CN104111253A - 一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的制备方法 - Google Patents

一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的制备方法 Download PDF

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王福进
管利丰
张懿
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Abstract

本发明涉及一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的制备方法，包括：滤纸在第一相浸液中浸润后，在30-50℃热风干燥，得到酶试剂层；滤纸在第二相浸液中浸润后，在30-50℃热风干燥，得到显色剂层；将海绵棒在抗抗坏血酸浸润液中浸润，40-60℃热风烘干，得到抗抗坏血酸海绵棒；依次将显色剂层、酶试剂层切割成的试纸块，压在上盖显色孔下，抗抗坏血酸海绵棒一端上，即得。本发明解决了现有试纸只能冷藏保存，常温状态不稳定；GHB脱氢酶和抗坏血酸有交叉反应，使存在抗坏血酸的样品产生假阳性反应，得出错误结果；很多饮料本身有颜色，会干扰检测结果等问题。

Description

一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的制备方法
技术领域
本发明属于检测4-羟基丁酸试纸的制备领域，特别涉及一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的制备方法。
背景技术
GHB全名Gamma-Hydroxybutyrate(伽马-羟基丁酸及其钠盐)是一种麻醉药品。60年代初医学上利用GHB作为麻醉剂，后来发现GHB的不良副作用，便停止使用，只利用作为安眠药之用。90年代不法分子开始使用GHB作为娱乐，犯罪之用。GHB是白色粉状，溶于水后无色，液体状称为G水。GHB无气味，味微咸。GHB的服后反应跟酒精相似。小剂量会令人放松、个人防线放开、精神赳振及有类似轻微喝醉的兴奋感觉。中份量会令人头昏眼花、眼睛不能对准焦点、心情愉悦、能投入音乐、跳舞及谈话。没有时间观念，及不停点头。服用过量(OD)会令人无意识地不停点头或陷入无意识状态，极度眩晕，没有方向感及呕吐。严重过量会中毒，中毒者会全无意识、身体抽搐，呕吐及吸呼严重下降。于服用后10-20分钟会开始有反应，主要药效反应可维持1-3小时，剩余反应约会维持2-4小时甚至更久。如果GHB混合其他药物或酒精，很容易会导致服用者“OD”，更甚者更会昏迷及死亡。
由于GHB为无色无味的药物，而且会混合水来服用，因此服用者根本没有可能知道自己所服用的份量为多少，亦因为这个原因所以很容易会发生服用过量的意外。就算是轻度的服用过量亦会令服用者失去意识甚至进入昏迷，或死亡。GHB确是一种非常危险的毒品。就2000年1月美国所发表的报告，单在1月份美国已有60个服用GHB后死亡的个案，由此可以知道它的危险性。不论在生理或心理上GHB都会令使用者上瘾的。
由于其上述特性，不法分子用它来作为迷幻药，迷奸青年女性，抢劫财物，被害人清醒后难以回忆起之前发生的一切。社会危害很大。《Reliable,Sensitive,Rapid and QuantitativeEnzyme-Based Assay for Gamma-Hydroxybutyric Acid(GHB)》(Dawn T.Bravo等著)中介绍了GHB脱氢酶的制备及检测ghb的试纸的制备，但是，该方法存在一些严重的问题：试纸只能冷藏保存，常温状态不稳定；GHB脱氢酶和抗坏血酸有交叉反应，使存在抗坏血酸的样品产生假阳性反应，得出错误结果；很多饮料本身有颜色，会干扰检测结果。而本发明涉及一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸的检测装置制备方法，解决了这些问题。本发明的出现解决了上述问题，使检测结果更准确可靠。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的制备方法，该方法可以抗检测液中的色素，维生素C等的影响，能够常温保存，专一性和灵敏度好。可以用于预防约会强奸，迷奸，及警方侦破案件时现场筛查鉴定。
本发明的一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的制备方法，包括：
(1)滤纸在第一相浸液中浸润后，在30-50℃热风干燥，得到酶试剂层；
(2)滤纸在第二相浸液中浸润后，在30-50℃热风干燥，得到显色剂层；
(3)将海绵棒在抗抗坏血酸浸润液中浸润，40-60℃热风烘干，得到抗抗坏血酸海绵棒；
(4)依次将显色剂层、酶试剂层切割成的试纸块，压在上盖显色孔下，抗抗坏血酸海绵棒一端上，得到抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸，其中显色剂层在上，酶试剂层在下。
所述步骤(1)中滤纸为滤纸whatman23sl。
所述步骤(1)中第一相浸液配制过程具体为：每配制总体积为100ml的浸液，在pH＝8.8-10.8，浓度为40mmol/L-80mmol/L Tris-盐酸缓冲液中，分别溶入稳定剂和保护剂0.1-10g，NAD+辅酶I0.1-2.0g，黄递酶200-20000iu，4-羟基丁酸脱氢酶2000-100000iu。
所述稳定剂和保护剂为天然或人工聚合高分子胶体。
所述聚合高分子胶体为肝素、右旋糖酐，海藻糖、PEG10000、牛血清蛋白中的一种或几种。所述步骤(2)中滤纸为whatman593。
所述步骤(2)中第二相浸液为：每100ml溶剂中溶入0.1-0.5g氯化硝基四氮唑蓝。
所述溶剂为甲醇或乙醇。
所述步骤(3)中抗抗坏血酸浸润液为：每配制100ml的浸润液，在pH＝8.8-10.8，浓度为40mmol/L-80mmol/L Tris-盐酸缓冲液中溶入抗坏血酸氧化酶20-50mg，2,6-二氯酚靛酚钠50-200mg。
所述步骤(4)中试纸块为0.3×0.3-0.8×0.8cm。
本发明中将待测样品加在海绵棒另一端的加样孔处，使样品在向显色孔扩散过程中去除夹杂其中的色素和抗坏血酸，消除二者的干扰，使结果更可靠。
本发明的原理：
反应原理：
NAD(P)H+NBT→NAD(P)++formazan
NAD(P)H+NBT→NAD(P)++formazan
其中NAD+：辅酶I；NADH：还原辅酶I；Diaphorase：黄递酶；NBT:硝基四氮唑蓝，氯化硝基四氮唑蓝一类显色剂；formazan：甲臜(为蓝紫色化合物)。
生成的formazan的显色程度与待测体液的4-羟基丁酸浓度正相关，可以制成标准色卡，显色的程度与标准色可比较从而半定量测定4-羟基丁酸浓度。
有益效果
本发明试纸克服了现有试纸存在只能冷藏保存，常温状态不稳定；GHB脱氢酶和抗坏血酸有交叉反应，使存在抗坏血酸的样品产生假阳性反应，得出错误结果；很多饮料本身有颜色，会干扰检测结果的缺陷；
本发明方法可以抗检测液中的色素，维生素C等的影响，能够常温保存，专一性和灵敏度好。可以用于预防约会强奸，迷奸，及警方侦破案件时现场筛查鉴定。
附图说明
图1为本发明制备的抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的示意图；其中1装置下盖，2装置上盖，3加样孔，4显色孔，5酶试剂层，6显色剂层，7海绵棒；
图2为加入相同GHB的水、苹果汁、橙汁的试纸检测显色图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
第一相酶溶液液总体积为100mL的配制过程如下：
1)配pH8.0的50mmol/L Tris-盐酸缓冲液；
2)溶入牛血清白蛋白500mg；
3)溶入NAD+0.5g；
4)溶入黄递酶，10000iu；
5)溶入，4-羟基丁酸脱氢酶100000iu。
第一相酶试剂层溶液浸渍：
溶液制备好后，加入浸渍机，将一卷whatman23sl滤纸安装好，烘干温度设定50℃，走纸速度设定3.0。开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干。
第二相显色剂层溶液制备：
100ml乙醇溶液，溶入氯化硝基四氮唑蓝400mg。
第二相溶液浸渍：
593超薄滤纸安装好，烘干温度设定50℃，走纸速度设定3.0。开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干。
抗抗坏血酸海绵棒浸液总体积为100mL时的配制过程如下：
(1)配pH＝8.8-10.8的40mmol/L-80mmol/L Tris-盐酸缓冲液；
(2)溶入抗坏血酸氧化酶50mg；
(3)溶入2,6-二氯酚靛酚钠5mg。
Hcg测试笔用海绵棒浸润于上述溶液，50℃烘干。
测试装置制作：
1)取一段酶试剂层原纸，用5mm滚刀切成5mm细条，再切成5mm宽的试剂块，放到黑色密闭瓶中，放好干燥剂备用。
2)取一段显色剂层原纸，用5mm滚刀切成5mm细条，再切成5mm宽的试剂块，放到黑色密闭瓶中，放好干燥剂备用。
3)取一根备用的海绵棒，装入下盖槽中，显色孔一端依次压上酶试剂层和显色剂层原纸，盖紧上盖备用。
雪碧饮料4-羟基丁酸浓度的测定：
4-羟基丁酸钠、雪碧饮料，称取0.5g4-羟基丁酸钠，加入300ml雪碧饮料中溶解，未加4-羟基丁酸钠的雪碧饮料作为阴性对照，取2根试装置，加样孔分别滴入上述2种溶液200ul，溶液扩散浸润显色孔记时，2分钟看颜色，结果从阴性的黄色到，阳性紫色梯度区分明显。
苹果汁(鲜榨)橙汁(鲜榨)，分别称取0.5g4-羟基丁酸钠，加入300ml苹果汁(鲜榨)橙汁(鲜榨)中溶解，未加4-羟基丁酸钠的上述果汁作为阴性对照。取4滴上述4种溶液滴入加样孔中，显色孔处浸湿，然后2分钟看颜色，橙汁结果从阴性的黄色到，阳性紫色梯度区分明显。苹果汁结果从阴性的黄色到，阳性紫色梯度区分明显。
实施例2
第一相酶溶液液总体积为100mL的配制过程如下：
1)配pH8.0的50mmol/L Tris-盐酸缓冲液；
2)溶入牛血清白蛋白500mg；
3)溶入NAD+0.5g；
4)溶入黄递酶，10000iu；
5)溶入，4-羟基丁酸脱氢酶50000iu。
第一相酶试剂层溶液浸渍：
溶液制备好后，加入浸渍机，将一卷whatman23sl滤纸安装好，烘干温度设定50℃，走纸速度设定3.0。开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干。
第二相显色剂层溶液制备：
100ml乙醇溶液，溶入氯化硝基四氮唑蓝300mg
第二相溶液浸渍：
593超薄滤纸安装好，烘干温度设定50℃，走纸速度设定3.0。开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干。
抗抗坏血酸海绵棒浸液总体积为100mL时的配制过程如下：
(1)配pH＝8.6的40mmol/L-80mmol/L Tris-盐酸缓冲液；
(2)溶入抗坏血酸氧化酶45mg；
(3)溶入2,6-二氯酚靛酚钠100mg
Hcg测试笔用海绵棒浸润于上述溶液，50℃烘干。
测试装置制作：
1)取一段酶试剂层原纸，用5mm滚刀切成5mm细条，再切成5mm宽的试剂块，放到黑色密闭瓶中，放好干燥剂备用。
2)取一段显色剂层原纸，用5mm滚刀切成5mm细条，再切成5mm宽的试剂块，放到黑色密闭瓶中，放好干燥剂备用。
3)取一根备用的海绵棒，装入下盖槽中，显色孔一端依次压上酶试剂层和显色剂层原纸，盖紧上盖备用。
紫色葡萄汁(鲜榨)，分别称取0.5g4-羟基丁酸钠，加入300ml紫色葡萄汁中溶解，未加4-羟基丁酸钠的上述果汁作为阴性对照。取200ul上述2种溶液滴入过加样孔中，然后2分钟看显色孔处颜色，葡萄汁阴性显黄色，阳性紫色梯度区分明显，此装置克服了葡萄汁紫色的干扰。

Claims (8)

1.一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的制备方法，包括：
(1)滤纸在第一相浸液中浸润后，在30-50℃热风干燥，得到酶试剂层；
(2)滤纸在第二相浸液中浸润后，在30-50℃热风干燥，得到显色剂层；
(3)将海绵棒在抗抗坏血酸浸润液中浸润，40-60℃热风烘干，得到抗抗坏血酸海绵棒；
(4)依次将显色剂层、酶试剂层切割成的试纸块，压在上盖显色孔下，抗抗坏血酸海绵棒一端上，得到抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸。
2.根据权利要求1所述的一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中第一相浸液配制过程具体为：每配制总体积为100ml的浸液，在pH＝8.8-10.8，浓度为40mmol/L-80mmol/L的Tris-盐酸缓冲液中，分别溶入稳定剂和保护剂0.1-10g，NAD+辅酶I0.1-2.0g，黄递酶200-20000iu，4-羟基丁酸脱氢酶2000-100000iu。
3.根据权利要求2所述的一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的制备方法，其特征在于：所述稳定剂和保护剂为聚合高分子胶体。
4.根据权利要求3所述的一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的制备方法，其特征在于：所述聚合高分子胶体为肝素、右旋糖酐，海藻糖、PEG10000、牛血清蛋白中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中第二相浸液为：每100ml溶剂中溶入0.1-0.5g氯化硝基四氮唑蓝。
6.根据权利要求5所述的一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的制备方法，其特征在于：所述溶剂为甲醇或乙醇。
7.根据权利要求1所述的一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中抗抗坏血酸浸润液为：每配制100ml的浸润液，在pH＝8.8-10.8，浓度为40mmol/L-80mmol/L Tris-盐酸缓冲液中溶入抗坏血酸氧化酶20-50mg，2,6-二氯酚靛酚钠50-200mg。
8.根据权利要求1所述的一种抗抗坏血酸和色素干扰的4-羟基丁酸检测试纸的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中试纸块为0.3×0.3-0.8×0.8cm。
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Application publication date: 20141022

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