CN104198407A - 稳定酶法检测血清中β-羟丁酸含量的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种稳定酶法检测血清中β-羟丁酸含量的检测试剂盒；包含试剂R1、R2和含有β-HB的牛血清基质校准品，试剂R1含10～500mmol/LpH7.0～8.0的缓冲液、1～50mmol/LNAD⁺、1～10mmol/L氯化镁、0.1～20mmol/L硝基四氮唑蓝、1～100mmol/L稳定剂和0.1％～2％防腐剂；试剂R2含10～500mmol/L pH7.0～8.0的缓冲液、0.5～5KU/Lβ-羟丁酸脱氢酶、0.5～10KU/L黄递酶、1～45mmol/L蔗糖、10～30mmol/L EDTA、1～100mmol/L稳定剂和0.1％～2％防腐剂。本发明试剂稳定性佳，保存时间长。

Description

稳定酶法检测血清中β-羟丁酸含量的检测试剂盒

技术领域

本发明具体涉及一种稳定酶法检测血清中β-羟丁酸含量(β-HB)的检测试剂盒。

背景技术

酮体是脂肪酸分解代谢的产物，包括三种成分：β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮。其中β-羟丁酸是主要成分，约占酮体总量的78％，肝脏生成酮体，肝外组织能利用酮体作为能量来源，在正常情况下血中仅含少量酮体；但在某些情况下，碳水化合物代谢发生障碍，机体脂肪动员增强，肝脏生成酮体量超过肝外组织利用酮体的能力，引起血中酮体的堆积，可导致酮症酸中毒。因此及时检测血中β-羟丁酸的浓度极为重要性。特别是糖尿病性酮血症经胰岛素治疗后，绝大多数糖尿病患者β-羟丁酸的下降水平比血糖早2小时，因此检测血中β-羟丁酸浓度比检测血糖更早地发现静脉注射胰岛素过量的问题。

测定β-羟丁酸的方法有滴定法、比重法、比色法，这些测定方法都是半定量的，用气相色谱法无特异性，毛细管等速电泳法不适于临床大批量的化验。有关文献介绍了酶法动力学测定β-羟丁酸的方法，其主要原理是利用β-羟丁酸在β-羟丁酸脱氢酶的作用下生成乙酰乙酸、还原型辅酶I(NADH)及氢离子，反应生成的还原型辅酶I(NADH)在340nm吸光度的变化可以间接反映病人血清中的β-羟丁酸的浓度，但是该方法灵敏度不高。另一种酶法测定β-羟丁酸的原理是在动力学法的基础上偶联黄递酶，使硝基四氮唑蓝(氧化型INT)和NADH在黄递酶的作用下生成红色的还原型INT，在特定波长测定吸光度变化，从而计算出样品中β-羟丁酸的含量。这一方法较动力学灵敏度提高许多，但是利用该方法生产出的试剂稳定性差，并且抗干扰能力不强。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有试剂盒存在的缺陷，提供一种稳定酶法检测血清中β-羟丁酸含量(β-HB)的检测试剂盒。采用本发明的检测试剂盒来检测血清中的β-HB含量，可达到操作简便、特异性好，快速、测定结果准确可靠的目的。

本发明检测B-HB含量的原理是：血清β-羟丁酸在β-羟丁酸脱氢酶的催化下脱氢生成乙酰乙酸。而辅酶I则被还原成为还原型辅酶I。生成的还原型辅酶I和硝基四氮唑蓝(INT)在黄递酶的催化下生成还原型INT(红色)，据此可在505nm波长处测定吸光度的变化可计算出血清样本中β-羟丁酸的含量。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种稳定酶法测定血清中β-羟丁酸含量(β-HB)的检测试剂盒，包含试剂R1、试剂R2和校准品；所述试剂R1含有10～500mmol/L pH＝7.0～8.0的缓冲液、1～50mmol/L NAD⁺、1～10mmol/L氯化镁、0.1～20mmol/L硝基四氮唑蓝(INT)、1～100mmol/L稳定剂和0.1％～2％(即：占试剂R1的总重的重量百分比含量)防腐剂；试剂R2含有10～500mmol/L pH＝7.0～8.0的缓冲液、0.5～5KU/Lβ-羟丁酸脱氢酶、0.5～10KU/L黄递酶、1～45mmol/L蔗糖、10～30mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、1～100mmol/L稳定剂和0.1％～2％(即：占试剂R2的总重的重量百分比含量)防腐剂；校准品为含有0.5～2mmol/Lβ-羟丁酸的牛血清基质。

优选的，所述试剂R1中含有50～100mmol/L pH＝7.0～8.0的缓冲液、20～40mmol/LNAD⁺、5～10mmol/L氯化镁、10～20mmol/L硝基四氮唑蓝、50～100mmol/L稳定剂和1％～1.5％防腐剂；试剂R2含有50～100mmol/L pH＝7.0～8.0的缓冲液、1～2KU/Lβ-羟丁酸脱氢酶、5～10KU/L黄递酶、10～30mmol/L蔗糖、15～20mmol/L EDTA、50～80mmol/L稳定剂和1％～2％防腐剂。

优选的，所述试剂R1、R2中包含的缓冲液分别选自三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、丙磺酸(MOPS)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)中的一种或几种。

更优选的，所述试剂R1、R2中包含的缓冲液均为TRIS。发明人发现，在本发明的试剂体系中，该缓冲液对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。

优选的，所述试剂R1、R2中包含的防腐剂分别选自聚赖氨酸、山梨酸钾或乙酸钠。

更优选的，所述试剂R1、R2中包含的防腐剂均为聚赖氨酸。发明人发现，在本发明的试剂体系中，聚赖氨酸可抑制多种细菌，水溶性强，且安全性高。

优选的，所述试剂R1、R2中包含的稳定剂分别选自多元醇或牛血清白蛋白(BSA)；所述多元醇包括甘露醇。

优选的，以占牛血清基质体积用量的百分比计，所述校准品还包括叠氮钠0.2～2.2％、吐温-20 1～10％、牛血清白蛋白1～3％。

本发明还涉及一种前述检测试剂盒的使用方法，试剂R1加入样本后37℃孵育5分钟，读取吸光度A₀，再加入试剂R2，37℃孵育5分钟，读取吸光度A₁，计算吸光度变化率ΔA＝A₁-A₀；与β-HB标准品的β-羟丁酸含量与吸光度关系曲线进行比较，得到样本的β-羟丁酸含量。

优选的，所述试剂R1和试剂R2的体积比为3∶1。按此比例得到的试剂检测结果最为准确，试剂各方面性能均能达到标准。

优选的，所述监测采用的主波长为505nm，副波长为700nm。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明在R1试剂中加入了氯化镁，作为酶的激活剂，可加速反应时间。

2、本发明在R2试剂中加入蔗糖，对酶有保护作用，可提高试剂稳定性。

3、本发明在R2试剂中加入EDTA，可以有效络合重金属离子避免对酶的破坏，提高试剂抗干扰能力。

4、试验表明，应用本发明所述试剂盒检测β-羟丁酸结果准确度高，精密度好，而且本发明试剂盒稳定性佳，保存时间长。

5、本发明所述试剂盒适用范围广，便于推广使用，可应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定血清中β-羟丁酸的含量。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为β-HB参考标准的标准曲线，其中X轴表示β-HB的含量，Y轴表示吸光度；

图2为分别采用本发明试剂和德国德赛诊断系统有限公司的β-HB试剂，采用日立全自动生化分析仪对50份人血清(包含正常和异常标本)按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关分析的示意图；其中X轴表示的是本发明试剂测定的病人血清结果，Y轴表示的是德国德赛诊断系统有限公司试剂测定的病人血清结果，相关系数R²＝0.998，回归方程为y＝1.074x-0.002。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。以下实施例中的原料均为现有常用原料，可以直接通过商家购买获得。本发明以下实施例中没有特别说明的操作，均可以采用现有常规技术手段。

实施例1

测定试剂盒组成如下：

1.试剂R1为：

2.试剂R2为：

各种成分可以室温下依次添加，或者同时添加，或者是分别单独包装并于检测之前再即时配制。

3.牛血清基质校准品制备：

将经过处理的牛血清，加入牛血清白蛋白(BSA)1％，NaN₃ 0.9％，吐温-20 1％得到校准品稀释液。用β-羟丁酸溶于制备的血清基质的溶液，制备含β-羟丁酸浓度为lmmol/L的标准品。

4.试剂检测比例为3∶1

本实施例描述的β-HB检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表1。分析方法：两点终点法，即试剂R1、R2的用量分别为225ul和75ul，样本量6ul；225ul试剂R1加入6ul样本于37℃孵育5min，读取吸光度A₀，加入75ul R2，37℃孵育5min，读取吸光度A₁，计算ΔA＝A₁-A₀；检测主波长为505nm，副波长为700nm。

采用本试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的β-HB标准品的曲线(如图1所示)，其中X轴表示β-HB含量(mmol/L)；Y轴表示吸光度。

表1

实施例2

测定试剂盒组成如下：

1.试剂R1为：

2.试剂R2为：

各种成分可以室温下依次添加，或者同时添加，或者是分别单独包装并于检测之前再即时配制。

3.牛血清基质校准品制备：

将经过处理的牛血清，加入BSA 2％，NaN₃ 0.2％、吐温-20 5％得到校准品稀释液。用β-羟丁酸溶于制备的血清基质的溶液，制备含β-羟丁酸浓度为lmmol/L的标准品。

4.试剂检测比例为3∶1

本实施例描述的β-HB检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表1。分析方法：两点终点法，即试剂R1、R2的用量分别为225ul和75 ul，样本量6 ul；225ul试剂R1加入6ul样本于37℃孵育5min，读取吸光度A₀，加入75ul R2，37℃孵育5min，读取吸光度A₁，计算ΔA＝A₁-A₀；检测主波长为505nm，副波长为700nm。

实施例3

测定试剂盒组成如下：

1.试剂R1为：

2.试剂R2为：

各种成分可以室温下依次添加，或者同时添加，或者是分别单独包装并于检测之前再即时配制。

3.牛血清基质校准品制备：

将经过处理的牛血清，加入BSA 3％，NaN₃ 2.2％，吐温-20 10％得到校准品稀释液。用β-羟丁酸溶于制备的血清基质的溶液，制备含β-羟丁酸浓度为1mmol/L的标准品。

4.试剂检测比例为3∶1

本实施例描述的β-HB检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表1。分析方法：两点终点法，即试剂R1、R2的用量分别为225ul和75ul，样本量6ul；225ul试剂R1加入6ul样本于37℃孵育5min，读取吸光度A₀，加入75ul R2，37℃孵育5min，读取吸光度A₁，计算ΔA＝A₁-A₀；检测主波长为505nm，副波长为700nm。

实施例4、检测试剂的相关性试验

使用本法发明试剂(具体配方同实施例1)和对照试剂德国德赛诊断系统有限公司的β-HB试剂，采用自动7170全自动生化分析仪对50份人血清(包括正常和异常标本)按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关性分析。按照与上述“表1”中的参数进行测定，测定结果见图2，X，Y轴均为测定值(β-HB的含量mmol/L)，由图2的结果看出，两种试剂的相关系为R²＝0.998，回归方程为y＝1.074x-0.002。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。

此外，以上实验是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。

实施例5、重复性试验

本实验目的是检测试剂重复性。

采用实施例1试剂、对照试剂(浙江奥的特生物)、标准品、空白溶液(一般是生理食盐水和精制水)、正常人血清样本。

机器：日立7170自动生化分析仪。

操作步骤：测试10次血清样本，计算平均数和SD数值，求得CV数值。

结果解析：根据检测数据，计算CV数值，CV数值越接近0，表示重复性越好。

表2表示发明试剂和奥的特生物试剂重复性结果，由表2可知，本发明试剂检测β-HB的变异系数CV＝0.92％，奥的特生物试剂检测β-HB的变异系数CV＝2.10％，本发明试剂检测试剂的CV值小于奥的特生物试剂，表明本发明试剂重复性好。

实施例2、3试剂的重复性试验同上，检测结果基本同实施例1，表明本发明试剂具有良好的重复性。

表2

序号	本发明试剂	奥的特生物试剂
			1	1.28	1.25
2	1.25	1.27
			3	1.26	1.31
4	1.28	1.27

5	1.27	1.31
			6	1.27	1.25
7	1.26	1.27
			8	1.25	1.25
9	1.28	1.29
			10	1.27	1.32
平均值	1.267	1.279
			SD	0.01	0.03
CV％	0.92％	2.10％

实施例6、稳定性实验

本实验目的是检测试剂稳定性。

操作步骤：利用日立7170全自动生化分析仪，检测在2-8℃环境下不同时间的实施例1所述试剂的空白吸光度，比较其吸光度变化。采用纯水作为空白样本在生化分析仪上检测，根据要求记录检测样本吸光度。如样本空白吸光度则在测试主波长下，记录仪器测试读数结束时(该项目设置参数的末尾一点)的吸光度。

表3表示发明试剂和奥的特生物试剂稳定性结果，由表3可知，与奥的特生物试剂相比，本发明试剂半年内空白吸光度变化明显小于奥的特生物试剂的空白吸光度，表明本发明所述试剂稳定性优于奥的特生物试剂。

实施例2、3试剂的稳定性试验同上，检测结果基本同实施例1，表明本发明试剂具有良好的稳定性。

表3

时间(d)	本发明试剂	奥的特生物试剂
			0	0.0358	0.0356
1	0.0359	0.0358
			7	0.0362	0.0388
14	0.0368	0.0392
			30	0.0373	0.0417
60	0.0385	0.0455
			90	0.0401	0.0483
180	0.0412	0.0641

实施例7、干扰物质影响(抗干扰能力)

将浓度为1mmol/Lβ-HB校准品溶液，分别加入相同体积的各干扰物质溶液，加入后浓度分别为胆红素(50mg/L)、血红蛋白(400mg/L)和乳糜(福尔马肼)浊度为3000，每个样本重复测定3次，取平均值，与加入同体积的蒸馏水比较，观察加入干扰物质与加入蒸馏水后β-HB测定值的相对误差，相对误差不超过±10％视为结果不受干扰。表4结果表明：本发明试剂加入以上浓度干扰物质的与加入同体积蒸馏水后测定值的相对误差不超过4％，可以认为在中轻度溶血、黄疸或乳糜时，此测定方法的检测结果基本不受干扰。表5结果表明：奥的特生物试剂加入以上浓度干扰物质的与加入同体积蒸馏水后测定值的相对误差均超过10％，表明本发明试剂抗干扰能力由于奥的特生物试剂。

实施例2、3试剂的抗干扰试验同上，检测结果基本同实施例1，表明本发明试剂具有良好的抗干扰能力。

表4

加入的抗干扰物质	测定均值(mmol/L)	相对误差
			蒸馏水	1.02
胆红素(50mg/L)	1.05	2.94％
			血红蛋白(400mg/L)	1.06	3.92％
乳糜浊度为3000	1.03	0.98％

表5

加入的抗干扰物质	测定均值(mmol/L)	相对误差
			蒸馏水	1.03
胆红素(50mg/L)	1.18	14.56％
			血红蛋白(400mg/L)	1.15	11.65％
乳糜浊度为3000	1.25	21.36％

实施例8、最低检测限试验

本实验目的是检测试剂在测试临床样本时的最小检出感度。

采用实施例1试剂、对照试剂(奥的特生物)、标准品、空白溶液(一般是生理食盐水和精制水)、正常人血清样本。

机器：日立7170自动生化分析仪。

操作步骤：使用生理食盐水或是去离子水溶解样本，然后50％稀释成5个点，和零点一起每一个样本测试5次，计算平均值，求得SD数值。

结果解析：根据检测数据，计算SD数值和CV数值，分别计算1SD，2SD，从最小的开始，其平均值-2SD的数值在零点平均值+2SD以上的就是试剂的最小检出感度。表6、7分别表示发明试剂和奥的特生物试剂最低检测限结果；由表6、7可知，本发明试剂测定稀释1/16血清时，测定平均值-2SD的数值小于于零点平均值+2SD，测定稀释1/8、1/4、1/2血清时，测定平均值-2SD的数值大于零点平均值+2SD，表明本发明试剂最低检测限至少可以达到0.02mmol/L。而对照奥的特生物试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清，并比较血清平均值-2SD与零点平均值+2SD大小，其中1/16、1/8稀释平均值-2SD的数值小于零点平均值+2SD，1/4、1/2稀释平均值-2SD的数值大于零点平均值+2SD，表明奥的特生物试剂最低检测限为0.12mmol/L左右。本发明试剂最低检测限明显好于奥的特生物试剂。

实施例2、3试剂的最低检测限试验同上，检测结果基本同实施例1，表明本发明试剂最低检测限至少可以达到0.02mmol/L。

表6

表7

实施例9、氯化镁对反应的影响

表8表示本发明试剂、不加激活剂氯化镁的试剂和加入另一种激活剂还原型谷胱甘肽的试剂检测样本时反应达到终点所需要的时间；表8结果显示，在样本β-HB浓度相同情况下，加入激活剂氯化镁的反应速度明显比加入还原型谷胱甘肽和不加氯化镁达到反应终点的速度快，表明氯化镁对该反应有明显的激活作用。

表8

实施例10、酶保护剂对β-羟丁酸检测试剂的影响

检测本发明试剂、不加酶保护剂(蔗糖)试剂、加入酶保护剂乙醇的试剂对β-羟丁酸脱氢酶的影响。

表9表示本发明试剂、不加酶保护剂蔗糖的试剂和加入另一种酶保护剂乙醇的试剂一年内β-羟丁酸脱氢酶活性的变化；表9结果显示，未加保护剂的试剂在一年之内β-羟丁酸脱氢酶的活性从100％降到20％，加入保护剂乙醇的试剂一年内的酶活性下降50％，而加入保护剂蔗糖的试剂一年内的酶活性仅下降20％，一年后加保护剂蔗糖的试剂与没加保护剂的试剂相比，β-羟丁酸脱氢酶的活性升高60％，加入蔗糖的试剂和加入乙醇的试剂相比，酶活性提升30％。结果表明蔗糖对酶的保护作用很强，并且比乙醇更有效，随着时间的推移，对酶的保护作用会更明显，从而提高本发明试剂的稳定性。

表9

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种稳定酶法检测血清中β-羟丁酸含量的检测试剂盒，其特征在于，包含试剂R1、试剂R2和校准品；所述试剂R1含有10～500mmol/L pH＝7.0～8.0的缓冲液、1～50mmol/L NAD⁺、1～10mmol/L氯化镁、0.1～20mmol/L硝基四氮唑蓝、1～100mmol/L稳定剂和0.1％～2％防腐剂；试剂R2含有10～500mmol/L pH＝7.0～8.0的缓冲液、0.5～5KU/Lβ-羟丁酸脱氢酶、0.5～10KU/L黄递酶、1～45mmol/L蔗糖、10～30mmol/L EDTA、1～100mmol/L稳定剂和0.1％～2％防腐剂；校准品为含有0.5～2mmol/Lβ-羟丁酸的牛血清基质。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中含有50～100mmol/L pH＝7.0～8.0的缓冲液、20～40mmol/L NAD⁺、5～10mmol/L氯化镁、10～20mmol/L硝基四氮唑蓝、50～100mmol/L稳定剂和1％～1.5％防腐剂；试剂R2含有50～100mmol/L pH＝7.0～8.0的缓冲液、1～2KU/Lβ-羟丁酸脱氢酶、5～10KU/L黄递酶、10～30mmol/L蔗糖、15～20mmol/L EDTA、50～80mmol/L稳定剂和1％～2％防腐剂。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1、R2中包含的缓冲液分别选自TRIS、MOPS、HEPES中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1、R2中包含的缓冲液均为TRIS。

5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1、R2中包含的防腐剂分别选自聚赖氨酸、山梨酸钾或乙酸钠。

6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1、R2中包含的稳定剂分别选自多元醇或牛血清白蛋白；所述多元醇包括甘露醇。

7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，以占牛血清基质体积用量的百分比计，所述校准品还包括叠氮钠0.2～2.2％、吐温-20 1～10％、牛血清白蛋白1～3％。

8.一种根据权利要求1～7中任一项所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，试剂R1加入样本后37℃孵育5分钟，读取吸光度A₀，再加入试剂R2，37℃孵育5分钟，读取吸光度A₁，计算吸光度变化率ΔA＝A₁-A₀；与β-HB标准品的β-羟丁酸含量与吸光度关系曲线进行比较，得到样本的β-羟丁酸含量。

9.根据权利要求8所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2的体积比为3∶1。

10.根据权利要求8所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述监测采用的主波长为505nm，副波长为700nm。