CN101140279A - 一种还原性辅酶复合稳定剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种还原性辅酶复合稳定剂，它由缓冲剂、稳定剂、有机溶剂、螯合剂、防腐剂和无机盐组成。本发明对还原性烟酰胺嘌呤二核苷酸(NADH)和还原性烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)具有高度的稳定性。

Description

一种还原性辅酶复合稳定剂
技术领域
本发明涉及诊断试剂，尤其涉及一种还原性辅酶复合稳定剂。
背景技术
目前诊断试剂中运用还原性烟酰胺嘌呤二核苷酸(NADH)和还原性烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作为反应底物的产品非常多。如丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(AST，)总胆汁酸(TBA)，α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)，腺苷脱氨酶(ADA)，直接胆红素(DBIL)等。其应用NADH和NADPH的目的是作为反应的指示剂(反应由NADH/NADPH转化为NAD/NADP，其在340nm处吸光度明显下降)或是作为抗干扰剂使用。上述诊断项目在临床诊断上具有广泛的意义，尤其是在肝胆疾病中的应用。而还原性烟酰胺嘌呤二核苷酸(NADH)和还原性烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)在水溶液中是十分不稳定的，因为它们一直在进行氧化还原反应。由于这些试剂很不稳定，因而影响到上述试剂的性能，也必将对临床疾病的诊断结果带来重大的影响。目前，国内外还缺少一种行之有效的方法来保护还原性烟酰胺嘌呤二核苷酸(NADH)和还原性烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)稳定性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种复合稳定剂。本发明提供了一种还原性辅酶复合稳定剂，它由下列成分组成。
1、缓冲剂：
3-(环己氨)2-羟基丙磺酸(CAPSO)、2-(环己氨基)乙磺酸(CHES)、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(AMPSO)或氨甲基丙二醇(AMPD)
浓度：5-300g/L
可以选择其中一种或几种成分单独使用或联合使用。
2、稳定剂：
牛血清白蛋白或二硫代苏糖醇
浓度0.1-50g/L
可以选择其中一种或几种成分单独使用或联合使用。
3、有机溶剂：
乙二醇、丙二醇、丙醇或苯二醇
浓度在10-200g/L
可以选择其中一种或几种成分单独使用或联合使用。
4、螯合剂：
乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA)或羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)
浓度0.3-5.0g/L
可以选择其中一种或几种成分单独使用或联合使用。
5、防腐剂：
proclin300、NaN3、庆大霉素、红霉素或羟基苯甲酸
浓度在0.1-2.0g/L
可以选择其中一种或几种成分单独使用或联合使用。
6、无机盐
氯化钠、氯化钾、醋酸镁、氯化镁、硫酸钠或硫酸镁
浓度在1-50g/L
可以选择其中一种或几种成分单独使用或联合使用。
本发明的另一目的是提供了上述一种稳定的还原性辅酶复合稳定剂的配制方法：
称取一定量的上述物质，依次加入到0.8升的去离子水中，待溶解完全后，后调整PH值至9.5，然后定容至1L。
具体实施方式
实例1
CAPSO：5g
甘油：20g
乙二醇50g
氯化钠9g
EGTA 0.42g
NaN3 1g
称取上述物质依次加入0.8L去离子水中，待溶解完全后调整PH值至9.5，然后定容至1L待用。
称取0.3gNADH溶解于上述1L混合液中(I号溶液)分别量取50mLNADH混合液6瓶(依次称之为A，B，C，D，E，F号)
A号瓶：置4℃冰箱中
B号瓶：置37℃烘箱中  1天
C号瓶：置37℃烘箱中  2天
D号瓶：置37℃烘箱中  3天
E号瓶：置37℃烘箱中  4天
F号瓶：置37℃烘箱中  5天
在340nm处，我们用分光光度计进行检测
  A   B   C   D   E   F
  1.47   1.416   1.409   1.409   1.405   1.395
可见，在加速实验中，NADH在本发明的稳定剂中跌幅很小，只有5.1％。
配制含0.3gNADH的水溶液1L(II号溶液)分别量取50ml的溶液6瓶。(依次为A’号，B’号，C’号，D’号，E’号，F’号)
A’号置4度冰箱
B’号置37℃烘箱  1天
C’号置37℃烘箱  2天
D’号置37℃烘箱  3天
E’号置37℃烘箱  4天
F’号置37℃烘箱  5天
在340nm处，我们用分光光度计进行检测
  A’   B’   C’   D’   E’   F’
  吸光度值   1.416   1.327   1.206   1.087   0.908   0.747
可见在以上实验中，NADH在水溶液中分解很快，下降幅度高达47.2％显然，通过以上两组的对照实验，本发明的稳定剂对NADH的稳定性具有明显的功效。我们再依次对I号，II号的检测稳定性进行实时检测
  0   1个月   3个月   5个月   7个月   9个月   11个月   13个月
  I号溶液   1.417   1.416   1.416   1.412   1.408   1.408   1.397   1.384
  II号溶液   1.416   1.346   1.243   1.131   1.005   0.936   0.857   0.716
在以上实时稳定性实验中，我们可以发现实验数据与加速实验的数据是完全吻合的，本发明的稳定剂对NADH的稳定性具有明显的效果。
实例2
AMPSO       100g
EDTA        5g
KCl         50g
proclin300  0.1g
笨二醇      200g
BSA    100mg
称取上述物质依次加入0.8L去离子水中，待溶解完全后调整PH值至9.5，然后定容至1L待用。
称取0.3gNADPH溶解于上述1L混合液中分别量取50mLNADPH混合液6瓶(依次称之为A，B，C，D，E，F号)
A号瓶：置4℃冰箱中
B号瓶：置37℃烘箱中  1天
C号瓶：置37℃烘箱中  2天
D号瓶：置37℃烘箱中  3天
E号瓶：置37℃烘箱中  4天
F号瓶：置37℃烘箱中  5天
在340nm处，我们用分光光度计进行检测
  A   B   C   D   E   F
  吸光度值   1.45   1.44   1.409   1.400   1.400   1.392
可见，本发明的稳定剂对NADPH的稳定性具有明显的作用。
实例3
AMPSO         75g
CAPSO         7.5g
二硫代苏糖醇  30g
丙醇          25g
NA2SO4        20g
庆大酶素      1.0g
BSA           100mg
称取上述物质依次加入0.8L去离子水中，待溶解完全后调整PH值至9.5，然后定容至1L待用。
称取0.3gNADH溶解于上述1L混合液中分别量取50mLNADH混合液6瓶(依次称之为A，B，C，D，E，F号)
A号瓶：置4℃冰箱中
B号瓶：置37℃烘箱中  1天
C号瓶：置37℃烘箱中  2天
D号瓶：置37℃烘箱中  3天
E号瓶：置37℃烘箱中  4天
F号瓶：置37℃烘箱中  5天
在340nm处，我们用分光光度计进行检测
  A   B   C   D   E   F
  1.46   1.45   1.45   1.43   1.43   1.425
可见，本发明的稳定剂对NADH的稳定性具有明显的效用。
实例4
CHES            25g
二硫代苏糖醇    7g
丙二醇          10g
EGTA            1.3g
MgAC2           30g
红酶素          2.0g
称取上述物质依次加入0.8L去离子水中，待溶解完全后调整PH值至9.5，然后定容至1L待用。
称取0.3gNADPH溶解于上述1L混合液中分别量取50mLNADPH混合液6瓶(依次称之为A，B，C，D，E，F号)
A号瓶：置4℃冰箱中
B号瓶：置37℃烘箱中  1天
C号瓶：置37℃烘箱中  2天
D号瓶：置37℃烘箱中  3天
E号瓶：置37℃烘箱中  4天
F号瓶：置37℃烘箱中  5天
在340nm处，我们用分光光度计进行检测
  A   B   C   D   E   F
  吸光度值   1.46   1.44   1.44   1.43   1.41   1.39
可见，本发明的稳定剂对NADPH的稳定性具有明显的作用。
实例5
CAPSO       70g
EDTA        2.4g
BSA         0.5g
丙二醇      100g
羟基苯甲酸  1.48g
硫酸钠      36.9g
氯化钠      2.87g
称取上述物质依次加入0.8L去离子水中，待溶解完全后调整PH值至9.5，然后定容至1L待用。
称取0.3gNADPH溶解于上述1L混合液中分别量取50mLNADPH混合液6瓶(依次称之为A，B，C，D，E，F号)
A号瓶：置4℃冰箱中
B号瓶：置37℃烘箱中  1天
C号瓶：置37℃烘箱中  2天
D号瓶：置37℃烘箱中  3天
E号瓶：置37℃烘箱中  4天
F号瓶：置37℃烘箱中  5天
在340nm处，我们用分光光度计进行检测
  A   B   C   D   E   F
  吸光度值   1.453   1.414   1.409   1.407   1.404   1.402
可见，本发明的稳定剂对NADPH的稳定性具有明显的作用。
实例6
CHES           25g
二硫代苏糖醇   7g
丙二醇         10g
苯二醇         18g
EGTA           1.3g
MgAC2          30g
NaN3           1g
称取上述物质依次加入0.8L去离子水中，待溶解完全后调整PH值至9.5，然后定容至1L待用。
称取0.3gNADH溶解于上述1L混合液中分别量取50mLNADH混合液6瓶(依次称之为A，B，C，D，E，F号)
A号瓶：置4℃冰箱中
B号瓶：置37℃烘箱中  1天
C号瓶：置37℃烘箱中  2天
D号瓶：置37℃烘箱中  3天
E号瓶：置37℃烘箱中  4天
F号瓶：置37℃烘箱中  5天
在340nm处，我们用分光光度计进行检测
  A   B   C   D   E   F
  吸光度值   1.450   1.444   1.434   1.427   1.414   1.413
可见，本发明的稳定剂对NADH的稳定性具有明显的效用。

Claims (7)

1.一种还原性辅酶复合稳定剂，其特征在于它是由下列浓度配比的成分组成：缓冲剂5-300g/L、稳定剂0.1-50g/L、有机溶剂10-200g/L、螯合剂0.3-5.0g/L、防腐剂0.1-2.0g/L和无机盐1-50g/L。
2.根据权利要求1所述的一种还原性辅酶复合稳定剂，其特征在于其中所述缓冲剂为3-(环己氨)2-羟基丙磺酸、2-(环己氨基)乙磺酸、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸或氨甲基丙二醇中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种还原性辅酶复合稳定剂，其特征在于其中所述稳定剂为甘油、牛血清白蛋白或二硫代苏糖醇中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种还原性辅酶复合稳定剂，其特征在于其中所述有机溶剂为乙二醇、丙二醇、丙醇或苯二醇中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种还原性辅酶复合稳定剂，其特征在于其中所述螯合剂为乙二胺四乙酸、乙二醇双(2-氨基乙基)四乙酸或羟乙基乙二胺三乙酸中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的一种还原性辅酶复合稳定剂，其特征在于其中所述防腐剂为proclin 300、NaN3、庆大霉素、红霉素或羟基苯甲酸中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种还原性辅酶复合稳定剂，其特征在于其中所述无机盐为氯化钠、氯化钾、醋酸镁、氯化镁、硫酸钠或硫酸镁中的一种或多种。
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