CN109612983A - 用于制作α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的反应液及干化学试纸 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于制作α‑羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的反应液及干化学试纸。该干化学试纸包括反应显色层,该反应显色层含有α‑羟丁酸、辅酶I、黄递酶和在黄递酶催化下能够与NADH起显色反应的显色剂。本发明制作的干化学试纸与小型仪器联用,只需采集微量血液便可在短时间内测出α‑羟丁酸脱氢酶含量,操作便捷,无需专业人员操作,且显色的强度高、均匀度好、污染小,检测过程不依赖大型生化分析仪,能够满足特殊条件下的市场需求,尤其是急诊应用,较之传统的通过液体生化试剂进行检测的方法,该干化学试纸可以为急诊科、基层医院、家庭和小型诊所等提供一种能够方便快速测量α‑羟丁酸脱氢酶活性的方法。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断产品领域,尤其是涉及一种用于制作α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的反应液及干化学试纸。
背景技术
α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH,EC1.1.1.30)主要来源于心肌、肾和红细胞,心肌中较多,肝中较少。α-羟丁酸脱氢酶不是一个独立的特异酶,而是含有H亚基的乳酸脱氢酶同工酶LDH1和LDH2的总称,普遍存在于人的体内,人体正常参考范围是(33℃):90-220U/L(酶速率法)。α-羟丁酸脱氢酶升高主要见于心肌梗死,另外恶性贫血、溶血性贫血、肾梗死、心肌损伤、心肌病、营养不良、叶酸和维生素B12缺乏时,α-羟丁酸脱氢酶活性亦可升高。心肌梗塞时血清α-羟丁酸脱氢酶活力增高,其活力可持续2周或更长时间,是诊断心肌梗塞的重要指标。α-羟丁酸脱氢酶又可用于鉴别肝病和心脏疾病,因肝病和心脏疾病均能引起乳酸脱氢酶(LDH)升高,但肝病时α-羟丁酸脱氢酶变化不明显,而心脏疾病则明显增高,同时心包炎、胆囊炎均不会引起α-羟丁酸脱氢酶增高。α-羟丁酸脱氢酶降低的情况诸如使用免疫抑制剂或抗癌剂(LDA也降低)等,另外遗传性变异的LDH-H亚型欠缺症也会导致LDH/α-HBDH比值下降。α-羟丁酸脱氢酶的活性与LDH的活性变化基本一致,但更能反映LDH1的活性变化,与LDH、AST、CK及CK-MB构成心肌酶谱,对诊断心肌梗死更有意义。一般需要检测α-羟丁酸脱氢酶的人群:腹胀、腹痛、心肌梗死、贫血、白血病及肝硬化等患者。
目前临床上主要采用液体生化试剂进行α-羟丁酸脱氢酶的活性测定,测定的原理如下:
α-羟丁酸脱氢酶催化α-酮丁酸还原成α-羟丁酸,同时使还原型辅酶Ⅰ(NADH)氧化成氧化型辅酶Ⅰ(NAD+),其氧化速率与样本中α-羟丁酸脱氢酶的活性成正比,通过测定340nm波长处NADH下降的速率,即可求出样本中α-羟丁酸脱氢酶的活性。
液体生化试剂以液体形态加工,储存和运输都不太方便,使用时需要配备大型生化仪器进行测定,价格昂贵,并且需要配备专业人员才能操作,一般只适用于大型医院大样本量的集中检测,而在急诊、病房、基层社区医院、乡镇医院等往往缺乏大型设备和专业人员的情况下,使用非常不便。
发明内容
基于此,有必要提供一种用于制作α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的反应液及干化学试纸,以解决传统的α-羟丁酸脱氢酶的液体生化试剂使用不便的问题。
一种用于制作α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的反应液,包括如下浓度的各组分:
在其中一个实施例中,所述缓冲盐类的溶液选用pH为8.0~9.0的Good’s缓冲液或Tris-HCl的磷酸盐缓冲液。
在其中一个实施例中,所述保护剂为糖类。
在其中一个实施例中,所述稳定剂选自牛血清白蛋白、海藻胶及羧甲基纤维素中的至少一种。
在其中一个实施例中,所述反应液还包括激活剂,所述激活剂为K+和Na+中的一种或两种,浓度为5mM~10mM。
一种α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸,包括反应显色层,所述反应显色层中含有α-羟丁酸、辅酶I、黄递酶以及在黄递酶催化下能够与NADH起显色反应的显色剂。
在其中一个实施例中,所述反应显色层包括试剂层和位于所述试剂层一侧的显色层,所述α-羟丁酸、所述辅酶I、所述黄递酶以及所述显色剂中的一种、两种或三种试剂位于所述试剂层,其余试剂位于所述显色层。
在其中一个实施例中,所述试剂层与所述显色层中的一层含有所述α-羟丁酸、所述辅酶I和所述黄递酶,另一层含有所述显色剂。
在其中一个实施例中,所述试剂层与所述显色层中的一层是将上述任一实施例所述的用于制作α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的反应液在相应层的载体上经干燥后得到的,另一层是将含有所述显色剂的溶液在相应层的载体上经干燥后得到的。
在其中一个实施例中,所述显色剂为四唑盐类。
在其中一个实施例中,所述α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸包括下支持层以及至少在所述下支持层的测试区的上方依次层叠设置的所述反应显色层、扩散层以及上支持层;在所述测试区,所述上支持层对应所述反应显色层设有加样孔且所述下支持层对应所述反应显色层设有检测孔。
在其中一个实施例中,所述α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸还包括设置在所述扩散层与所述反应显色层之间的用于过滤层。
在其中一个实施例中,所述过滤层的材质选自玻璃纤维或微孔膜,其微孔的孔径大小在0.15μm~10μm之间;
所述下支持层与所述上支持层的材质选自聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或聚酯纤维;
所述扩散层的材质选自滤纸、玻璃纤维、无纺布、网布或合成纤维;
所述反应显色层的载体的材质选自滤纸、玻璃纤维、无纺布或合成膜。
上述α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)测定用干化学试纸或通过上述用于制作α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的反应液制作的干化学试纸,在α-羟丁酸脱氢酶含量测定时,可先将适量样本加入到干化学试纸的加样孔后,样本可均匀渗透到反应显色层中反应,样本血清中的α-羟丁酸脱氢酶催化α-羟丁酸和辅酶I(NAD+)转化为乙酸乙酯和NADH,产物NADH和显色剂在黄递酶的催化下转化成有色物质(指示剂)和NAD+,有色物质的颜色变化速率与α-羟丁酸脱氢酶的活性成正比,在530-530nm波长处检测光学信号即可定量得到α-羟丁酸脱氢酶的活性浓度。具体的检测原理如下:
本发明制作的干化学试纸与小型仪器联用,在加样孔的一侧加样,在相反检测孔的另一侧测定,只需采集微量血液便可在短时间内测出α-羟丁酸脱氢酶含量,操作便捷,无需专业人员操作,且显色的强度高、均匀度好、污染小,检测过程不依赖大型生化分析仪,一般只要配备一台小型反射式分光光度计即可读数定量测定,能够满足特殊条件下的市场需求,尤其是急诊应用,较之传统的通过液体生化试剂进行检测的方法,通过本发明制作的干化学试纸可以为急诊科、基层医院、家庭和小型诊所等提供一种能够方便快速测量α-羟丁酸脱氢酶浓度的方法。
附图说明
图1为本发明一实施方式的α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的分解结构示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
如图1所示,本发明一实施方式的α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸100包括下支持层110、反应显色层120、扩散层130以及上支持层140。其中,下支持层110具有测试区,反应显色层120、扩散层130以及上支持层140至少设在下支持层110的测试区,并在该测试区上依次层叠设置。下支持层110的另外的区域可以为但不限于手持区。上支持层140对应下方的扩散层130开设有用于滴加样品的加样孔142。下支持层110对应上方的反应显色层120设有用于观察测试区颜色变化和测定光密度的检测孔112。
该α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸100整体上呈长条形,如长和宽的尺寸在40×8mm~120×12mm之间的长条形结构,其中,上支持层140与下支持层110的厚度可以在100~300μm之间。上支持层140的宽度可以与下支持层110的宽度一致。其他各层,如反应显色层120以及扩散层130等,长和宽的尺寸均不大于上支持层140的尺寸。加样孔142和检测孔112可以是但不限于圆形孔。
该α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸100主要用于不含血细胞的血清或血浆样品的测定,在其他实施方式中,对于含血细胞的全血等样品测定用的干化学试纸,优选在扩散层130与反应显色层120之间设置一过滤层,以过滤除去待测样品溶液中的杂质。过滤层可以是但不限于用于滤去血细胞的滤血层等。过滤层的材质可选自玻璃纤维或微孔膜,其微孔的孔径大小可在0.15μm~10μm之间。
下支持层110与上支持层140的材质可选自聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或聚酯纤维。
扩散层130的材质可选自滤纸、玻璃纤维、无纺布、网布或合成纤维,优选地,扩散层130的材质为亲水材质,更优选地,扩散层130经过表面活性剂进行表面预处理;扩散层130的作用是将测试的样品均一的渗透到下一层的反应显色层120中去。
反应显色层120的载体的材质可选自玻璃纤维、滤纸、无纺布或合成膜。在本实施方式中,反应显色层120中含有α-羟丁酸、辅酶I、黄递酶以及在黄递酶催化下能够与NADH起显色反应的显色剂。显色剂可以是但不限于四唑盐类,如四唑紫、NBT(四唑氮蓝)等。因而,当样本经扩散层130扩散到反应显色层120上时,样本中的,α-羟丁酸脱氢酶能够与反应显色层120中的α-羟丁酸和辅酶I起反应,生成乙酸乙酯和NADH,产物NADH和显色剂在黄递酶的催化下转化成有色物质(指示剂)和NAD+,有色物质的颜色变化速率与α-羟丁酸脱氢酶的活性成正比,在550nm波长处检测光学信号即可定量得到α-羟丁酸脱氢酶的活性浓度。
在图1所示的具体实施例中,反应显色层120包括试剂层124和位于试剂层124下方的显色层122。α-羟丁酸、辅酶I、黄递酶以及显色剂中的一种、两种或三种试剂位于试剂层124,其余试剂位于显色层122,也即试剂层124可以只含有α-羟丁酸、辅酶I、黄递酶以及显色剂中的一种,如含有显色剂,其余的α-羟丁酸、辅酶I、黄递酶这三种位于显色层122;试剂层124也可以含有任意两种,如含有α-羟丁酸和辅酶I,其余的两种位于显色层122;试剂层124也可以含有任意三种,如含有α-羟丁酸、辅酶I、黄递酶,显色剂位于显色层122;其他组合不再赘述。优选地,试剂层124与显色层122中的一层含有α-羟丁酸、辅酶I和黄递酶,另一层含有显色剂。此外,α-羟丁酸、辅酶I、黄递酶或显色剂等也可以同时分布在试剂层124和显色层122中。
随着扩散层130扩散到试剂层124的样本,会进行反应,反应物以及试剂层124中未反应的物质等可一起继续向下扩散至显色层122进行反应显色,或者样本直接与试剂层124中的物质一并扩散到显色层122进行反应并显色。因而,试剂层124与显色层122构成的反应显色层120整体上只要含有α-羟丁酸、辅酶I、黄递酶以及显色剂即可。可理解,在其他具体的实施例中,反应显色层120也可以是一层,还可以是三层或四层等更多层的结构。
优选的,显色层122中含有α-羟丁酸、辅酶I和黄递酶这些反应试剂,试剂层124中含有显色剂;并进一步优选的,反应试剂与显色剂分别独立地位于显色层122与试剂层124中,也即显色层122中不含有显色剂,而试剂层124中不含有反应试剂。
显色层122中含有能够与待测目标物反应的检测试剂,试剂层124中含有显色剂,待测目标物与检测试剂的反应产物能够与显色剂进行显色反应,这样当加入待测样品溶液时,待测样品溶液逐渐渗入试剂层124,由于显色剂一般分子量较小,流动性较高,待测样品溶液会很容易带着试剂层124中的显色剂渗透并均匀分散到显色层122中,当待测样品中含有待测目标物时,待测目标物能够与检测试剂反应,反应产物能够与显色剂充分显色反应,较之在试剂层124中加入检测试剂和显色层122中加入显色剂的方案,或者检测试剂与显色剂混合在一层的方案,更有利于反应产物与显色剂充分反应,使得反应显色更均匀,从而提高检测的精密度;而且将反应试剂和显色剂分别设置在显色层122和试剂层124,还有利于反应试剂和显色剂的保存,提高了反应试剂和显色剂在保存中的稳定性。
在一个具体的实施例中,试剂层124与显色层122中的一层是将下述用于制作α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的反应液以点样、涂布或浸润等方式在相应层的载体上经干燥后得到的,另一层是将显色剂溶液(如10-50mM的四唑盐类溶液)以点样、涂布或浸润等方式在相应层的载体上经干燥后得到的。例如可以将该反应液按照每点体积为5~10μl点样制作显色层122,将显色剂溶液按照20-30μl/cm2涂布制作试剂层124,又如可以将该反应液按照20-30μl/cm2涂布制作试剂层124,将显色剂溶液每点体积为5~10μl点样制作显色层122等。
该制作α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的试剂包括如下浓度的各原料组分:
在其中一个实施例中,缓冲盐类的溶液选用pH为8.0~9.0的Good’s缓冲液或Tris-HCl的磷酸盐缓冲液;保护剂为糖类,优选蔗糖和/或海藻糖;稳定剂选自牛血清白蛋白、海藻胶和羧甲基纤维素中的至少一种,优选为牛血清白蛋白。
此外,在另一些实施例中,该试剂中还含有激活剂,如可以是但不限于K+、Na+中的一种或两种,浓度为5mM~10mM。
该α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸100在制作时,可先制作试剂层124和显色层122;再将试剂层124置于显色层122的上方并与其他层相结合组装成α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸100,如可以将将扩散层130对应加样孔142与上支持层140粘贴在一起,并将显色层122对应检测孔112与下支持层110粘贴在一起,再将试剂层124夹在扩散层130与显色层122之间,将上支持层140与下支持层110粘贴在一起。
本实施方式的α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸100可与小型检测仪器,如分光光度计配合使用,优选使用反射式的分光光度计。用该分光光度计测定干化学试纸反应后在530-530nm nm波长下反射光密度的变化。在检测时,优选将反应温室内的温度控制在3330.3℃,计算方法采用速率法,测定在120秒内完成。
本实施方式的α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸100只需采集微量血液便可在短时间内测出α-羟丁酸脱氢酶含量,操作便捷,无需专业人员操作,且显色的强度高、均匀度好、污染小,能够满足特殊条件下的市场需求,尤其是急诊应用,较之传统的通过液体生化试剂进行检测的方法,通过本发明制作的干化学试纸可以为急诊科、基层医院、家庭和小型诊所等提供一种能够方便快速测量α-羟丁酸脱氢酶浓度的方法。
以下为具体实施例部分。
实施例1
使用配制好的显色剂溶液制作试剂层,并使用配制好的反应液制作显色层;分别干燥后收起。上支持层与下支持层采用聚氯乙烯(PVC)片,分别用打孔机打出加样孔和检测孔,孔直径为5mm,扩散层采用网布,试剂层采用玻璃纤维,显色层采用合成膜,宽度均为3mm,将扩散层和显色层分别粘贴在上支持层与下支持层上,位于加样孔处和测试孔处。然后将试剂层夹在粘贴有扩散层上支持层与粘贴有显色层的下支持层中间,加样孔和测试孔的位置对准,上支持层与下支持层对合粘贴在一起。
反应液的配方如下:
试剂层和显色层干燥时是将相应层放入35~45℃干燥箱中,30~35分钟后取出。组装后即可用于测定。
从加样孔处加样,每孔3~10μl,测定的样品为人血清基质的标准品,用稀释液倍比稀释。使用反射式分光光度计进行测定,以反应的斜率回归直线方程,考察线性范围,结果见下表1。
表1
所得直线回归方程为Y=59690X-52.91,R2=0.992,线性在60~1000U/L。
实施例2
使用配制好的显色剂溶液制作试剂层,并使用配制好的反应液制作显色层;分别干燥后收起。上支持层和下支持层采用PET塑料片,用同实施例1同样方式打出加样孔和检测孔,孔直径为6mm,孔距为8mm,扩散层采用无纺布,试剂层采用玻璃纤维,宽度均为8mm,将扩散层和显色层分别粘贴在上支持层和下支持层上,然后上支持层和下支持层夹上试剂层后,对合粘贴在一起,加样孔和测试孔位置对准。
反应液的配方如下:
试剂层和显色层干燥时是放入33℃真空干燥箱中,30分钟后取出。干燥后,用滚刀机将试纸切成8mm宽的纸条即可用于测定。
从加样孔处加样,每孔3~10μl,测定的样品为人血清基质的标准品,用稀释液倍比稀释。使用反射式分光光度计进行测定。以反应的斜率回归直线方程,考察线性范围,结果见下表2。
表2
所得直线回归方程为Y=53639X-39.60,R2=0.991,线性范围在63~1000IU/L。
实施例3
全血样品的测定。选择底板材料及加工规格同实施例1。将滤血材料玻璃纤维粘贴在扩散层和试剂层的中间。全血样品在加样孔网布处加入。干化学试纸的其他制作原料和方法同实施例1。
取定值的全血样品,每次加样量为30μl,测定反应斜率,计算直线回归方程,结果见下表3。
表3
所得直线回归方程为Y=51865X+24.04,R2=0.991,在50~900IU/L范围内呈线性。
实施例4
分别采用实施例1、2和3制作的干化学试纸对已知α-羟丁酸脱氢酶的活性浓度两个血清样品和全血样品进行检测,结果见下表4。
表4
由上表4可知,采用实施例1、2和3制作的含化学试纸对α-HBDH检测时,检测结果与已知的参考值非常接近,精度非常高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (13)
1.一种用于制作α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的反应液,其特征在于,包括如下浓度的各组分:
2.如权利要求1所述的用于制作α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的反应液,其特征在于,所述缓冲盐类的溶液选用pH为8.0~9.0的Good’s缓冲液或Tris-HCl的磷酸盐缓冲液。
3.如权利要求1所述的用于制作α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的反应液,其特征在于,所述保护剂为糖类。
4.如权利要求1所述的用于制作α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的反应液,其特征在于,所述稳定剂选自牛血清白蛋白、海藻胶及羧甲基纤维素中的至少一种。
5.如权利要求1所述的用于制作α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的反应液,其特征在于,还包括激活剂,所述激活剂为K+和Na+中的一种或两种,浓度为5mM~10mM。
6.一种α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸,其特征在于,包括反应显色层,所述反应显色层中含有α-羟丁酸、辅酶I、黄递酶以及在黄递酶催化下能够与NADH起显色反应的显色剂。
7.如权利要求6所述的α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸,其特征在于,所述反应显色层包括试剂层和位于所述试剂层一侧的显色层,所述α-羟丁酸、所述辅酶I、所述黄递酶以及所述显色剂中的一种、两种或三种试剂位于所述试剂层,其余试剂位于所述显色层。
8.如权利要求7所述的α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸,其特征在于,所述试剂层与所述显色层中的一层含有所述α-羟丁酸、所述辅酶I和所述黄递酶,另一层含有所述显色剂。
9.如权利要求8所述的α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸,其特征在于,所述试剂层与所述显色层中的一层是将如权利要求1~5中任一项所述的用于制作α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸的反应液在相应层的载体上经干燥后得到的,另一层是将含有所述显色剂的溶液在相应层的载体上经干燥后得到的。
10.如权利要求6~9中任一项所述的α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸,其特征在于,所述显色剂为四唑盐类。
11.如权利要求6~9中任一项所述的α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸,其特征在于,包括下支持层以及至少在所述下支持层的测试区的上方依次层叠设置的所述反应显色层、扩散层以及上支持层;在所述测试区,所述上支持层对应所述反应显色层设有加样孔且所述下支持层对应所述反应显色层设有检测孔。
12.如权利要求11所述的α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸,其特征在于,还包括设置在所述扩散层与所述反应显色层之间的用于的过滤层。
13.如权利要求12所述的α-羟丁酸脱氢酶测定用干化学试纸,其特征在于,所述过滤层的材质选自玻璃纤维或微孔膜,其微孔的孔径大小在0.15μm~10μm之间;
所述下支持层与所述上支持层的材质选自聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或聚酯纤维;
所述扩散层的材质选自滤纸、玻璃纤维、无纺布、网布或合成纤维;
所述反应显色层的载体的材质选自滤纸、玻璃纤维、无纺布或合成膜。
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