CN103528977A - 一种血清β-羟丁酸试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种血清β-羟丁酸试剂盒及其检测方法，血清β-羟丁酸试剂盒，它包括R1与R2试剂，R1试剂包含如下组分：磷酸钾缓冲液100～150mmol/L，PH7～8；辅酶2～5mmol/L；黄递酶2～5KU/L；氯化硝基四氮唑兰0.5～1mmol/L；BSA0.5～1g/L；海藻糖2～5g/L；R2试剂包含如下组分：酸钾缓冲液100～150mmol/L，PH7～8；β-羟丁酸脱氢酶20～50KU/L；BSA2～5g/L。本发明的试剂盒采用氯化硝基四氮唑兰作为显色剂，具有稳定性好，线性高，抗干扰能力强和成本低的特点；本发明的血清β-羟丁酸检测方法，能有效提高减少非特异性还原物质的干扰，消除标准液的基质效应和脂浊现象，具有广泛的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种血清β-羟丁酸的试剂盒及其检测方法，具体的说是一种酶比色法检测血清β-羟丁酸的方法。
背景技术
肝脏生成酮体，肝外组织能利用酮体作为能量来源，在正常情况下血中仅含少量酮体；但在某些情况下，如饥饿、糖尿病、高脂低糖膳食等由于脂肪动员增强，肝脏生成酮体量超过肝外组织利用酮体的能力，引起血中酮体的堆积，可导致酮症酸中毒，特别在糖尿病病人中酮症酸中毒非常常见。
对酮症酸中毒的诊断与疗效观察常需测定血液中酮体的浓度，酮体是脂肪酸分解代谢的产物，包括三种成分：β-羟丁酸、乙酰乙酸和丙酮，其中β-羟丁酸是主要的成分，约占酮体总量的70％，因此一般以检测血清β-羟丁酸的浓度反映体内酮体的水平。
血清β-羟丁酸检测方法有气相色谱法、分光光度法和酶法，酶法测定血清β-羟丁酸因具有准确、简便、快速、灵敏和特异的特点，受到临床的重视。现有常用β-羟丁酸试剂盒所用的显色剂均为INT，即：碘硝基氯化四氮唑蓝；使用INT作为显色剂存在抗干扰效果不好的特点，因此，如何改进现有技术的缺点与不足，为广大患者造福，是亟待解决的技术难题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题是，提供一种血清β-羟丁酸试剂盒及其检测方法，采用氯化硝基四氮唑兰作为显色剂，具有稳定性好，线性高，抗干扰能力强和成本低的特点；同时检测方法解决了基质效应问题，有效提高了检测的准确度。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是，提供一种血清β-羟丁酸试剂盒，它包括R1与R2试剂，所述R1试剂包含如下组分：
磷酸钾缓冲液， 100～150 mmol/L，PH7～8；
辅酶， 2～5mmol/L；
黄递酶， 2～5KU/L；
氯化硝基四氮唑兰， 0.5～1mmol/L；
BSA， 0.5～1g/L；
海藻糖， 2～5g/L；
所述R2试剂包含如下组分：
磷酸钾缓冲液， 100～150 mmol/L，PH7～8；
β-羟丁酸脱氢酶， 20～50KU/L；
BSA， 2～5g/L。
上述的血清β-羟丁酸试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
第一步，预备：
提供标准液、血清β-羟丁酸测定试剂盒R1与R2试剂以及待测标本；其中，标准液采用健康人血清为基质；
第二步，初步混匀：
取6ul待测标本和R1试剂240～280ul混匀，置30-45℃孵育3～5分钟；
第三步，二次混匀：
取R2试剂40～70ul与上述混合液混匀，孵育180～240秒后，空白管调零，读取吸光度A1，90秒后读吸光度A2，其中，测区吸光度的主波长500～600nm，副波长650～750nm；
第四步，计算：
根据如下公式计算得出血清β-羟丁酸浓度：
血清β-羟丁酸（mmol/L）= ΔA测定×标准浓度/ΔA标准。
上述的血清β-羟丁酸试剂盒的检测方法，第一步，预备：
血清β-羟丁酸测定试剂盒R1与R2试剂与待测标本的比例为：40～50 : 8～12 : 1。
上述的血清β-羟丁酸试剂盒的检测方法，第一步，预备：
标准液采用健康人血清为基质，所述标准液的制备方法为：
用健康人血清混合，反复冻融数次至上层澄清，取澄清的上层液经0.15um～0.30um滤膜的过滤器过滤后，添加0.05%～0.1wt%生物防腐剂，混匀，待用。用做标准液的基质，经二级或一级参考品和参考测量方法量值溯源定值。
本发明具有如下优点及有益技术效果：
本发明的血清β-羟丁酸试剂盒设计成双试剂，R1内含β-羟丁酸进行反应的主要成分，采用磷酸钾缓冲液，PH7～8，此PH下有利于氯化硝基四氮唑兰和其他反应物的稳定和保存。R2的PH7～8有利于酶的稳定也为反应提供适宜的环境。
本发明的血清β-羟丁酸试剂盒检测血清β-羟丁酸的检测方法，能有效提高减少非特异性还原物质的干扰，消除标准液的基质效应和脂浊现象，解决氯化硝基四氮唑兰在贮存中的析出问题，具有广泛的市场前景。
本发明的血清β-羟丁酸试剂盒检测血清β-羟丁酸的检测方法还提供了一种人血清基质标准液的制备方法，解决了基质效应问题，提高检测的准确度。
具体实施方式
实施例1
本实施例的血清β-羟丁酸试剂盒，它包括R1与R2试剂，R1和R2均以水为溶剂。
R1试剂包含如下组分：
磷酸钾缓冲液， 150 mmol/L，PH7-8；
辅酶， 5mmol/L；
黄递酶， 5KU/L；
氯化硝基四氮唑兰， 1mmol/L；
BSA， 1g/L；
海藻糖， 5g/L；
R2试剂包含如下组分：
磷酸钾缓冲液， 150mmol/L，PH7-8；
β-羟丁酸脱氢酶， 50KU/L；
BSA， 5g/L。
本实施例的血清β-羟丁酸试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
第一步，预备：
提供标准液、血清β-羟丁酸测定试剂盒R1与R2试剂以及待测标本；血清β-羟丁酸测定试剂盒R1与R2试剂与待测标本的比例为：40 : 8 : 1。
其中，标准液采用健康人血清为基质；所述标准液的制备方法为：
用健康人血清混合，反复冻融数次至上层澄清，取澄清的上层液经0.15um滤膜的过滤器过滤后，添加0.05%生物防腐剂，混匀，待用。用做标准液的基质，经二级或一级参考品和参考测量方法量值溯源定值。
第二步，初步混匀：
取6ul待测标本和R1试剂240ul混匀，置30-45℃孵育3分钟；
第三步，二次混匀：
取R2试剂60ul与上述混合液混匀，孵育210秒后，空白管调零，读取吸光度A1，90秒后读吸光度A2，其中，测区吸光度的主波长540nm，副波长700nm；ΔA= A2- A1。
第四步，计算：
根据如下公式计算得出血清β-羟丁酸浓度：
血清β-羟丁酸（mmol/L）= ΔA测定×标准浓度/ΔA标准 。
实施例2
本实施例的血清β-羟丁酸试剂盒，它包括R1与R2试剂，R1和R2均以水为溶剂。
R1试剂包含如下组分：
磷酸钾缓冲液， 100mmol/L，PH7-8；
辅酶， 2mmol/L；
黄递酶， 2KU/L；
氯化硝基四氮唑兰， 0.5mmol/L；
BSA， 0.5g/L；
海藻糖， 2g/L；
R2试剂包含如下组分：
磷酸钾缓冲液， 100mmol/L，PH7-8；
β-羟丁酸脱氢酶， 20KU/L；
BSA， 2g/L。
本实施例的血清β-羟丁酸试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
第一步，预备：
提供标准液、血清β-羟丁酸测定试剂盒R1与R2试剂以及待测标本；血清β-羟丁酸测定试剂盒R1与R2试剂与待测标本的比例为：50 : 12: 1。
其中，标准液采用健康人血清为基质；所述标准液的制备方法为：
用健康人血清混合，反复冻融数次至上层澄清，取澄清的上层液经0.30um滤膜的过滤器过滤后，添加0.1wt%生物防腐剂，混匀，待用。用做标准液的基质，经二级或一级参考品和参考测量方法量值溯源定值。
第二步，初步混匀：
取6ul待测标本和R1试剂280ul混匀，置30-45℃孵育5分钟；
第三步，二次混匀：
取R2试剂70ul与上述混合液混匀，孵育240秒后，空白管调零，读取吸光度A1，90秒后读吸光度A2，其中，测区吸光度的主波长600nm，副波长750nm；ΔA= A2- A1。
第四步，计算：
根据如下公式计算得出血清β-羟丁酸浓度：
血清β-羟丁酸（mmol/L）= ΔA测定×标准浓度/ΔA标准 。
实施例3
本实施例的血清β-羟丁酸试剂盒，它包括R1与R2试剂，R1和R2均以水为溶剂。
R1试剂包含如下组分：
磷酸钾缓冲液， 120mmol/L，PH7-8；
辅酶， 3mmol/L；
黄递酶， 3KU/L；
氯化硝基四氮唑兰， 0.6mmol/L；
BSA， 0.7g/L；
海藻糖， 3g/L；
R2试剂包含如下组分：
磷酸钾缓冲液， 120mmol/L，PH7-8；
β-羟丁酸脱氢酶， 30KU/L；
BSA， 3g/L。
本实施例的血清β-羟丁酸试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
第一步，预备：
提供标准液、血清β-羟丁酸测定试剂盒R1与R2试剂以及待测标本；血清β-羟丁酸测定试剂盒R1与R2试剂与待测标本的比例为：45 : 10: 1。
其中，标准液采用健康人血清为基质；所述标准液的制备方法为：
用健康人血清混合，反复冻融数次至上层澄清，取澄清的上层液经0.20um滤膜的过滤器过滤后，添加0.1wt%生物防腐剂，混匀，待用。用做标准液的基质，经二级或一级参考品和参考测量方法量值溯源定值。
第二步，初步混匀：
取6ul待测标本和R1试剂265ul混匀，置30-45℃孵育5分钟；
第三步，二次混匀：
取R2试剂40ul与上述混合液混匀，孵育180秒后，空白管调零，读取吸光度A1，90秒后读吸光度A2，其中，测区吸光度的主波长500nm，副波长650nm；ΔA= A2- A1。
第四步，计算：
根据如下公式计算得出血清β-羟丁酸浓度：
血清β-羟丁酸（mmol/L）= ΔA测定×标准浓度/ΔA标准 。
实施例4
本实施例的血清β-羟丁酸试剂盒，它包括R1与R2试剂，R1和R2均以水为溶剂。
R1试剂包含如下组分：
磷酸钾缓冲液， 135mmol/L，PH7-8；
辅酶， 4mmol/L；
黄递酶， 4KU/L；
氯化硝基四氮唑兰， 0.8mmol/L；
BSA， 0.9g/L；
海藻糖， 4g/L；
R2试剂包含如下组分：
磷酸钾缓冲液， 135mmol/L，PH7-8；
β-羟丁酸脱氢酶， 40KU/L；
BSA， 4g/L。
本实施例的血清β-羟丁酸试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
第一步，预备：
提供标准液、血清β-羟丁酸测定试剂盒R1与R2试剂以及待测标本；血清β-羟丁酸测定试剂盒R1与R2试剂与待测标本的比例为：40 : 8: 1。
其中，标准液采用健康人血清为基质；所述标准液的制备方法为：
用健康人血清混合，反复冻融数次至上层澄清，取澄清的上层液经0.25um滤膜的过滤器过滤后，添加0.1wt%生物防腐剂，混匀，待用。用做标准液的基质，经二级甚至一级参考品和参考测量方法量值溯源定值。
第二步，初步混匀：
取6ul待测标本和R1试剂275ul混匀，置30-45℃孵育4分钟；
第三步，二次混匀：
取R2试剂50ul与上述混合液混匀，孵育200秒后，空白管调零，读取吸光度A1，90秒后读吸光度A2，其中，测区吸光度的主波长560nm，副波长720nm；ΔA= A2- A1。
第四步，计算：
根据如下公式计算得出血清β-羟丁酸浓度：
血清β-羟丁酸（mmol/L）= ΔA测定×标准浓度/ΔA标准 。
根据上述实施例1-4的技术方案得到的实验测试结果：
1.本发明血清中β-羟丁酸测定方法达到的几项技术指标：
a.测定参考值范围：0.03～0.3mmol/L
b.线性范围：0～7mmol/L ,判定依据 r2≥0.999
c.精密度：n=30 批内 =0.12 CV=0.9%
批间 =0.123 CV=1.3%
d.准确度相对偏差≤±1%
2.R1试剂在保存条件下的稳定性
将R1试剂分别置于24～26℃、2～8℃环境下，一年后复测以下指标：
表1 R1试剂在不同贮存条件下的稳定性
| 新鲜 | 24～26℃一年 | 2～8℃ 一年 | |
| 空白吸光度 | 0.0003 | 0.006 | 0.0010 |
| R1中的黄递酶活性 | 100% | 80% | 98% |
黄递酶为该试剂盒中最不稳定的物质，现以最初酶活性100%为基准。从表1得出结论：试剂R1和R2贮存一年相对稳定。
3.测定试剂盒最大线性范围、定标的K因数和高、中、低三个水平质控血清的稳定性（上述三方面为行业内评价试剂盒稳定性的指标）：
表2 试剂盒稳定性测试结果
从表2可以看到：从以上三方面观察试剂盒都是稳定的。
4.与朗道测定法的相关性：本试剂与朗道测定法比较，用二法同测样品110份，得相关系数 r=0.991，线性拟合Y=0.9805X-0.0016，二法相关良好。
5.关于干扰性：通过对该试剂盒进行抗干扰实验实测结果如下：
黄疸：胆红素浓度<60umol/L
脂血：相当于甘油三酯<1500mg/L
溶血：相当于血红蛋白<500mg/L
抗坏血酸浓度：<200umol/L
尿酸浓度：<40mg/DL
实验结果表明：只有当病人血清中的含量超过上述这些值时才会对测试值造成一定影响，普通常规的病人血清都无干扰。
以上所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是，凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种血清β-羟丁酸试剂盒，它包括R1与R2试剂，其特征在于：
所述R1试剂包含如下组分：
磷酸钾缓冲液， 100～150 mmol/L，PH7～8；
辅酶， 2～5mmol/L；
黄递酶， 2～5KU/L；
氯化硝基四氮唑兰， 0.5～1mmol/L；
BSA， 0.5～1g/L；
海藻糖， 2～5g/L；
所述R2试剂包含如下组分：
磷酸钾缓冲液， 100～150mmol/L，PH7～8；
β-羟丁酸脱氢酶， 20～50KU/L；
BSA， 2～5g/L。
2.权利要求1所述的血清β-羟丁酸试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步，预备：
提供标准液、血清β-羟丁酸测定试剂盒R1与R2试剂以及待测标本；其中，标准液采用健康人血清为基质；
第二步，初步混匀：
取6ul待测标本和R1试剂240～280ul混匀，置30-45℃孵育3～5分钟；
第三步，二次混匀：
取R2试剂40～70ul与上述混合液混匀，孵育180～240秒后，空白管调零，读取吸光度A1，90秒后读吸光度A2，其中，测区吸光度的主波长500～600nm，副波长650～750nm；
第四步，计算：
根据如下公式计算得出血清β-羟丁酸浓度：
血清β-羟丁酸（mmol/L）= ΔA测定×标准浓度/ΔA标准 。
3.根据权利要求2所述的血清β-羟丁酸试剂盒的检测方法，其特征在于：
第一步，预备：
血清β-羟丁酸测定试剂盒R1与R2试剂与待测标本的比例为：40～50 : 8～12 : 1。
4.根据权利要求2所述的血清β-羟丁酸试剂盒的检测方法，其特征在于：
第一步，预备：
标准液采用健康人血清为基质，所述标准液的制备方法为：
用健康人血清混合，反复冻融数次至上层澄清，取澄清的上层液经0.15um～0.30um滤膜的过滤器过滤后，添加0.05%～0.1wt%生物防腐剂，混匀，待用；用做标准液的基质，经二级或一级参考品和参考测量方法量值溯源定值。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |