此底物消耗比例的下限越高。

(九)、对单一酶反应体系，用其微分速度方程和原来设定的参数，将积分法所得最大反应速度换算成所加初始底物浓度93％左右(波动在4％以内)初始底物浓度下的初速度，此即来自积分法的计算初速度；优化最大反应速度换算成初速度的初始底物浓度，使计算初速度对酶量的响应曲线斜率同低酶活性时经典初速度对酶量的响应曲线斜率无统计差异，且在分析所设定记录总时间80％内底物消耗低于积分法要求的下限而在记录总时间内底物消耗比例达到积分法要求的下限的反应曲线时，用积分法分析全部数据所得最大反应速度换算成计算初速度后同经典初速度法分析相同反应曲线初始阶段所得经典初速度也无差异。

本发明的关键环节是优化单一酶反应体系所用初始底物浓度、积分法所得最大反应速度换算成计算初速度所需底物浓度和监测反应过程的时间，这样才能使两种方法的线性响应曲线斜率相同，并保障存在两种方法都能可靠测定的酶活性交叉区域，且在此区域内两种方法测定酶活性给出一致的结果。通常临床检验等领域分析一个标本耗时5分钟是基本可行的。因此，实践中监测反应过程时间范围是有限的，优化反应体系的初始底物浓度成为此联用方法的关键环节。反应体系初始底物浓度越低则积分法所需底物消耗比例越高，且初始底物浓度太低会造成初速度法的线性响应上限很低，除非显著延长反应记录时间，就无法保障存在位于经典初速度法线性上限和积分法实验可测线性响应下限之间的酶活性区域(此即两种方法都能测定酶活性的交叉区域)，但这会显著降低分析效率。因此，虽然积分法可用很低的底物浓度，但当两种方法联用时，初始底物浓度就不能太低，否则分析效率无法得到保障。在保障分析效率的前提下，通过优化反应体系的初始底物浓度和积分法所得最大反应速度转换成计算初速度所用的底物浓度，经典初速度法和积分法可对酶量有相同的响应曲线斜率；优化监测反应的时间就可既保障分析效率，又使得存在两种方法都有效的区域并能使两种方法给出一致的酶活性指标。这相当于平面内的两条响应直线斜率相同且有交点，实际上等于同一条直线，这是两种方法能联用测定酶活性获得更高上限和更宽线性范围的关键基础。

因此，优化初始底物浓度设置和监测反应过程的时间，有利于保障利用此联用方法的可行性和可靠性，从而更高效率测定更宽线性范围内的酶活性。已实验明确此联用方法可用于测定谷丙转氨酶、γ-谷氨酰基转移酶、碱性磷酸酶、淀粉酶、乳酸脱氢酶、尿酸酶等的活性，尤其对于单一酶反应体系，只需要经典积分法所需底物浓度的25％以下的初始底物浓度，就能以相同或相当的分析效率，将线性响应范围拓宽1倍以上。

附图说明

图1是本发明实施例1中记录的丁酰胆碱酯酶反应曲线；

图2是本发明实施例1中联用法测定的丁酰胆碱酯酶响应曲线；

图3是本发明实施例2中记录γ-谷氨酰基转移酶反应曲线；

图4是本发明实施例2中联用法测定γ-谷氨酰基转移酶活性响应曲线；

图5是本发明实施例3中记录的谷丙转氨酶偶联酶反应曲线；

图6是本发明实施例3中联用法测定的谷丙转氨酶活性响应曲线；

具体实施例

实施例1：此联用方法可测定人血清丁酰胆碱酯酶活性，其特征在于按如下步骤进行：

(一)、在试管中加入50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.4)共0.90ml，及溶解在此磷酸盐缓冲液中的硫代双(2-硝基苯甲酸，Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB)共0.10ml(终浓度0.50mmol/L)、适当稀释的血清样品0.10ml，在30℃水浴恒温5分钟；

(二)、加入溶解在上述磷酸盐缓冲液中的底物硫代丁酰胆碱100μl到终浓度为54μmol/L，旋涡振荡充分混匀；

(三)、将反应混合物迅速转移进入比色杯，延迟15秒，以5秒间隔连续监测410nm吸收变化，共监测5.0分钟，得到硫代但见与DTNB反应产物吸收增加反应曲线(附图1)；

(四)、将与前一个记录数据相比光吸收增加不到0.002的数据去掉；

(五)、当反应进行4.0分钟后，如吸收增加到预期最大产物吸收增量的50％以上，就用单底物米氏酶的产物增加积分速度方程，以最大产物吸收(Am)和最大反应速度(Vm)为参数，产物消光系数(ε)定在13.6(mmol/L)^-1·cm^-1，丁酰胆碱酯酶的米氏常数(Km)定在18.5μmol/L，用Visual Basic等编写计算机程序，按如下以反应时间为自变量的积分速度方程，对吸收变化数据进行转换后非线性拟合酶反应曲线(瞬时吸收Ai随时间t的变化曲线)：

-ln(Am-Ai)+Ai/(ε×Km)＝a+b×t    [7]

对应最好拟合的参数b乘以酶的米氏常数得到其最大反应速度Vm。

(六)、按照相应的单底物米氏酶微分速度方程和前述所用固定参数，设定底物为0.050mmol/L，将最大反应速度换算成计算初速度；

(七)、当反应进行4.0分钟产物吸收还没有增加到最大产物吸收理论值的50％时，分析反应启动后30秒到90秒之间的数据所得平均速度为经典初速度表示酶活性；

(八)、所述条件下，丁酰胆碱酯酶线性响应上限对应酶量为线性下限对应酶量的100倍以上(附图2)，但用经典初速度法时线性响应上限对应酶量仅仅是下限对应酶量的30倍；即使在2.0mmol/L的硫代丁酰胆碱为底物时，用经典初速度法测定丁酰胆碱酯酶活性的线性响应上限对应酶量与线性下限对应酶量也不超出50倍。

实施例2：此联用方法可测定小鼠肾脏或人血清中的γ-谷氨酰基转移酶活性，其特征在于按如下步骤进行：

(一)、在试管中加入含L-γ-谷氨酰对硝基苯胺110μmol/L、双甘肽15.0mmol/L、MgCl₂10.0mmol/L的三羟基氨基甲烷-HCl缓冲液(100mmol/L，pH 8.1)共1.10ml；在30℃水浴恒温5分钟；

(二)、取适当稀释样品100μl加入上述试管内，混匀使初始底物终浓度为100μmol/L；

(三)、将反应混合物迅速转移进入比色杯，延迟15秒，以5秒间隔连续监测405nm吸收变化，共监测10.0分钟，得到产物对硝基苯胺吸收增加的反应曲线(附图3)；

(四)、将与前一个记录数据相比光吸收增加不到0.002的数据去掉；

(五)、当反应进行7.0分钟后，如吸收增加到预期最大产物吸收的50％以上，就用单底物米氏酶的产物增加积分速度方程，以最大产物吸收(Am)、最大反应速度(Vm)为参数，产物消光系数(ε)定在9.87(mmol/L)^-1·cm^-1，小鼠肾脏γ-谷氨酰基转移酶对L-γ-谷氨酰对硝基苯胺的米氏常数(Km)定在0.96mmol/L，产物L-γ-谷氨酰双甘肽的抑制常数固定为0.25mmol/L，用计算机程序，按如下以反应时间为自变量的积分速度方程，对吸收变化数据进行转换后非线性拟合γ-谷氨酰基转移酶的反应曲线(瞬时吸收Ai随时间t的变化曲线)：

-Km×(Aki+Am-Ab)/Aki×ln(Am-Ai)+(1/ε-Km/Aki)×(Am-Ai)＝a+b×t  [8]

对应最好拟合的参数b为其最大反应速度Vm。

(六)、按相应单底物米氏酶微分速度方程和对应的动力学参数，设定初始底物浓度为95μmol/L，将积分法所得最大反应速度换算成计算初速度；

(七)、当反应进行7.0分钟产物吸收还没有增加到预期最大产物吸收增量的50％时，分析反应启动后30秒到90秒之间的数据对应的平均速度为经典初速度；

(八)、所述条件下，γ-谷氨酰基转移酶活性线性响应上限为下限50倍以上(附图4)，但用相同的初始底物浓度，经典初速度法测定此酶活性的线性响应上限对应酶量也难超过线性下限对应酶量的20倍；如用4.0mmol/L的L-γ-谷氨酰对硝基苯胺为底物，用经典初速度法测定γ-谷氨酰基转移酶活性的线性响应上限对应酶量与线性下限对应酶量之比约40倍。

实施例3：此联用方法测定小鼠肾脏、人血清谷丙转氨酶(ALT)活性的特征性步骤如下：

(一)、在试管中加入含有600mmol/L丙氨酸、0.22mmol/L NADH，1400U/L LDH，100mmol/L Tris-HCl的L-γ-谷氨酰对硝基苯胺54μmol/L、双甘肽15.0mmol/L、MgCl2为10.0mmol/L，含100mmol/L三羟基氨基甲烷-HCl的缓冲液(pH为7.3)共1.00ml；再加入100μl适当稀释的样品，迅速混匀后在30℃恒温5分钟；

(二)、加入16.3mmol/L的α-酮戊二酸溶液100μl到上述试管内，快速振荡混匀；

(三)、将反应混合物迅速转移进入比色杯，延迟30秒，以1秒间隔连续监测340nm吸收变化，共监测5.0分钟，得到指示底物(NADH)瞬时吸收(Ai)下降的反应曲线(附图5)；

(四)、将与前一个记录数据相比光吸收增加不到0.002的数据去掉；

(五)、当反应进行4.0分钟后，如指示底物吸收的下降高于理论值的70％，就以LDH活性和LDH的动力学参数、热力学参数为已知常数，本底吸收和谷丙转氨酶活性为未知参数，用偶联酶反应体系的数值积分速度方程，以0.1秒的积分步长，指示底物NADH的差毫摩尔消光系数(ε)定在6.22(mmol/L)^-1·cm^-1，迭代拟合ALT的偶联酶反应曲线：

$\left\{\begin{array}{cc}{V}_{\mathrm{NADH}}=V_{\mathrm{LDH}}/(1+{\mathrm{Km}}_{\mathrm{NADH}}/\mathrm{NADH}1+\mathrm{Kmpyr}/\mathrm{PYR}1+\mathrm{Kmab}/(\mathrm{NADH}1\×\mathrm{PYR}1))& \left[9\right]\\ \mathrm{NADH}2=\mathrm{NADH}1-V_{\mathrm{NADH}}*\mathrm{dt}& \left[10\right]\\ \mathrm{PYR}2=\mathrm{PYR}1-V_{\mathrm{NADH}}*\mathrm{dt}+V_{\mathrm{ALT}}*\mathrm{dt}& \left[11\right]\end{array}\right]$

达到最好拟合的V_ALT为待测参数。其中，NADH1表示前一记录点的NADH浓度，NADH2为据当前丙酮酸(PYR)浓度、NADH浓度和LDH活性递归推算的下一记录点的NADH浓度，PYR1表示前一记录点的PYR浓度，PYR2表示按照当前设定的参数和反应速度推算的下一点PYR浓度；VNADH表示NADH浓度下降速度，KmNADH表示LDH对NADH的米氏常数，Kmpyr表示LDH对PYR的米氏常数，Kmab，表示两个米氏常数的交叉项；dt为数值积分所用步长；当用猪心肌LDH为偶联的工具酶时，上述参数定义和设置详见J Biol Chem，1962；237(5)：1668-1675。对应最好拟合的参数VALT为待测反应速度Vm。

(六)、当反应进行4.0分钟后指示底物吸收的下降仍然低于理论值的70％，则用经典初速度法直接测定ALT活性。

(七)、所述条件下，联用方法测定ALT活性的线性响应上限对应酶量为下限对应酶量的30倍左右(附图6)，线性上限达到110U/L以上；但用经典初速度法时线性响应上限小于50U/L，对应酶量与线性下限对应酶量之比仅15倍。

Claims (11)

1.一种联用积分法和初速度法测定酶活性，从而用中等底物浓度和较高效率获得更宽线性响应范围的方法，其特征在于按如下步骤进行：

(一)、取一定量所需缓冲液加入试管内，再加入一定量底物溶液，单一酶的单底物反应体系初始底物浓度在待测酶米氏常数0.10到10倍之间，偶联一个工具酶的反应体系所需各种底物浓度及工具酶活性与用初速度法测定偶联酶反应体系酶活性时完全相同(即待测酶的底物浓度高于其米氏常数的10倍，偶联工具酶活性尽可能高，指示底物浓度为检测仪器线性响应范围的上限)；

(二)、将上述溶液混匀后在选定温度(25～37℃)下恒温5～10分钟；

(三)、在上述溶液中加入待测酶液样品，立即混匀，迅速将反应混合物转移到比色杯(或其它可连续监测酶反应过程的分析仪器的样品室)；

(四)、延迟20秒，以1～60秒间隔监测与底物或产物成比例的检测信号(如光吸收)，共记录3分钟到10分钟(偶联酶反应体系记录间隔应尽量短)；

(五)、数据过滤，去掉相邻数据点中检测信号变化小于仪器检测噪声2倍的数据(即去掉底物或产物浓度无显著变化的数据)，换算成底物或产物浓度随时间变化的反应曲线；

(六)、将单一酶单底物反应微分速度方程积分成以反应时间为自变量的积分速度方程，将偶联一个工具酶的微分速度方程数值积分成以反应时间为自变量的积分速度方程；如有底物或产物抑制则在积分速度方程中包含其抑制效应；

(七)、在设定条件下，如所记录反应曲线中对应的最高底物浓度高于酶作用前的70％，且分析底物消耗10％范围内数据的平均速度(即经典初速度)仍低于初速度法的线性上限时，则用初速度法确定其经典初速度表示酶活性；

(八)、当反应进行到记录总时间80％时(记录总时间为6分钟则此时间约4.5分钟)，如单一酶单底物体系的底物消耗比例高于积分法所要求下限(一般约40％，初始底物浓度太低或太高时此底物消耗比例的下限更高)，则以最大反应速度及初始底物浓度(或相当的对应物理量)为参数，其余动力学参数固定为已知常数，用以反应时间为自变量的积分速度方程非线性拟合反应曲线确定对应的最大反应速度，此即用积分法测定单一酶体系的酶活性；当偶联一个工具酶反应体系指示底物消耗比例高于积分法所要求的下限(一般为75％，指示底物的浓度不同、工具酶的动力学参数不同时此底物消耗比例要求的下限也不同)时，则用待测酶反应初速度和偶联酶指示底物浓度为参数，用对应的数值积分速度方程(数值积分步长0.1秒，尽可能短)迭代拟合酶反应曲线，达到最好拟合的待测酶反应初速度为待测参数，此即用积分法测定偶联酶反应体系的酶活性；

(九)、对单一酶反应体系，用其微分速度方程和固定为常数的其它动力学参数，将积分法所得最大反应速度换算成在所用反应体系初始底物浓度93％(随初始底物浓度变化，但波动在4％以内)底物浓度下的初速度，此即用积分法所得单一酶反应体系的计算初速度；优化最大反应速度换算成计算初速度所用的底物浓度以同时满足下列两个要求：(1)计算初速度对酶量的响应曲线斜率同低酶活性范围内经典初速度对酶量的响应曲线斜率无统计差异，(2)对初速度法能可靠测定而此积分法也能可靠测定的酶活性交叉区域内的样品，用积分法所得的计算初速度同初速度法所得的经典初速度也无统计差异。

2.据权利要求1所述联用积分法与初速度法测定酶活性的方法，其特征在于：如步骤(七)到步骤(九)所述，当单一酶反应体系所记录的反应起始阶段的底物浓度仍高于酶作用前的70％且对应的经典初速度仍在初速度法的线性范围内，则用初速度法测定经典初速度表示酶活性；当所设定记录时间80％内底物消耗比例已高于所用实验条件下积分法测定酶活性所要求的底物消耗比例下限，就用以反应时间为自变量的积分速度方程，以初始底物浓度(或最大产物浓度等相当的物理量)、最大反应速度为待测参数，其余所需动力学或热力学参数为固定常数，非线性拟合酶反应过程确定最大反应速度，再按照步骤(九)所述换成成计算初速度表示酶活性；此特征不同于单用积分法测定酶活性。

3.据权利要求1所述联用积分法与初速度法测定酶活性的方法，其特征在于：如步骤(一)中所述，对于单一酶反应体系，此联用方法所需底物浓度不需高于酶米氏常数的10倍而且变化范围很宽，所需记录反应过程的总时间在3到10分钟之间，就可获得比经典初速度法更高的线性响应上限。

4.据权利要求1所述联用积分法与初速度法测定酶活性的方法，其特征在于：如步骤(一)、步骤(六)到步骤(八)所述，对偶联一个工具酶的反应体系，此方法所需各种底物的浓度和工具酶活性同经典初速度法测定偶联酶反应体系酶活性时相同，但当所设定记录时段80％时间内底物消耗比例达到积分法的要求时，不用经典初速度法测定初速度，而是用以反应时间为自变量的数值积分速度方程迭代拟合偶联酶反应曲线确定待测酶反应的初速度表示酶活性。

5.据权利要求1所述联用积分法与初速度法测定酶活性的方法，其特征在于：如步骤(六)中所述，此联用方法中所用积分速度方程以反应时间为自变量，且当反应体系有底物或产物抑制时，在所用积分速度方程中还包含对应的底物或产物抑制作用；此特征不同于经典积分法和其它改进方法。

6.据权利要求1所述联用积分法与经典初速度法测定酶活性的方法，其特征在于：如步骤(九)中所述，用积分法获得单一酶反应体系最大反应速度后，需优化将最大反应速度换算成计算初速度所需初始底物浓度，使积分法所得计算初速度对酶量响应曲线斜率与初速度法响应曲线斜率一致，且对初速度法与积分法都能可靠测定的酶活性样品，两种方法能给出无统计差异的结果；这是此联用方法的关键环节，也是不同于单用积分法测定酶活性的标志。

7.据权利要求1所述的联用积分法与初速度法测定酶活性的方法，其特征在于：对偶联酶反应体系，直接将积分法和初速度法所测初速度联用就可获得更宽的线性响应范围；对单一酶反应体系，需优化将积分法所得最大反应速度转换成计算初速度的底物浓度，才可使此计算初速度对酶量响应曲线斜率同经典初速度对酶量响应曲线斜率一致，且在积分法和初速度法都有效的范围内两种方法所得酶活性一致，从而实现积分法与经典初速度法的联用。

8.据权利要求1所述联用积分法与经典初速度法测定酶活性的方法，其特征在于：此联用方法要求所用测定条件下经典初速度的线性上限高于积分法的可测下限，而此积分法的可测下限主要取决于监测反应过程的时间，同时受到所设初始底物浓度的影响；对偶联酶反应体系，优化监测反应过程的时间是此联用方法可行性的保障，对单一酶单底物反应体系，优化监测反应过程的时间和初始底物浓度是此联用方法可行性的保障；积分法测定酶活性所需底物消耗比例下限取决于初始底物浓度与酶米氏常数的相对大小，及定量方法的灵敏度和精确度，初始底物浓度过高或过低时所需底物消耗比例下限升高，所需监测反应过程的时间延长，分析效率降低；监测反应过程所用定量方法的灵敏度和精确度越高，则此联用方法测定酶活性所需底物浓度越低且监测反应时间越短；通常此联用方法所需底物浓度在0.5倍到3.0倍酶米氏常数之间时所需监测反应过程时间最短，一般可不超过5分钟，能保障常规分析的需要。

9.据权利要求1所述的联用积分法与经典初速度法测定酶活性的方法，其特征在于：在所用实验测定条件下用此联用方法测定酶活性，其线性响应上限为积分法的线性响应上限，线性响应下限接近经典初速度法的下限，但记录反应过程所需时间不多于10分钟，底物浓度范围宽，有成本和效率优势。

10.据权利要求1所述的联用积分法与初速度法测定酶活性的方法，其特征在于：对于多底物单一酶反应体系，将某个底物浓度优化为此联用方法所需底物浓度，其余底物浓度在其10倍以上，则反应可近似为单底物单一酶反应，从而可应用此联用方法测定酶活性。

11.用此联用方法可分析偶联乳酸脱氢酶的人血清谷丙转氨酶反应过程测定谷丙转氨酶活性，可测定丁酰胆碱酯酶、γ-谷氨酰基转移酶、淀粉酶等的单一酶反应体系的酶活性，可用于临床检验、卫生检验等领域。

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