CN102298057A - 氨(氨离子)的测定方法与氨(氨离子)诊断/测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用酶比色法及酶联法技术的氨(氨离子)含量的测定方法、试剂的组成及成分，其测定的技术原理是依据谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱羧酶、丙二酸-半醛脱氢酶的系列催化反应完成，本发明还涉及一种氨(氨离子)诊断/测定试剂盒。本发明的测定方法灵敏度高、误差小，因此本发明的测定方法与试剂盒可以广泛地应用于临床医学/食品检验。

Description

氨(氨离子)的测定方法与氨(氨离子)诊断/测定试剂盒

【技术领域】

本发明涉及医学/食品检验测定技术领域，更具体地，本发明涉及氨(氨离子)诊断/测定方法及其试剂盒。 

【背景技术】

氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。 

扩散法是标本碱化后，释放出NH₃，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8％～13％；离子选择电极法是利用NH₃扩散到电极表面，引起电极的pH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5％～4.8％，回收率高。结合具体实际，应以酶法测定为实用。 

检索中国专利，仅查出87105593.7专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。 

【发明内容】

[要解决的技术问题] 

本发明的目的是提供一种氨(氨离子)的测定方法。 

本发明的另一个目的是提供一种氨(氨离子)诊断/测定试剂盒。 

[技术方案] 

本发明是通过下述技术方案实现的。 

本发明的方法是一种采用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与酶(偶)联法(Couple Reaction)的联用技术，利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处的吸光度变化测定氨(氨离子)的方法。 

本发明氨(氨离子)测定方法的的技术原理是根据下述谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱羧酶、丙二酸-半醛脱氢酶的系列催化反应完成： 

氨+过氧化氢+2-酮戊二酸谷氨酸氧化酶谷氨酸+氧+水 

谷氨酸谷氨酸脱羧酶4-氨基丁酸(aminobutanoate)+二氧化碳 

二氧化碳+乙酰-辅酶A+还原型辅酶丙二酸-半醛脱氢酶

                                3-甲酰乙酸+辅酶A+辅酶 

本发明的方法利用谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase；EC 1.4.3.7；EC 1.4.3.11)酶(偶)联谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase；EC 4.1.1.15)、丙二酸-半醛脱氢酶(malonate-semialdehyde dehydrogenase；EC 1.2.1.18)酶促反应比色终点法。谷氨酸氧化酶酶解氨反应产生谷氨酸，再通过(偶)联合谷氨酸脱羧酶、丙二酸-半醛脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度，这样可以通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算氨(氨离子)的浓度大小。 

本发明是通过下述技术方案实现的。 

本发明涉及一种氨(氨离子)的测定方法。该氨(氨离子)测定方法的步骤如下： 

A、样品准备： 

A.1标准样品的制备 

将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中，再将氨浓度调整到100微摩尔/升，得到的溶液作为标准样品；

A.2待测样品的制备 

待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中； 

A.3空白样品 

所述的水或缓冲液作为空白样品，其氨(氨离子)浓度为0微摩尔/升； 

B、试剂溶液的制备： 

分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱羧酶、丙二酸-半醛脱氢酶、过氧化氢、2-酮戊二酸与乙酰-辅酶A，然后将它们混合均匀，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0.001-7mol/L、0.1-0.35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L与1-100mmol/L； 

C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45℃下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化； 

D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化； 

E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)空白样品的吸光度随时间的变化； 

F、数据处理 

由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到氨的含量： 

式中： 

ΔA(样品)表示步骤C)得到的待测样品的吸光度变化； 

ΔA(空白)表示步骤E)得到的空白样品的吸光度变化； 

ΔA(标准)表示步骤D)标准样品的吸光度变化。 

根据本发明，在所述的氨(氨离子)测定方法中，所述的缓冲液应该理解是能够使其测定介质的pH基本保持稳定(一般是6.0-9.0)的溶液。如果该pH高于9.0或pH低于6.0，则该测定方法使用的酶的活性达不到预期的活性效果，因此需要添加更多的介质与酶，才有可能达到预期的活性效果。 

在本发明中，所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液。 

优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐缓冲液或“PBS”缓冲液。 

更优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液或磷酸盐缓冲液。 

根据本发明，在所述的氨(氨离子)测定方法中，所述的稳定剂应该理解是一种能保护试剂中的介质(底物)与酶，使其不会随着时间推移而改变其性质，进而失去活性的物质，它会使得试剂具备很长的活性寿命，通常长达数月，甚至一、二年。如果没有所述的稳定剂，则试剂的活性在溶液中只能维持数十小时，顶多数天，就会逐渐失去活性而不再具备检测性能。在本发明中，所述的稳定剂使用量是0.01-7mol/L。如果所述的稳定剂使用量不够，则试剂活性的寿命就会缩短；如果所述的稳定剂使用量过高，则会增加成本。 

在本发明中，所述的稳定剂是一种或多种选自氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。 

优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自氯化钠、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠的稳定剂。 

更优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油或双乙酸钠的稳定剂。 

在本发明中，所述的还原型辅酶是一种或多种选自NADPH、NADH或thio-NADH的还原型辅酶。 

根据一种本发明的优选实施方式，本发明使用全自动生化分析仪测定氨(氨离子)时，待测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下(参数)自动取样，然后在下述条件下进行测定：测定方法为二点终点法/终点法，温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨(氨离子)样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为负反应，延迟时间1/0分钟，检测时间4/5分钟。 

根据另一种本发明的优选实施方式，本发明使用的试剂溶液配制成如下双剂试剂：

由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、过氧化氢、2-酮戊二酸与乙酰-辅酶A组成的试剂1； 

由所述的缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱羧酶与丙二酸-半醛脱氢 酶组成的试剂2； 

其中还原型辅酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱羧酶、丙二酸-半醛脱氢酶、过氧化氢、2-酮戊二酸、乙酰-辅酶A在试剂1或试剂2中的位置是不限定的。 

根据另一种本发明的优选实施方式，本发明使用的试剂配制成如下三剂试剂： 

由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、过氧化氢、2-酮戊二酸与乙酰-辅酶A组成的试剂1； 

由所述的缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱羧酶与丙二酸-半醛脱氢酶组成的试剂2； 

由所述的缓冲液、稳定剂与谷氨酸氧化酶组成的试剂3； 

其中还原型辅酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱羧酶、丙二酸-半醛脱氢酶、过氧化氢、2-酮戊二酸、乙酰-辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置是不限定的。 

在本发明氨(氨离子)测定方法中使用的测定仪器可以是紫外/可见光分析仪，例如上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、天津喀纳斯光学分析仪器有限公司销售的723可见分光光度计；半自动生化分析仪，例如上海伟思医用设备有限公司的BTS-330半自动生化分析仪；全自动生化分析仪，例如：由迈瑞公司以商品名BS-300、奥林帕斯公司以商品名AU400、东芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或贝克曼公司以商品名CX20销售的全自动生化分析仪。 

本发明还涉及氨(氨离子)诊断/测定试剂盒。该氨(氨离子)诊断/测定试剂盒由下述粉状试剂组成，在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂： 

缓冲液                        20-500mmol/L 

稳定剂                        0.001-7mol/L 

还原型辅酶                    0.1-0.35mmol/L 

谷氨酸氧化酶                  1000-80000U/L 

谷氨酸脱羧酶                  1000-80000U/L 

丙二酸-半醛脱氢酶             1000-80000U/L 

过氧化氢                      1-100mmol/L 

2-酮戊二酸                    1-100mmol/L 

乙酰-辅酶A                    1-100mmol/L。 

根据一种本发明的优选实施方式，本发明的氨(氨离子)诊断/测定试剂盒有： 

试剂1： 

缓冲液                      100mmol/L 

稳定剂                      500mmol/L 

还原型辅酶                  0.25mmol/L 

过氧化氢                    5mmol/L 

2-酮戊二酸                  5mmol/L 

乙酰-辅酶A                  5mmol/L； 

组成如下的试剂2： 

缓冲液                      100mmol/L 

稳定剂                      500mmol/L 

谷氨酸氧化酶                16000U/L 

谷氨酸脱羧酶                18000U/L 

丙二酸-半醛脱氢酶           12000U/L。 

根据另一种本发明的优选实施方式，本发明的氨(氨离子)诊断/测定试剂盒有： 

试剂1： 

缓冲液                    100mmol/L 

稳定剂                    500mmol/L 

还原型辅酶                0.25mmol/L 

过氧化氢                  5mmol/L 

2-酮戊二酸                5mmol/L 

乙酰-辅酶A                5mmol/L； 

组成如下的试剂2： 

缓冲液                    100mmol/L 

稳定剂                    500mmol/L 

谷氨酸脱羧酶              18000U/L 

丙二酸-半醛脱氢酶         12000U/L； 

组成如下的试剂3： 

缓冲液                    100mmol/L 

稳定剂                      500mmol/L 

谷氨酸氧化酶                16000U/L。 

根据另一种本发明的优选实施方式，在本发明的氨(氨离子)诊断/测定试剂盒中，所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液。 

优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐缓冲液或“PBS”缓冲液。 

更优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液或磷酸盐缓冲液。 

在本发明中，所述的稳定剂是一种或多种选自氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。 

优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自氯化钠、丙二醇、甘油、双乙酸钠或叠氮钠的稳定剂。 

更优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油或双乙酸钠的稳定剂。 

在本发明中，无论是单剂试剂、双剂试剂或三剂试剂，在本发明测定氨(氨离子)的方法中，所述的还原型辅酶可以是一种或多种选自NADPH、NADH或thio-NADH的还原型辅酶。 

使用本发明的氨(氨离子)诊断/测定试剂盒时，可以使用紫外/可见光分析仪，例如上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、天津喀纳斯光学分析仪器有限公司销售的723可见分光光度计；半自动生化分析仪，例如上海伟思医用设备有限公司的BTS-330半自动生化分析仪；全自动生化分析仪，例如：由迈瑞公司以商品名BS-300、奥林帕斯公司以商品名AU400、东芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或贝克曼公司以商品名CX20销售的全自动生化分析仪。 

在采用本发明方法测定氨(氨离子)时，根据实验要求进行多次试验，然后将得到的这些试验结果按照下式计算出精密度(CV)： 

$S=\sqrt{\mathrm{\Σ}{(\stackrel{\‾}{X}-X_i)}^2/n-1}$

式中： 

-试验结果平均值； 

Xi-各次试验结果； 

n-试验次数.N≥10 

$\mathrm{CV}=S/\stackrel{\‾}{X}*100\%$

将得到的这些试验结果按照下式计算出相对极差： 

$\mathrm{\Δ}=\frac{\stackrel{\‾}{U}-\stackrel{\‾}{V}}{\underset{\‾}{(}\stackrel{\‾}{X}+\stackrel{\‾}{Y}+\stackrel{\‾}{Z})\÷3}$

第一批各次试验结果平均值 

第二批各次试验结果平均值 

第三批各次试验结果平均值 

为X，Y，Z中的最大值 

为X，Y，Z中的最小值 

每批试样数取n≥3 

经过大量试验确定，对于氨(氨离子)含量为0-1000μmol/L的样品，其分析误差可以达到≤5％。 

本发明方法的灵敏度可以达到1μmol/L。 

通过大量试验确定，本发明方法测定氨(氨离子)含量范围是0-1000μmol/L，本发明方法适合于医学临床/食品诊断/检测。 

【具体实施方式】

下述实施例说明本发明而不限制本发明的保护范围。 

实施例1：血浆中氨(氨离子)含量的测定 

1)标准样品的制备 

将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中，再将氨浓度调整到100微摩尔/升； 

2)待测样品预处理 

血浆样品作为待测样品，无须预处理； 

3)空白样品 

所述的水或缓冲液作为空白样品，其氨浓度为0微摩尔/升； 

B、试剂溶液的制备： 

本实施例的氨诊断/测定试剂为单剂试剂，它含有： 

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L 

甘油                             1mol/L 

NADPH                            0.25mmol/L 

谷氨酸氧化酶                     16000U/L 

谷氨酸脱羧酶                     18000U/L 

丙二酸-半醛脱氢酶                12000U/L 

过氧化氢                         5mmol/L 

2-酮戊二酸                       3mmol/L 

乙酰-辅酶A                       4mmol/L。 

按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 

C、待测血浆样品，与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/20进行混合，在温度37℃下反应5分钟，在主波长340nm与副波长405nm下进行测定，测定其吸光度随时间的变化ΔA(样品)为0.0277； 

D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化ΔA(标准)为0.0523； 

E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)使用的水作为空白溶液的吸光度随时间的变化ΔA(空白)为0.0106； 

F、数据处理 

由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到氨(氨离子)的含量： 

式中： 

ΔA(样品)表示步骤C)得到的待测样品的吸光度变化； 

ΔA(空白)表示步骤E)得到的空白样品的吸光度变化； 

ΔA(标准)表示步骤D)标准样品的吸光度变化。 

通过上式计算得到该血浆样品的氨(氨离子)含量为82μmol/L，其误差是±2μmol/L。 

实施例2：血浆中氨(氨离子)含量的测定 

1)标准样品的制备 

将一定量的氨盐溶于水中，再将氨(氨离子)浓度调整到100微摩尔/升，作为标准样品； 

2)待测样品的制备 

血浆样品作为待测样品，无须预处理； 

3)空白样品 

所述的水作为空白样品，其氨(氨离子)浓度为0微摩尔/升； 

B、试剂溶液的制备： 

氨(氨离子)诊断/测定试剂为双剂试剂，它含有： 

组成如下的试剂1： 

磷酸盐缓冲液                  100mmol/L 

NADH                          0.25mmol/L 

过氧化氢                      5mmol/L 

2-酮戊二酸                    5mmol/L 

乙酰-辅酶A                    5mmol/L； 

组成如下的试剂2： 

磷酸盐缓冲液                  100mmol/L 

乙二醇                        5mol/L 

谷氨酸氧化酶                  16000U/L 

谷氨酸脱羧酶                  32000U/L 

丙二酸-半醛脱氢酶             40000U/L。 

按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 

C、样品使用日立7080全自动生化分析仪测定 

该全自动生化分析仪主要操作参数如下： 

计量方法：两点终点法 

测试计量时间点：21，31 

主波长：340 

副波长：405 

反应温度：37 

样品体积：20 

试剂1(R1)体积：200 

试剂2(R3)体积：50 

反应方向：负 

标准样品1：0 

标准样品2：100 

定标结果显示K值为-5011，换算成灵敏度为0.00020ΔA/μmol/L。 

测试结果显示该血浆中含有氨(氨离子)为21μmol/L。其误差是±1μmol/L。 

实施例3：血浆样品中氨(氨离子)含量的测定 

该实施例的操作方式与实施例2相同，只是本实施例： 

B、试剂溶液的制备： 

氨(氨离子)诊断/测定试剂为三剂试剂，它含有： 

组成如下的试剂1： 

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L 

NADH                             0.25mmol/L 

过氧化氢                         6mmol/L 

2-酮戊二酸                       5mmol/L 

乙酰-辅酶A                       4mmol/L； 

组成如下的试剂2： 

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L 

氯化钠                           2mol/L 

谷氨酸脱羧酶                     28000U/L 

丙二酸-半醛脱氢酶                50000U/L； 

组成如下的试剂3： 

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L 

氯化钠                           2mol/L 

谷氨酸氧化酶                     26000U/L。 

按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 

C、样品使用日立7080全自动生化分析仪测定 

该全自动生化分析仪主要操作参数如下： 

计量方法：两点终点法 

测试计量时间点：21，31 

主波长：340 

副波长：405 

反应温度：37 

样品体积：20 

试剂1(R1)体积：20 

试剂2(R2)体积：180 

试剂3(R3)体积：50 

反应方向：负 

标准样品1：0 

标准样品2：100 

定标结果显示K值为-4705，换算成灵敏度为0.00021ΔA/μmol/L。 

测试结果显示该血浆中含有氨(氨离子)为78μmol/L。其误差是±2μmol/L。 

实施例4：稳定性试验 

该实施例的操作方式与实施例1相同，只是在实施例1实施后，实施例1使用的试剂在密闭试剂瓶中在2-8℃下存放了半年与一年。 

使用同样的标准样品，使用与实施例2同样的新试剂与上述存放半年与一年的试剂分别进行了测定，其它条件都与实施例2相同，其测定结果如下： 

表1 

氨(氨离子)含量

分析误差

[0234] 

新试剂	201μmol/L	±4μmol/L
			存放半年的试剂	202μmol/L	±4μmol/L
存放一年的试剂	205μmol/L	±4μmol/L

表1结果表明，使用本发明的试剂盒，采用本发明的测定方法可以保证获得稳定的结果，其稳定性至少一年以上。

实施例5：线性试验 

该实施例的操作方式与实施例2相同，只是配制新的标准样品浓度达到1200μmol/L，将800μmol/L的氨(氨离子)依倍比稀释，然后进行测试，其测定结果如下： 

表2 

氨(氨离子)预期值	氨(氨离子)测试值
		0	0
50	49
		100	99
200	98
		400	399
600	601
		800	798
1000	1003
		1200	1150

表2结果表明，使用本发明的试剂盒，采用本发明的测定方法可以保证线性可以达到1000μmol/L。 

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。 

总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA)≤0.01；吸光度时间反应曲线应呈下降曲线；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达1000μmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数 (CV)≤5％；试剂的灵敏度可达0.0002±0.0001A/μmol/L；试剂在2-8℃下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。 

Claims (6)

1.一种利用酶比色法及酶联法技术的氨(氨离子)浓度测定方法，其测定的技术原理是根据下述谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱羧酶、丙二酸-半醛脱氢酶的系列催化反应完成：

氨+过氧化氢+2-酮戊二酸谷氨酸氧化酶谷氨酸+氧+水

谷氨酸谷氨酸脱羧酶4-氨基丁酸(aminobutanoate)+二氧化碳

二氧化碳+乙酰-辅酶A+还原型辅酶丙二酸-半醛脱氧酶

                                3-甲酰乙酸+辅酶A+辅酶

2.一种氨(氨离子)的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下：

2.1样品准备：

2.1.1标准样品的制备

将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中，再将其浓度调整到100微摩尔/升；

2.1.2待测样品的制备

待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中；

2.1.3空白样品

所述的水或缓冲液作为空白样品，其氨(氨离子)浓度为0微摩尔/升；

2.2试剂溶液的制备：

分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱羧酶、丙二酸-半醛脱氢酶、过氧化氢、2-酮戊二酸与乙酰-辅酶A，然后将它们混合均匀，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0.001-7mol/L、0.1-0.35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L与1-100mmol/L；

2.3待测样品与在步骤2.2)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45℃下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制，可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；

2.4在与步骤2.3)同样的条件下测定步骤2.1.1)标准样品的吸光度随时间的变化；

2.5在与步骤2.3)同样的条件下测定在步骤2.1.3)使用的水或缓冲液作为空白溶液的吸光度随时间的变化；

2.6数据处理

由步骤2.3-2.5)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到氨的含量：

式中：

ΔA(样品)表示步骤2.3)得到的待测样品的吸光度变化；

ΔA(空白)表示步骤2.5)得到的空白溶液的吸光度变化；

ΔA(标准)表示步骤2.4)标准样品的吸光度变化。

3.根据权利要求1、2所述的测定方法，其特征在于使用全自动生化分析仪测定时，待测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下自动取样，然后在下述条件下进行测定：测定方法为终点法，温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为负反应，延迟时间1/0分钟，检测时间4/5分钟。

4.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于，所述的稳定剂是一种或多种选自氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠、叠氮钠等防腐剂的稳定剂；所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液；所述的还原型辅酶是一种或多种选自NADPH、NADH或thio-NADH的还原型辅酶。

5.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于：

5.1所述的试剂溶液配制成如下单剂试剂：

它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、过氧化氢、2-酮戊二酸、乙酰-辅酶A、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱羧酶与丙二酸-半醛脱氢酶组成的；

5.2所述的试剂溶液配制成如下双剂试剂：

试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、过氧化氢、2-酮戊二酸与乙酰-辅酶A组成的；

试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱羧酶与丙二酸-半醛脱氢酶组成的；

其中还原型辅酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱羧酶、丙二酸-半醛脱氢酶、过氧化氢、2-酮戊二酸、乙酰-辅酶A在试剂1或试剂2中的位置是不限定的。

5.3所述的试剂配制成如下三剂试剂：

试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、过氧化氢、2-酮戊二酸与乙酰-辅酶A组成的；

试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、谷氨酸脱羧酶与丙二酸-半醛脱氢酶组成的；

试剂3，它是由所述的缓冲液、稳定剂与谷氨酸氧化酶组成的；

其中还原型辅酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脱羧酶、丙二酸-半醛脱氢酶、过氧化氢、2-酮戊二酸、乙酰-辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置是不限定的。

6.一种氨(氨离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于：

6.1它由下述粉状试剂组成，在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂：

缓冲液                                       20-500mmol/L

稳定剂                                       0.001-7mol/L

还原型辅酶                                   0.1-0.35mmol/L

谷氨酸氧化酶                                 1000-80000U/L

谷氨酸脱羧酶                                 1000-80000U/L

丙二酸-半醛脱氢酶                            1000-80000U/L

过氧化氢                                     1-100mmol/L

2-酮戊二酸                                   1-100mmol/L

乙酰-辅酶A                                   1-100mmol/L。

6.2根据权利要求6.1所述的氨(氨离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于它有：

组成如下的试剂1：

缓冲液                                       20-500mmol/L

稳定剂                                       0.001-7mol/L

还原型辅酶                                   0.1-0.35mmol/L

过氧化氢                                     1-100mmol/L

2-酮戊二酸                                   1-100mmol/L

乙酰-辅酶A                                   1-100mmol/L；

组成如下的试剂2：

缓冲液                                       20-500mmol/L

稳定剂                                       0.001-7mol/L

谷氨酸氧化酶                                 1000-80000U/L

谷氨酸脱羧酶                                 1000-80000U/L

丙二酸-半醛脱氢酶                            1000-80000U/L。

6.3根据权利要求6.1所述的氨(氨离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于它有：

组成如下的试剂1：

缓冲液                                       20-500mmol/L

稳定剂                                       0.001-7mol/L

还原型辅酶                                   0.1-0.35mmol/L

过氧化氢                                     1-100mmol/L

2-酮戊二酸                                   1-100mmol/L

乙酰-辅酶A                                   1-100mmol/L；

组成如下的试剂2：

缓冲液                                       20-500mmol/L

稳定剂                                       0.001-7mol/L

谷氨酸脱羧酶                                 1000-80000U/L

丙二酸-半醛脱氢酶                            1000-80000U/L；

组成如下的试剂3：

缓冲液                                       20-500mmol/L

稳定剂                                       0.001-7mol/L

谷氨酸氧化酶                                 1000-80000U/L。