CN110261337A - 一种总胆汁酸检测试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种总胆汁酸检测试剂，包括R1反应液和R2反应液，其中，所述R1反应液包括第一缓冲液、第一稳定剂、第一表面活性剂、第一防腐剂和Thio‑NAD，所述R2反应液包括第二缓冲液、第二稳定剂、第二表面活性剂、第二防腐剂、3α‑类固醇脱氢酶和NADH，所述第一稳定剂包括1，2‑二硫代苏糖醇和EDTA。本发明通过在R1反应液中添加包括1，2‑二硫代苏糖醇和EDTA在内的复合稳定剂，大大增强总胆汁酸检测试剂的稳定性。

Description

一种总胆汁酸检测试剂
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，更具体地说，特别涉及一种总胆汁酸检测试剂。
背景技术
总胆汁酸是在肝脏内合成，被肝细胞分泌进入胆汁，然后随胆汁进入肠道内，在肠道内的细菌作用下被水解成游离型的胆汁酸，其中，大部分的胆汁酸被肠道重新吸收后回到肝脏，如此循环往复，从而维持人体胆汁酸含量的相对稳定，正常人血清中胆汁酸的含量非常低，且相对稳定，当肝细胞发生病变的时候，血清中总胆汁酸的含量会明显升高，因此，血清中总胆汁酸含量通常可以同时反映肝脏细胞分泌、合成、损伤三个方面的状态。目前，对于总胆汁酸的检测方法主要有酶比色法和循环酶法，临床上常用循环酶法对总胆汁酸的浓度进行检测。
循环酶法检测血清中的胆汁酸的原理主要如下：
血清中的胆汁酸被3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)及β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD)特异性地氧化，生成3-酮类固醇，同时β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD)被还原成β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(Thio-NADH)，新生成的3-酮类固醇在3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)及β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(Thio-NADH)存在下，还原成胆汁酸，同时β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(Thio-NADH)氧化为β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(NAD)。通过上述原理，血清中微量的胆汁酸在多次酶循环的过程中被放大，同时使生成的β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD)扩增。通过检测β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(Thio-NADH)吸光度的变化率，可求得样本中胆汁酸的含量。
在检测总胆汁酸的过程中，由于NADH在溶液中很难长时间的保存，且NADH作为循环酶法中主要的物质，使得总胆汁酸检测试剂盒的稳定性都比较差，尤其是随着试剂放置时间的延长，试剂的稳定性下降造成试剂的检测灵敏度降低，在使用上具有一定的局限性，因此研究开发一种稳定性好的总胆汁酸检测试剂盒显得尤为重要。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种稳定性好的总胆汁酸检测试剂。
技术方案如下：
一种总胆汁酸检测试剂，包括R1反应液和R2反应液，其中，
所述R1反应液包括第一缓冲液、第一稳定剂、第一表面活性剂、第一防腐剂和Thio-NAD；
所述R2反应液包括第二缓冲液、第二稳定剂、第二表面活性剂、第二防腐剂、3α-类固醇脱氢酶和NADH；
所述第一稳定剂包括1，2-二硫代苏糖醇和EDTA。
上述的总胆汁酸检测试剂，优选的，所述第一稳定剂还包括甘氨酸、甘露醇、蔗糖和海藻糖中的至少一种。
上述的总胆汁酸检测试剂，优选的，所述1,2-二硫代苏糖醇的浓度范围为6.0g/L～10.0g/L。
上述的总胆汁酸检测试剂，优选的，所述EDTA的浓度范围为4.0g/L～10.0g/L。
上述的总胆汁酸检测试剂，优选的，所述第二稳定剂包括聚氧乙烯十二烷基醚和β-环糊精。
上述的总胆汁酸检测试剂，优选的，所述第二稳定剂为BSA、甘露醇、甘氨酸、蔗糖、聚氧乙烯十二烷基醚和β-环糊精中的至少两种。
上述的总胆汁酸检测试剂，优选的，当所述第二稳定剂包括所述β-环糊精时，所述β-环糊精的浓度范围为0.5×10-4M～1.5×10-4M。
上述的总胆汁酸检测试剂，优选的，当所述第二稳定剂包括所述聚氧乙烯十二烷基醚时，所述聚氧乙烯十二烷基醚的浓度范围为2.0g/L-20.0g/L。
上述的总胆汁酸检测试剂，优选的，所述第一缓冲液的浓度为1.0g/L～5.0g/L，所述第一表面活性剂的浓度为5.0g/L～10.0g/L，所述第一防腐剂的浓度为0.4g/L～5.0g/L，所述硫代氧化型辅酶I的浓度为0.5g/L～2.0g/L。
上述的总胆汁酸检测试剂，优选的，所述第二缓冲液的浓度为20.0g/L～40.0g/L，所述第二表面活性剂的浓度为5.0g/L～20.0g/L，所述第二防腐剂的浓度为0.5g/L～1.0g/L，所述3α-类固醇脱氢酶的浓度为5.0KU/L～10.0KU/L，所述NADH的浓度为1.0g/L～5.0g/L。
本发明通过在R1反应液中添加包括1，2-二硫代苏糖醇和EDTA的复合稳定剂，能大大增强总胆汁酸检测试剂的稳定性。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
本发明实施例提供一种总胆汁酸检测试剂，包括R1反应液和R2反应液，其中，R1反应液包括第一缓冲液、第一稳定剂、第一表面活性剂、第一防腐剂和Thio-NAD，R2反应液包括第二缓冲液、第二稳定剂、第二表面活性剂、第二防腐剂、3α-类固醇脱氢酶和NADH。
其中，第一稳定剂包括1，2-二硫代苏糖醇和EDTA，通过在R1反应液中添加包括1，2-二硫代苏糖醇和EDTA在内的复合稳定剂，能大大增强总胆汁酸检测试剂的稳定性。
作为优选方案，第一稳定剂还包括甘氨酸、甘露醇、蔗糖和海藻糖中的至少一种。
本实施例所提供的总胆汁酸检测试剂，1,2-二硫代苏糖醇的浓度范围优选为6.0g/L～10.0g/L，EDTA的浓度范围优选为4.0g/L～10.0g/L。
本发明实施例还提供一种总胆汁酸检测试剂，其第二稳定剂可以包括聚氧乙烯十二烷基醚和β-环糊精。通过在R2反应液中添加聚氧乙烯十二烷基醚和β-环糊精的复合稳定剂，能大大增强总胆汁酸检测试剂的稳定性。
本发明实施例提供的总胆汁酸检测试剂，还可以在第一稳定剂包括1，2-二硫代苏糖醇和EDTA的同时，第二稳定剂包括聚氧乙烯十二烷基醚和β-环糊精，通过在R1反应液和R2反应液中同时添加复合稳定剂，能使总胆汁酸检测试剂的稳定性更强。
本发明实施例提供的总胆汁酸检测试剂，第二稳定剂还可以包括BSA、甘露醇、甘氨酸、蔗糖、聚氧乙烯十二烷基醚和β-环糊精中的至少两种物质。
其中，当第二稳定剂包括所述β-环糊精时，β-环糊精的浓度范围为0.5×10-4M～1.5×10-4M。当所述第二稳定剂包括所述聚氧乙烯十二烷基醚时，聚氧乙烯十二烷基醚的浓度范围为2.0g/L-20.0g/L。
优选的，本发明实施例提供的总胆汁酸检测试剂的第一缓冲液的浓度为1.0g/L～5.0g/L，第一表面活性剂的浓度为5.0g/L～10.0g/L，第一防腐剂的浓度为0.4g/L～5.0g/L，硫代氧化型辅酶I的浓度为0.5g/L～2.0g/L。
优选的，本发明实施例提供的总胆汁酸检测试剂的第二缓冲液的浓度为20.0g/L～40.0g/L，第二表面活性剂的浓度为5.0g/L～20.0g/L，第二防腐剂的浓度为0.5g/L～1.0g/L，3α-类固醇脱氢酶的浓度为5.0KU/L～10.0KU/L，NADH的浓度为1.0g/L～5.0g/L。
本发明实施例提供的总胆汁酸检测试剂，R1反应液中的缓冲液可以为柠檬酸-柠檬酸钠、甘氨酸、Good's缓冲液和MES缓冲液中的至少一种，其中，缓冲液的pH为3.5-5.5。
本发明实施例提供的总胆汁酸检测试剂，R2反应液中的缓冲液可以为Tris、PBS、Good's缓冲液中的至少一种，所述R2反应液中的缓冲液的pH为8.0-10.0。
本发明实施例提供的总胆汁酸检测试剂，R1反应液中的表面活性剂可以为PEG-8K、曲拉通-100、吐温20和Brij35中的至少一种。
本发明实施例提供的总胆汁酸检测试剂，R2反应液中的表面活性剂可以为PEG-8K、曲拉通-100、吐温20和Brij35中的至少一种。
本发明实施例提供的总胆汁酸检测试剂，R1反应液中的防腐剂可以为叠氮化钠、苯甲酸钠、Proclin300和硫酸庆大霉素中的一种。
本发明实施例提供的总胆汁酸检测试剂，R2反应液中的防腐剂为叠氮化钠、苯甲酸钠、Proclin300、硫酸庆大霉素中的一种。
下面将将结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
实验一：R1反应液稳定性实验
实施例1-3
实施例1-3涉及三种配方的总胆汁酸检测试剂，总胆汁酸检测试剂有R1反应液和R2反应液组成，其中，R1反应液和R2反应液的各组分及浓度如表1所示：
表1实施例1-3配方
本实施例1-3中的总胆汁检测试剂，适用于迈瑞全自动生化分析仪和日立7600全自动生化分析仪，分析方法为速率法。
检测方法为：取270μl的R1反应液加入待测4μl样本混合均匀后于37℃孵育5min，再加入90μl的R2反应液，孵育1min，读取此时的吸光度，继续反应3min，连续监测3min内的吸光度变化率。检测波长分别主波长405nm、副波长660nm。
按照实施例1-3的配方配制试剂，与已上市的某公司的总胆汁酸检测试剂(R1反应液主要成分：GOOD's缓冲液和Thio-NAD；R2反应液主要成分：GOOD’s缓冲液、3α-类固醇脱氢酶、NADH)进行对比试验，分别同时测试20组临床血清样本，检测结果如表5所示。与此同时，我们还将实施1-3与对照试剂测试临床样本的数据进行了相关性分析,将对比例作为X轴，将实施例1-3作为Y轴，得到了相关性系数r2。
表2临床样本检测结果比对(单位：μmol/L)
从表2结果可以看出，实施例1-3与对比例的相关性均很好，r2>0.999，线性范围不低于180μmol/L。
将实施例1-3配制的试剂和对比例的试剂，置于37℃条件下老化，分别监测老化5、7、9天后，试剂测试质控品的结果，并与4℃0天测试结果进行对比，以此考察该试剂在热稳定性，试验结果如表3。
表3实施例1-3试剂稳定性试验结果
从以上结果可知，对比例试剂在37℃条件下保持5天，与4℃0天对比，偏差约15％，而实施例2和实施例3的试剂在37℃条件下保持7天，偏差<15％，实施例1的试剂37℃条件下保持9天，偏差<15％。其中，案例1为最优案例。即R1反应液中同时加入1,2-二硫代苏糖醇和EDTA之后，试剂的稳定性有一定程度的提高。
实验二：R2反应液稳定性实验
实施例4-6
本实施例4-6涉及三种配方的总胆汁酸检测试剂，总胆汁酸检测试剂有R1反应液和R2反应液组成，其中，R1反应液和R2反应液的各组分及浓度如表4所示：
表4实施例4-6配方
本实施例4-6中的总胆汁检测试剂，适用于迈瑞全自动生化分析仪和日立7600全自动生化分析仪，分析方法为速率法。
检测方法为：取270μl的R1反应液加入待测4μl样本混合均匀后于37℃孵育5min，再加入90μl的R2反应液，孵育1min，读取此时的吸光度，继续反应3min，连续监测3min内的吸光度变化率。检测波长分别主波长405nm、副波长660nm。
按照实施例4-6的配方配制试剂，与已上市的某公司的总胆汁酸检测试剂进行比对试验，分别同时测试20组临床血清样本，检测结果如表5所示。与此同时，我们还将实施4-6与对照试剂测试临床样本的数据进行了相关性分析,将对比例作为X轴，将实施例4-6作为Y轴，得到了相关性系数r2。
表5临床样本检测结果比对(单位：μmol/L)
从表5结果可以看出，实施例4-6与对比例的相关性均很好，r2>0.999。
将实施例4-6的试剂置于37摄氏度条件下老化，分别检测老化5、7、9天后，试剂测试质控品的结果，并与4℃0天的测试结果进行比对，以此考察该试剂的热稳定性，实验结果如表6。
表6稳定性试验结果
从以上结果可知，对比例试剂在37℃条件下保持5天，与37℃0天条件下的结果对比，偏差约15％，而实施案例5和实施案例6的试剂在37℃条件下保持7天，偏差<15％。实施例4的试剂在37℃条件下保持9天，与0天比偏差<15％。其中，实施例4为最优案例。R2反应液中同时加入β-环糊精、聚氧乙烯十二烷基醚和甘氨酸之后，试剂的稳定性有较明显的提高。
以上对本发明所提供的一种总胆汁酸检测试剂进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种总胆汁酸检测试剂，其特征在于，包括R1反应液和R2反应液，其中，
所述R1反应液包括第一缓冲液、第一稳定剂、第一表面活性剂、第一防腐剂和Thio-NAD；
所述R2反应液包括第二缓冲液、第二稳定剂、第二表面活性剂、第二防腐剂、3α-类固醇脱氢酶和NADH；
所述第一稳定剂包括1，2-二硫代苏糖醇和EDTA。
2.根据权利要求1所述的总胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述第一稳定剂还包括甘氨酸、甘露醇、蔗糖和海藻糖中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的总胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述1,2-二硫代苏糖醇的浓度范围为6.0g/L～10.0g/L。
4.根据权利要求1所述的总胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述EDTA的浓度范围为4.0g/L～10.0g/L。
5.根据权利要求1中所述的总胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述第二稳定剂包括聚氧乙烯十二烷基醚和β-环糊精。
6.根据权利要求1中所述的总胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述第二稳定剂为BSA、甘露醇、甘氨酸、蔗糖、聚氧乙烯十二烷基醚和β-环糊精中的至少两种。
7.根据权利要求5或6所述的总胆汁酸检测试剂，其特征在于，当所述第二稳定剂包括所述β-环糊精时，所述β-环糊精的浓度范围为0.5×10-4M～1.5×10-4M。
8.根据权利要求5或6所述的总胆汁酸检测试剂，其特征在于，当所述第二稳定剂包括所述聚氧乙烯十二烷基醚时，所述聚氧乙烯十二烷基醚的浓度范围为2.0g/L-20.0g/L。
9.根据权利要求1所述的总胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述第一缓冲液的浓度为1.0g/L～5.0g/L，所述第一表面活性剂的浓度为5.0g/L～10.0g/L，所述第一防腐剂的浓度为0.4g/L～5.0g/L，所述硫代氧化型辅酶I的浓度为0.5g/L～2.0g/L。
10.根据权利要求1所述的总胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述第二缓冲液的浓度为20.0g/L～40.0g/L，所述第二表面活性剂的浓度为5.0g/L～20.0g/L，所述第二防腐剂的浓度为0.5g/L～1.0g/L，所述3α-类固醇脱氢酶的浓度为5.0KU/L～10.0KU/L，所述NADH的浓度为1.0g/L～5.0g/L。
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