CN104988207B - 一种稳定、抗干扰能力强的α-羟丁酸脱氢酶试剂及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及α‑羟丁酸脱氢酶检测技术领域，特别涉及一种α‑羟丁酸脱氢酶检测试剂，试剂R1中含有缓冲液，乙二胺四乙酸二钠(EDTA‑2Na),α‑酮丁酸,十二烷基二甲基甜菜碱，防腐剂；试剂R2中含有缓冲液，NADH，BSA，蔗糖，海藻糖，甘露醇，十二烷基二甲基甜菜碱，防腐剂。采用PIPES（哌嗪‑1,4‑二乙磺酸）缓冲液，添加稳定剂BSA,蔗糖，海藻糖，甘露醇，大大增强了试剂的稳定性；采用两性表面活性剂十二烷基二甲基甜菜碱，不仅显著改善测定的性能，而且增强了试剂的稳定性和抗干扰能力。

Description

一种稳定、抗干扰能力强的α-羟丁酸脱氢酶试剂及检测方法

技术领域

本发明涉及α-羟丁酸脱氢酶检测技术领域，特别涉及一种α-羟丁酸脱氢酶检测试剂，还涉及使用此检测试剂的检测方法。

背景技术

α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)，心肌酶谱中酶的一种，实质上是LDH1型同功酶，主要来源于心肌、肾脏和红细胞，在心肌中含量最丰富。α-羟丁酸脱氢酶活性的测定常用于急性心肌梗死（AMI）辅助诊断，为AMI的临床诊断、病情观察、疗效分析和愈后估计提供了有力的定量指标。其测定对AMI的诊断比LDH更为专一，更有价值。此外，α- 羟丁酸脱氢酶增高主要见于心肌梗塞、活动性风湿性心肌炎、急性病毒性心肌炎、溶血性贫血等。

α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)常用的测定方法主要有比色法和连续监测法。比色法是以前较为常用的检测方法，该法利用α-HBDH作用于过量的α-酮丁酸生成α-羟丁酸，则剩余者与2，4-二硝基苯肼形成α-酮丁酸苯腙，在碱性溶液中呈棕色，其颜色深浅与酶活性成反比。该法操作简单，但试剂存在污染性较大，易受其他物质干扰等缺点。连续监测法是目前较为常用的方法，利用α-HBDH催化α-酮丁酸还原成α-羟丁酸，同时使NADH氧化成NAD，在340nm监测NADH的氧化速率与该酶活性成正比。该法简便快速、适用于全自动生化分析，但该法试剂底物NADH稳定性不佳，需进一步改进稳定性。

鉴于此，本发明在连续监测法的基础上，优化反应体系，采用PIPES缓冲液，添加多种抗干扰物质和稳定剂，显著改善了试剂的抗干扰能力和稳定性。是一种更加稳定、抗干扰能力强的α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)试剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测 α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)的试剂及使用该试剂检测α-羟丁酸脱氢酶活性的方法。该试剂盒采用连续监测法，可以有效检测α-羟丁酸脱氢酶的活性，抗干扰能力强，稳定性好等优点。

本发明的基本原理：

α-HBDH催化α-酮丁酸还原成α-羟丁酸，同时使NADH氧化成NAD，在340nm监测NADH的氧化速率与该酶活性成正比。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种α-羟丁酸脱氢酶检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：

试剂R1中含有

缓冲液_{·····················································}50mmol/L，

乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)_{·································}3mmol/L，

α-酮丁酸_{···················································}5mmol/L，

十二烷基二甲基甜菜碱_{·······································}2g/L，

防腐剂_{·····················································}0.5g/L

2）试剂R2的组分为：

缓冲液_{·····················································}50mmol/L，

NADH_{·······················································}0.3mmol/L，

BSA_{························································}1g/L，

蔗糖_{·······················································}10g/L，

海藻糖_{·····················································}3g/L，

甘露醇_{·····················································}10g/L，

十二烷基二甲基甜菜碱_{·······································}2g/L，

防腐剂_{·····················································}0.5g/L。

所述的α-羟丁酸脱氢酶检测试剂，试剂R1中缓冲液为25℃，pH为7.4的哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液。

所述的α-羟丁酸脱氢酶检测试剂，试剂R2中缓冲液为25℃，pH为7.4的哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液。

所述的α-羟丁酸脱氢酶检测试剂，所述防腐剂为NaN₃。

所述的α-羟丁酸脱氢酶检测试剂来检测α-羟丁酸脱氢酶活性的检测方法，使用全自动生化分析仪利用速率法进行测定，检测主波长为340nm。

所述的检测方法，R1试剂和R2试剂的比例为4:1。

本发明的有益效果：

1）采用新的缓冲体系和稳定剂，可以防止底物NADH氧化，显著改善了试剂的稳定性；

2）采用两性表面活性剂十二烷基二甲基甜菜碱，不仅显著改善测定的性能，而且增强了试剂的稳定性和抗干扰能力；

3）试剂的准确度和稳定性良好，价格便宜，使用方便，完全可以满足临床需要。

附图说明

图1为两种试剂的相关性曲线图。

图2为两种试剂有效期稳定性曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

α-羟丁酸脱氢酶的检测试剂，包试剂R1和试剂R2：

1）其R1的组成为：

PIPES（哌嗪-1,4-二乙磺酸）缓冲液(pH=7.4，25℃) _{················}50mmol/L

乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)_{··································}3mmol/L，

α-酮丁酸_{·····················································}5mmol/L，

十二烷基二甲基甜菜碱_{·········································}2g/L，

防腐剂NaN_{3····· ··············································}0.5g/L

2）试剂R2的组分为：

PIPES（哌嗪-1,4-二乙磺酸）缓冲液(pH=7.4，25℃) _{···············}100mmol/L

NADH_{·······················································}0.3mmol/L，

BSA_{························································}1g/L，

蔗糖_{············ ··········································}10g/L，

海藻糖_{·····················································}3g/L，

甘露醇_{·····················································}10g/L，

十二烷基二甲基甜菜碱_{·······································}2g/L，

防腐剂NaN_{3·················································}0.5g/L。

3）本实施例试剂的使用方法：

本实施例描述的α-羟丁酸脱氢酶检测试剂，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用速率法进行测定。将R1和R2按照4:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如表1：

表1实施例1试剂检测方法

计算：α-羟丁酸脱氢酶活性（U/L）＝（∆A测定÷∆A标准）×C标准。

实施例2

干扰性试验

取新鲜混合血清，分成2等份，然后将每等份再分成4等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表2的要求。然后分别用实施例1所得试剂，与市场常见并认可的α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)试剂同时对比测定血清中α-HBDH的活性，对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2。相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100%。

由表2可以看出，实施例1试剂在抗坏血酸≤50mg/dL、胆红素≤1026μmol/L、甘油三酯≤2000mg/dL对测试结果没有明显干扰。而对照组试剂在上述浓度干扰物质存在时，受到明显干扰，这说明通过优化反应缓冲体系、添加两性表面活性剂后，实施例1试剂的抗干扰性能显著提高，远远优于对比试剂。

表2实施例试剂抗干扰性能比较

。

实施例3

相关性实验

利用实施例1配方配制试剂，与市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的α-羟丁酸脱氢酶试剂盒进行对照检测，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如表3所示。并获得了两种试剂的相关性曲线（如图1所示），通过检测结果显示，两个试剂盒的相关系数为0.9994，说明了两者有极大的相关性。

表3实施例1试剂与市场常见并得到认可的α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒对比检测结果

。

实施例4

试剂的稳定性对比试验

对实施例1中的试剂，均匀分装13组，每组的试剂量为R1为20mL，R2为5mL；并且取13组市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的 α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)试剂盒作对照。放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天取出一组试剂检测α-HBDH质控品（靶值为260U/L），检测结果如图2所示，实施例1试剂在2-8℃储存条件下比市场常见的 α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)测定试剂盒更加稳定。

通过验证，本试剂与同类检测试剂对比相关性好，临床检测样本结果一致，能够达到市场对产品的应用要求，并且抗干扰性能好，是一种更加稳定、良好的α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)检测试剂。

Claims (2)

1.一种α-羟丁酸脱氢酶检测试剂，其特征在于包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：

试剂R1中含有

哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液，25℃，pH为

7.4··························50mmol/L，

乙二胺四乙酸二钠·········· ·········3mmol/L，

α-酮丁酸········· ··············5mmol/L，

十二烷基二甲基甜菜碱·· ···············2g/L，

NaN₃··············· ··········0.5g/L；

2)试剂R2的组分为：

哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液，25℃，pH为7.4·········50mmol/L,

NADH·························0.3mmol/L，

BSA············ ·············1g/L，

蔗糖·························10g/L，

海藻糖························3g/L，

甘露醇························10g/L，

十二烷基二甲基甜菜碱··· ··········· ··2g/L

NaN₃·········· ···············0.5g/L；

R1试剂和R2试剂的比例为4:1。

2.根据权利要求1所述的α-羟丁酸脱氢酶检测试剂来检测α-羟丁酸脱氢酶的检测方法，其特征在于使用全自动生化分析仪利用速率法进行测定，检测主波长为340nm；R1试剂和R2试剂的比例为4:1。