CN104458617A - 一种α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提供一种α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒，由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；其中试剂R1的组分包括：生物缓冲液1、金属离子络合物、α-羟丁酸脱氢酶反应底物、表面活性剂1、防腐剂1；试剂R2的组分包括：生物缓冲液2、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原态、激活剂、表面活性剂2、防腐剂2。本发明中的试剂盒采用双试剂模式，检测灵敏度高、检测限低、线性测试范围宽、精确度高、重复性好、稳定性好、抗干扰性强。可以用于半自动、全自动生化分析仪，所需检测仪器（生化分析仪）在各大医院和检验中心普遍使用。适用于临床上的推广应用，特别对于急诊能实现快速诊断。

Description

一种α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

α-羟丁酸脱氢酶(alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase,a-HBDH)是心肌酶谱中的一种酶，在哺乳动物体内普遍存在。α-羟丁酸脱氢酶广泛分布于各脏器和组织中，主要分布于心肌红细胞、白细胞及肾脏等。与血清GOT、LDH、肌酸激酶(CK)一样广泛存在于脑细胞中。α-羟丁酸脱氢酶活力与LDH活性的变化呈对应关系，主要代表了LDH1和LDH2等富含H亚基的同工酶的活力。因此常用α-羟丁酸脱氢酶来测量血清中LDH1的活性。α-羟丁酸脱氢酶活性的增高主要见于急性心肌梗塞、恶性贫血、溶血性贫血、骨骼肌损伤、急性肝炎、白血病、传染性单核细胞增多症及恶性肿瘤。α-羟丁酸脱氢酶活性的降低主要见于免疫抑制剂、抗癌剂、遗传性变异的LDH-H亚型欠缺。血清α-羟丁酸脱氢酶能间接反映心肌损伤和集体缺氧的严重程度，对诊断心肌疾病和肝病有一定意义，对指导治疗和判断预后有一定帮助。临床上需要检测的人群有腹胀、腹痛、心肌梗死、贫血、白血病、肝硬化等。

α-羟丁酸脱氢酶目前已有多种定性和定量的检测方法可用。现有检测方法包含紫外动力学法、速率法、酶学比色法、连续检测法等。其基本原理是采用α-酮丁酸为底物于340nm测定NADH吸光度变化率，根据变化率计算出酶的活性。血清α-羟丁酸脱氢酶的测定是通过它催化的反应速度测量的，这与以免疫实验将酶作为蛋白质测定比较，其优点是快速、敏感、特异和低消耗。但在实际测定工作中，酶催化浓度测定结果是相对的，它依据测定原理、单位定义和相应的测定条件等。如是否选择了合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂、指示酶、辅助酶、缓冲液、各种抑制剂及其浓度，反应混合液的最适PH、温度等。例如测定时需要酶和底物在一定温度下作用一段时间，在此期间，温度可能会使酶失活，正是由于这些原因，使得α-羟丁酸脱氢酶的测定质量控制远远落后于其他生化项目。如存在着试剂昂贵，稳定性差，测量结果准确度低，灵敏度低，抗干扰性弱，操作繁琐，耗时长等缺点。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测时间短，稳定性好、重复性好、精确度高、检测灵敏度高、线性测试范围宽、抗干扰性强的α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明的第一方面提供一种α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒，由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；其中试剂R1的组分包括：生物缓冲液1、金属离子络合物、α-羟丁酸脱氢酶反应底物、表面活性剂1、防腐剂1；试剂R2的组分包括：生物缓冲液2、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原态、激活剂、表面活性剂2、防腐剂2。

优选的，所述试剂R1中，所述生物缓冲液1选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液或柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合；更优选Tris缓冲液，其原因是Tris缓冲液碱性较强，可调节PH范围广，对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。所述试剂R2中，所述生物缓冲液2选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液或柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合。

优选的，所述R1试剂中，生物缓冲液1的浓度为20～200mmol/L，PH7.0-7.5；R2试剂中，生物缓冲液2的浓度为20～200mmol/L，PH7.0-7.5。

优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本发明对所述试剂R1中的生物缓冲液1进行了改进，所述试剂R1中的生物缓冲液1包括下列组分：水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3.5－7.5g/L，生物缓冲液1的pH值为7.2－7.6。

优选的，各组分在生物缓冲液1中的浓度为：

所述生物缓冲液1的溶剂为水。

所述生物缓冲液1可以采用本领域内公知的各种pH调节剂来进行pH调节。

优选的，所述R1试剂中，金属离子络合物选自乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸中的一种或多种的组合，浓度为1～5mmol/L。更优选乙二胺四乙酸二钠，其原因是乙二胺四乙酸二钠具有广泛的配位性能，几乎能与所有的金属离子形成稳定的螯合物，。

优选的，所述R1试剂中，α-羟丁酸脱氢酶反应底物为α-酮丁酸，浓度为2～10mmol/L。

优选的，所述R1试剂中，所述表面活性剂1为椰子油脂肪酸二乙醇酰胺，浓度为5～55mmol/L。椰子油脂肪酸二乙醇酰胺属于非离子表面活性剂，易溶于水，具有发泡、稳泡、渗透去污、抗硬水等功能，并且在一定浓度下能完全溶解于不同种类的表面活性剂中，增稠效果明显。所述R2试剂中，所述表面活性剂2为椰子油脂肪酸二乙醇酰胺，浓度为5～55mmol/L。

优选的，所述R1试剂中，所述防腐剂1选自叠氮钠、硫柳汞、ProClin300中的一种，更优选叠氮钠，其原因是叠氮钠具有优良的防腐杀菌性能。所述R2试剂中，所述防腐剂2选自叠氮钠、硫柳汞、ProClin300中的一种。

优选的，所述R1试剂中，防腐剂1的浓度为1～5mmol/L；R2试剂中，防腐剂2的浓度为1～5mmol/L。

优选的，所述R2试剂中，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原态的浓度为0.5～2mmol/L。

优选的，所述R2试剂中，所述激活剂为磷脂酰胆碱，浓度为2～20mmol/L。

优选的，所述检测试剂盒的具体组成为：

试剂R1:

试剂R2:

本发明的第二方面提供前述试剂盒的制备方法和使用方法，具体包括如下步骤：

(1)按照比例分别配置试剂R1、试剂R2，按照需要的α-羟丁酸脱氢酶参考校准品浓度将相应的α-羟丁酸脱氢酶标准品分别加入校准品中，制备得到含有不同浓度α-羟丁酸脱氢酶标准品的一组校准品，并绘制标准曲线；

(2)将待测样本与试剂R1和R2按一定比例混合，使其充分反应；

(3)用全自动生化分析仪测定单位时间内吸光度变化率△A/min；

(4)根据吸光度变化率计算出样本中α-羟丁酸脱氢酶的活性。

本发明第三方面公开了前述试剂盒在检测α-羟丁酸脱氢酶的含量中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明中的试剂盒采用双试剂模式，检测灵敏度高、检测限低、线性测试范围宽、精确度高、重复性好、稳定性好、抗干扰性强。可以用于半自动、全自动生化分析仪，所需检测仪器(生化分析仪)在各大医院和检验中心普遍使用。适用于临床上的推广应用，特别对于急诊能实现快速诊断。

2.本发明中所使用的激活剂为磷脂酰胆碱，能有效提高α-羟丁酸脱氢酶的活性，增强反应灵敏度，能有效减少反应时间，加快临床诊断速度。

附图说明

图1是实施例1制备的α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒的线性范围相关性曲线。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1：

本发明的试剂盒举例是双试剂，其中：

试剂R1:

试剂R2:

实施例2：试剂盒使用方法。

1.试剂准备，试剂为液体双试剂，开瓶即用，其中：

试剂R1:

试剂R2:

2.全自动生化仪参数设置：

(a)检测波长：主波长为340nm，副波长为405nm；

(b)检测温度：37℃；

(c)反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后2min后测定3min内平均吸光度变化率△A/min；

(d)反应方向：负方向。

3.检测步骤

(a)取240ul试剂R1与6ul血清样本(避免溶血)混匀；

(b)将混匀后的溶液在37℃孵育时间5min；

(c)再加入60ul试剂R2，反应2min后检测3min内平均吸光度变化率△A/min。

4.通过平均吸光度变化率△A/min计算出α-羟丁酸脱氢酶的活性。

下述测试为对实施例1试剂盒的性能测试：

将实施例1制备的α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒进行性能测试，主要测试其分析灵敏度、最低检出限、线性范围、准确度、重复性、稳定性及抗干扰性等。

1)分析灵敏度：取浓度在4～1200U/L之间的定值α-羟丁酸脱氢酶样本测定其吸光度变化值，重复测定2次取平均值。结果显示其分析灵敏度为0.0448mA·L/U。

2)最低检测限：采用5％BSA生理盐水溶液作为空白样本，空白样本应不含被测物。在生化分析仪上连续重复检测20次，记录检测结果。结果显示其最低检测限为2.9721U/L。

3)线性范围：用低值血清(L)与高值标准品(H)按L、0.9L+0.1H、0.8L+0.2H、0.7L+0.3H、0.6L+0.4H、0.5L+0.5H、0.4L+0.6H、0.3L+0.7H、0.2L+0.8H、0.1L+0.9H、H比例稀释，每个稀释度重复测定4次，计算偏差及相关系数r。数据经可用性检查和精密度检验后，进行多项式回归分析，结果显示在5～1200U/L范围内，本试剂结果为线性，其直线回归方程如图1所示，线性回归方程为y＝1.0052x+6.0350，相关系数r＝0.999，线性范围内相关性较好。

4)准确性：选择合适浓度的常规检测样本，向常规样本中加入不同量的定值标准品制作成回收样本，定值样本用去离子水作为溶剂；在常规样本中加入同样量的去离子水制作成基础样本，加入的定值标准品的量不超过总体积的1/10，每个重复3次检测取其均值为回收浓度。结果显示平均回收率为99.13％，准确度较高。

5)重复性：每天做2批试验，每批取同一浓度的血清样本做2次测定，记录试验结果，连续测定20天，结果显示CV批内为0.87％，CV批间为1.27％，CV天间为1.79％，总精密度为2.09％，重复性较好。

6)稳定性：取α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验，2-8℃放置分别按时间2，4，6，8，9，10，11，12，13，14个月进行检测；开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、32天进行测定。结果显示α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为12个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为30天。

7)抗干扰性：将不同浓度的干扰物加入到血清标本中，对照组加入蒸馏水,以加入干扰物质的血清三次检测平均值，作为实测值，以加入蒸馏水的血清的对照组三次检测平均值为基准值。实测值减去基准值然后除以基准值得偏差。结果显示样本中胆红素≤300μmol/L、血红蛋白≤0.5g/L、乳糜≤0.30％时对α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒检测结果的干扰小于10％。

实施例3

对比试剂盒的制备及使用：

试剂R1中的生物缓冲液采用Tris缓冲液50.0mmol/L，PH7.0-7.5，其他试剂及实验方法均同实施例1和2。

试剂R2:

将实施例3制备的α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒进行性能测试，方法同实施例2。

1)分析灵敏度：取浓度在4～1200U/L之间的定值α-羟丁酸脱氢酶样本测定其吸光度变化值，重复测定2次取平均值。结果显示其分析灵敏度为0.4581mA·L/U。

2)最低检测限：采用5％BSA生理盐水溶液作为空白样本，空白样本应不含被测物。在生化分析仪上连续重复检测20次，记录检测结果。结果显示其最低检测限为12.972U/L。

3)线性范围：用低值血清(L)与高值标准品(H)按L、0.9L+0.1H、0.8L+0.2H、0.7L+0.3H、0.6L+0.4H、0.5L+0.5H、0.4L+0.6H、0.3L+0.7H、0.2L+0.8H、0.1L+0.9H、H比例稀释，每个稀释度重复测定4次，计算偏差及相关系数r。数据经可用性检查和精密度检验后，进行多项式回归分析，结果显示在5～1200U/L范围内，本试剂结果为线性。

4)准确性：选择合适浓度的常规检测样本，向常规样本中加入不同量的定值标准品制作成回收样本，定值样本用去离子水作为溶剂；在常规样本中加入同样量的去离子水制作成基础样本，加入的定值标准品的量不超过总体积的1/10，每个重复3次检测取其均值为回收浓度。结果显示平均回收率为98.15％，准确度较高。

5)重复性：每天做2批试验，每批取同一浓度的血清样本做2次测定，记录试验结果，连续测定20天，结果显示CV批内为0.97％，CV批间为1.37％，CV天间为1.89％，总精密度为4.09％，重复性较好。

6)稳定性：取α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验，2-8℃放置分别按时间2，4，6，8，9，10，11，12，13，14个月进行检测；开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、32天进行测定。结果显示α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为10个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为25天。

7)抗干扰性：将不同浓度的干扰物加入到血清标本中，对照组加入蒸馏水,以加入干扰物质的血清三次检测平均值，作为实测值，以加入蒸馏水的血清的对照组三次检测平均值为基准值。实测值减去基准值然后除以基准值得偏差。结果显示样本中胆红素≤300μmol/L、血红蛋白≤0.5g/L、乳糜≤0.30％时对α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒检测结果的干扰小于18％。

综上所述，本发明所提供的检测试剂盒具有良好的抗干扰性和特异性，且具有很好的灵敏性，阳性显色强，阴性本底更低，有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种α-羟丁酸脱氢酶检测试剂盒，由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；其中试剂R1的组分包括：生物缓冲液1、金属离子络合物、α-羟丁酸脱氢酶反应底物、表面活性剂1、防腐剂1；试剂R2的组分包括：生物缓冲液2、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原态、激活剂、表面活性剂2、防腐剂2。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中，所述生物缓冲液1选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液或柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合；所述试剂R2中，所述生物缓冲液2选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液或柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，生物缓冲液1的浓度为20～200mmol/L，PH7.0-7.5；R2试剂中，生物缓冲液2的浓度为20～200mmol/L，PH7.0-7.5。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，金属离子络合物选自乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸中的一种或多种的组合，浓度为1～5mmol/L。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，α-羟丁酸脱氢酶反应底物为α-酮丁酸，浓度为2～10mmol/L。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，所述表面活性剂1为椰子油脂肪酸二乙醇酰胺，浓度为5～55mmol/L。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述防腐剂1选自叠氮钠、硫柳汞、ProClin300中的一种；所述R2试剂中，所述防腐剂2选自叠氮钠、硫柳汞、ProClin300中的一种。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原态的浓度为0.5～2mmol/L；所述R2试剂中，所述激活剂为磷脂酰胆碱，浓度为2～20mmol/L。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的生物缓冲液1包括下列组分：水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3.5－7.5g/L，生物缓冲液1的pH值为7.2－7.6。

10.根据权利要求1～9任一权利要求所述的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)按照比例分别配置试剂R1、试剂R2，按照需要的α-羟丁酸脱氢酶参考校准品浓度将相应的α-羟丁酸脱氢酶标准品分别加入校准品中，制备得到含有不同浓度α-羟丁酸脱氢酶标准品的一组校准品，并绘制标准曲线；

(2)将待测样本与试剂R1和R2按一定比例混合，使其充分反应；

(3)用全自动生化分析仪测定单位时间内吸光度变化率△A/min；

(4)根据吸光度变化率计算出样本中α-羟丁酸脱氢酶的活性。