CN104198420A - 一种稳定的总胆汁酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种稳定的总胆汁酸检测试剂盒;所述试剂盒包括试剂R1及试剂R2,所述试剂R1包含的各组分为:缓冲液、β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、表面活性剂、稳定剂、防腐剂;所述试剂R2包含的各组分为:缓冲液、还原型辅酶I(NADH)、3α-羟基类固醇、表面活性剂、抗氧化酶、稳定剂、防腐剂。本发明在试剂中加入抗氧化酶,使NADH能长时间保存,去除了反应过程中很多干扰成分所带来的影响,使得NADH更高效的利用,提高了循环反应的速度,使得检测的精准度提高,灵敏度更高,线性范围更广,同时可以减少主要反应物料的用量,减少了试剂的成本。
Description
技术领域
本发明涉及医学免疫体外诊断领域,具体地,涉及一种稳定的总胆汁酸检测试剂盒。
背景技术
正常人肝脏合成的胆汁酸有胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)和代谢中产生的脱氧胆酸(DCA)还有少量石胆酸(LCA)和微量熊脱氧胆酸(UDCA),合称总胆汁酸(TBA)。
人体血清总胆汁酸(TBA)是由肝脏合成并分解代谢,从而维持人体胆汁酸的相对稳定,它的调控是肝脏的一个主要功能。当肝细胞发生病变或患胆管疾病时可引起胆汁的代谢障碍,使进入血中的胆汁酸含量显著升高,血清TBA升高与肝细胞损伤程度成正比。
胆汁酸是胆固醇在肝脏分解代谢的产物,胆汁是由肝脏分泌到胆汁中,并随胆汁排入肠腔,作用于脂肪的消化吸收。胆汁酸在肠腔经细菌作用后,95%以上的胆汁酸被肠壁吸收经门静脉血重返肝脏利用,称为胆汁酸肠-----肝循环。故正常人血中胆汁酸浓度很低。胆汁酸的生成和代谢与肝脏有十分密切的关系,一旦当肝细胞发生病变,血清TBA很容易升高,因而血清TBA水平是反映肝实质损伤的一项重要指标。
各类肝胆疾病的TBA升高:急性肝炎与肝癌均为100%,肝硬化为87.5%,慢性肝炎、胆道疾病也达65%以上。说明了肝胆疾病中TBA测定比传统肝功能指标任何一项都敏感。
急性肝炎与慢性肝炎的TBA有差异:急性肝炎时患者血清TBA与丙氨酸转氨基酶(ALT)一样,呈显著增高,平均增高幅度是正常的31倍,说明TBA对急性肝炎早期诊断价值与ALT(阳性率100%)测定相同,经积极治疗后随肝细胞损害的控制很快转为正常,而TBA则随肝功能的恢复逐渐转为正常。慢性肝炎时,TBA阳性率为65.7%,平均升高幅度为正常的10倍。
肝癌、肝硬化时,由于肝脏对TBA代谢功能下降,故血清TBA在不同阶段都增高。当肝癌时,TBA阳性率为100%,而肝硬化TBA阳性率为88%,亦高于其他指标。当转氨酶、胆红素及碱性磷酸酶等其他指标转为正常情况下,血清中TBA水平仍很高,这可能由于肝细胞功能失调,肝实质细胞减少等原因有关。
胆汁酸不但参与脂质的消化吸收,同时可维持胆汁中胆固醇的可溶性状态,当胆汁酸代谢导致胆固醇性胆石的形成,胆石形成阻塞加重胆汁酸的代谢异常,其阳性率明显高于其他肝功能指标。血清中TBA水平显著增高,随炎症的阻塞阶段不同而变化,但随着炎症消失或阻塞引流解除后,TBA水平迅速下降,其他指标亦随之正常。由此可见,TBA测定是一个良好的肝功能指标,能反映肝实质损伤的一项重要指征。
诊断方法:胆汁酸作为从胆固醇转化形成的类固醇,其分子上3α-羟基对3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)的酶催化作用比较敏感,胆汁酸C3上α位的羟基在3α-HSD的作用下脱氢形成羰基,此酶促反应的辅酶是氧化型辅酶I(NAD+),反应后NAD+作为受氢体转化成还原型辅酶I(NADH)。根据这一酶法反应的原理发展出几种可以适合临床实验室进行胆汁酸分析的方法。1974年挪威科明公司采用纯制的3α-羟基类固醇成功的生产出第一代酶法胆汁酸试剂,使胆汁酸的测定真正进入临床领域,到现今,胆汁酸的检测已经发展到了第5代循环酶法。此法的反应体系中引入辅酶I的一种硫代衍生物,其反应原理如下:胆汁酸被3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)氧化,生成3-酮类固醇,脱下的氢被Thio-NAD接受,使Thio-NAD转化为Thio-NADH;同时在反应体系中还存在NADH时,3α-HSD又催化逆向反应,使正反应生成的3-酮类固醇又氧化成为胆汁酸,完成一个循环。经如此反复循环的酶反应,Thio-NADH的生成量不断增大,在一定时间内,酶循环产生的β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(Thio-NADH)量与样品中胆汁酸浓度成正比。Thio-NADH在395nm~415nm波长处有光吸收峰,可在自动生化分析仪器内连续监测410nm的吸光度变化,求得胆汁酸的浓度。
但是,上述测定方法还存在着问题,由于NADH在溶液中很难长时间的保存,使得试剂稳定性差,保存时间短。而NADH又是循环反应中主要的物质,NADH含量的变化对试剂检测性能的影响非常大。
发明内容
针对现有技术中的缺陷,本发明的目的是提供一种稳定的总胆汁酸检测试剂盒。本发明对胆汁酸检测的第5代循环酶法加以改进,通过加入抗氧化酶,使NADH能长时间保存,提高试剂稳定性。同时加入抗氧化酶后,去除了反应过程中很多干扰成分所带来的影响,使得NADH更高效的利用,提高循环反应的速度,使得检测灵敏度更高,线性范围更广。
本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明涉及一种稳定的总胆汁酸检测试剂盒,所述试剂盒包括试剂R1及试剂R2,
所述试剂R1包括的各组分及浓度为:
所述试剂R2包括的各组分及浓度为:
优选地,所述R1中的缓冲液的pH为3.0~5.0。
优选地,所述试剂R1中的缓冲液为甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、磷酸缓冲液、GOODS缓冲液中的一种或几种。
优选地,所述试剂R1中的表面活性剂为吐温20、吐温80、Brij35、曲拉通-100中的一种或几种。
优选地,所述试剂R1中的稳定剂为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、聚乙二醇、甘露醇、螯合剂EDTA类中的一种。
优选地,所述试剂R1中的防腐剂为叠氮钠或proclin300防腐剂。
优选地,所述试剂R2中的缓冲液的pH8.0~10.0。
优选地,所述试剂R2中的缓冲液为GOODS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、AMPSO缓冲液中的一种或几种。
优选地,所述试剂R2中的稳定剂为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、聚乙二醇、甘露醇、螯合剂EDTA类中的一种。
优选地,所述试剂R2中的防腐剂为叠氮钠或proclin300防腐剂。
优选的,所述试剂R2中抗氧化酶为超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽中的一种或几种。
与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:
1、本发明不需要复杂的预处理及特殊仪器,试剂具有足够的稳定性及易于操作等优点;
2、本发明在试剂中加入抗氧化酶,使NADH能长时间保存,提高试剂稳定性。同时加入抗氧化酶去除了反应过程中很多干扰成分所带来的影响,使得NADH更高效的利用,提高了循环反应的速度,使得检测的精准度提高,灵敏度更高,线性范围更广,同时可以减少主要反应物料的用量,减少了试剂的成本。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为根据朗道标准品,定标TBA试剂的定标曲线图,其中X轴表示TBA的含量,Y轴表示吸光度;
图2为分别采用本发明试剂和贝克曼公司的TBA试剂,采用日立全自动生化分析仪对50份人血清(包含正常和异常标本)按各自参数同时进行测定,对测定值进行相关分析图;其中X轴表示的是本发明试剂测定的病人血清结果,Y轴表示的是贝克曼公司试剂测定的病人血清结果,相关系数R2=0.9984,回归方程为y=1.038x+0.1542。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1~3
本实施例1~3涉及一种稳定的总胆汁酸检测试剂盒,所述试剂盒包括试剂R1及试剂R2,所述试剂R1、R2的各组分及浓度见表1所示:
表1
本实施例1~3描述的TBA检测试剂盒,适用于各种类型的全自动生化仪,以日立7170全自动生化仪为例,其操作如表2。分析方法:两点终点法,即试剂R1;R2的用量分别为270ul和90ul,样本量4ul;270ul试剂R1加入4ul样本于37℃5min后加入90ulR2,延迟60秒开始读点,读数时间约180秒;检测波长分别主波长405nm、副波长600nm。
采用本试剂及上述测定方法,采用日立7170生化分析仪测得的TBA标准品(朗道)的曲线(如图1所示),其中X轴表示TBA含量(μmol/L);Y轴表示吸光度。
表2
检测试剂的相关性试验
使用本法发明试剂(具体配方同实施例1)和对照试剂贝克曼公司的TBA试剂,采用自动7170全自动生化分析仪对50份人血清(包括正常和异常标本)按各自参数同时进行测定,对测定值进行相关性分析。按照与上述“TBA测定方法”中的参数进行测定测定结果见图2(图中国外对照试剂即为贝克曼公司的TBA试剂),X,Y轴均为测定值(TBA的含量μmol/L),
由图2的结果看出,两种试剂的相关系为R2=0.9984,回归方程为y=1.038x+0.1542。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好,具有很好的特异性和准确性。
此外,以上实验是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的,但本发明的试剂不限于上述仪器,还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。
稳定性试验
本实验目的是检测试剂中NADH含量随时间的变化。
机器:紫外分光光度计。
操作步骤:在340nm处测定试剂R2吸光度,吸光度值与NADH含量成正比
结果解析:根据检测数据,计算NADH含量变化。
表3结果显示,其中表3为本发明试剂(具体配方同实施例1),本发明试剂贮存条件下了放置12个月后NADH含量降低了15%,目前市售产品稳定性都不好,普遍试剂贮存条件下放置12个月后NADH含量降低50%,本实验结果表明本发明试剂稳定性明显好于目前市售产品。
表3
线性范围测定实验
本实验目的是检测试剂能达到的检测范围。
采用实验例1试剂、对照试剂贝克曼公司的TBA试剂、标准品、空白溶液(一般是生理食盐水和精制水)、血清样本。
机器:日立7170自动生化分析仪。
操作步骤:
使用生理食盐水或是去离子水稀释血清样本,然后50%稀释成5个点,和零点一起每一个样本测试5次,计算平均值,求得SD数值。
使用血清样本和空白溶液配制梯度浓度的样本,令高值血清样本浓度为1,再配制浓度为0.2、0.4、0.6、0.8的梯度浓度,加上最低检测限样本,共6个样本同时检测,每个样本测试3次,计算r值和相对偏差。
结果解析:
根据检测数据,计算SD数值和CV数值,分别计算1SD,2SD,从最小的开始,其平均值-2SD的数值在零点平均值+2SD以上的就是试剂的最小检出感度。
根据计算结果和试剂线性要求(线性回归方程r>0.99),r>0.99,线性范围可达到此高值。
表4显示,本发明试剂测定稀释1/8、1/4、1/2血清时,测定平均值-2SD的数值均大于零点平均值+2SD,表明本发明试剂最低检测限至少可以达到1μmol/L。
表5显示,本发明试剂在1-240μmol/L的范围内呈线性分布。结合上述2项结果,本发明试剂的线性范围为1-240μmol/L,线性范围广。
实施例2、3试剂的线性检测同上,测得线性范围均为1-240μmol/L。
表4
表5
对比例1、2
对比例1、2涉及一种总胆汁酸检测试剂盒,所述试剂盒包括试剂R1及试剂R2,所述试剂R1、R2的各组分及浓度同实施例1,所不同之处在于:对比例1中试剂R2中未加入抗氧化酶。对比例2中加入的抗氧化酶为硫氧还蛋白过氧化物酶。
对比例1、2试剂的稳定性试验同实施例1,其结果如表6所示;由表6可知,本发明的试剂盒体系中加入的抗氧化酶,能够使NADH能长时间保存,进而提高试剂稳定性。
表6
对比例1、2试剂的线性范围测定实验同实施例1,测得对比例1的线性范围为50-150μmol/L;对比例2的线性范围为10~180μmol/L。可见本发明的试剂盒体系线性范围更广。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种稳定的总胆汁酸检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括试剂R1及试剂R2,
所述试剂R1包括的各组分及浓度为:
所述试剂R2包括的各组分及浓度为:
2.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒,其特征在于,所述R1中的缓冲液的pH为3.0~5.0。
3.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1中的缓冲液为甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、磷酸缓冲液、GOODS缓冲液中的一种或几种。
4.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1中的表面活性剂为吐温20、吐温80、Brij35、曲拉通-100中的一种或几种。
5.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1中的稳定剂为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、聚乙二醇、甘露醇或螯合剂EDTA。
6.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1中的防腐剂为叠氮钠或proclin300。
7.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R2中的缓冲液的pH为8.0~10.0。
8.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R2中的缓冲液为GOODS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、AMPSO缓冲液中的一种或几种。
9.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R2中的稳定剂为牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、聚乙二醇、甘露醇或螯合剂EDTA;所述防腐剂为叠氮钠或proclin300防腐剂。
10.如权利要求1所述的稳定的总胆汁酸检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R2中的抗氧化酶为超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽中的一种或几种。
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