CN108220387B - 一种总胆汁酸检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外诊断试剂检测技术领域，具体涉及一种总胆汁酸检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，试剂R1包括缓冲液、表面活性剂、防腐剂、等渗调节剂和Thio‑NAD；试剂R2包括缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、还原型辅酶I和3α‑羟基类固醇脱氢酶，试剂R1中的缓冲液为甘氨酸缓冲液、柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液、邻苯二甲酸氢钾‑氢氧化钠缓冲液、PBS缓冲液等；试剂R1中的等渗调节剂为NaCl、KCl、MgCl2中的一种或多种；试剂R2中的稳定剂为TEA、BSA、TCEP、谷胱甘肽、甘露醇等。利用本发明的试剂盒在测定特殊样本的总胆汁酸时，可改善反应曲线，而且长时间放置稳定性良好。

Description

一种总胆汁酸检测试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂检测技术领域，具体涉及一种总胆汁酸检测试剂盒。
背景技术
胆汁酸是胆汁的重要成分，在脂肪代谢中起着重要作用,胆汁酸主要存在于肠肝循环系统并通过再循环起一定的保护作用,只有一少部分胆汁酸进入外围循环,促进胆汁酸肠肝循环的动力是肝细胞的转运系统，吸收胆汁酸并将其分泌入胆汁、缩胆囊素诱导的胆囊收缩、小肠的推进蠕动，回肠黏膜的主动运输及血液向门静脉的流入。
总胆汁酸(TBA)是一系列物质的总称，具体包括胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)和代谢中产生的脱氧胆酸(DCA)还有少量石胆酸(LCA)和微量熊脱氧胆酸(UDCA)。人体血清总胆汁酸(TBA)是由肝脏合成并分解代谢，从而维持人体胆汁酸的相对稳定，它的调控是肝脏的一个主要功能。当肝细胞发生病变或患胆管疾病时可引起胆汁的代谢障碍，使进入血中的胆汁酸含量显著升高，血清TBA升高与肝细胞损伤程度成正比。
目前市售的总胆汁酸检测试剂盒主要采用酶循环法。其反应原理是利用3α-HSD和硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)特异性氧化胆汁酸，生成3-酮类固醇和还原性硫代氧化型辅酶(Thio-NADH)；然后在3α-HSD存在的条件下，3-酮类固醇和还原型辅酶Ⅰ(NADH)又生成胆汁酸和氧化型辅酶(NAD)，每一次循环比原来的反应提高一倍的灵敏度，如此往复循环，从而放大微量的胆汁酸，产生大量的硫代还原型辅酶Ⅰ(Thio-NADH)，最后通过测定生成的Thio-NADH的吸光度变化，测得胆汁酸的含量。
然而本公司实验室通过大量不同厂家试剂的对比实验发现，基于该反应原理的总胆汁酸检测试剂盒在样本检测时也存在一定弊端：(1)试剂在检测某些特殊样本(尤其是低龄儿童血清或血浆)时，试剂R1会和样本发生反应，造成反应曲线漂移，从而使得空白吸光度上升，造成检测结果异常；(2)随着试剂放置时间的延长，试剂的检测灵敏度会降低，使因数K值升高，造成试剂的检测稳定性下降。因此研究开发一种反应曲线更好、稳定度更高的总胆汁酸检测试剂盒显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种反应曲线更好、稳定度更高的总胆汁酸检测试剂盒，该检测试剂盒在检测特殊样本时反应曲线波动小，并且长时间放置稳定性良好。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种总胆汁酸检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括缓冲液、表面活性剂、防腐剂、等渗调节剂和Thio-NAD；所述试剂R2包括缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、还原型辅酶I和3α-羟基类固醇脱氢酶，其特征在于：
所述试剂R1中的缓冲液为甘氨酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液、PBS缓冲液、GOOD’S缓冲液中的一种或多种，且所述缓冲液的pH为3.0-6.6；
所述试剂R1中的等渗调节剂为NaCl、KCl、MgCl2中的一种或多种；
所述试剂R2中的稳定剂为TEA、BSA、TCEP、谷胱甘肽、甘露醇、海藻糖、蔗糖中的多种。
作为一种优选的技术方案，所述试剂R2中的稳定剂为BSA、TCEP和谷胱甘肽。
作为一种改进的技术方案，所述试剂R1中缓冲液的终浓度为30-85mmol/L、表面活性剂的浓度为0.1-5g/L、防腐剂的浓度为0.5-2g/L、等渗调节剂的浓度为1-15g/L和Thio-NAD的浓度为0.2-2g/L；所述试剂R2中缓冲液的终浓度为30-85mmol/L、表面活性剂的浓度为0.5-5.5g/L、防腐剂的浓度为0.2-2g/L、还原型辅酶I的浓度为1.5-6mmol/L和3α-羟基类固醇脱氢酶的浓度为5-26KU/L，稳定剂中BSA、TCEP和谷胱甘肽的终浓度分别为0.2-5g/L、2-12g/L和0.6-10g/L。
作为一种优选的技术方案，所述稳定剂中BSA、TCEP和谷胱甘肽的终浓度分别为0.5-2g/L、5-10g/L和1-6g/L。
作为一种优选的技术方案，所述试剂R1中的缓冲液为甘氨酸缓冲液或GOOD’S，所述缓冲液的pH为4.0-4.8,所述缓冲液的终浓度为50-60mmol/L。
作为一种优选的技术方案，所述试剂R1中的等渗调节剂为MgCl2，且所述MgCl2的终浓度为6-10g/L。
作为一种改进的技术方案，所述试剂R1和试剂R2中的表面活性剂均为吐温系列、Brij系列、Triton系列中的一种或多种。
作为一种优选的技术方案，所述试剂R1的表面活性剂为Brij系列中的一种或多种，且所述表面活性剂的终浓度为0.5-1g/L；所述试剂R2中的表面活性剂为Triton系列中的一种或多种，且所述表面活性剂的终浓度为0.5-1g/L。
作为一种改进的技术方案，所述试剂R2中的缓冲液为PBS缓冲液、巴比妥那缓冲液、Tris缓冲液、GOOD’S缓冲液中的一种或多种，且所述缓冲液的pH为7.6-9.2。
作为一种优选的技术方案，所述试剂R2中的缓冲液为Tris缓冲液或GOOD’S缓冲液，且所述缓冲液的pH为7.9-8.5，所述缓冲液的终浓度为50-80mM。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明中的试剂盒，其试剂R1组分中的缓冲液选择甘氨酸缓冲液或GOOD’S缓冲液，且通过实验证明，当调整该缓冲液的pH值为4.0-4.8时，可改善试剂盒在检测某些特殊样本(尤其是儿童血清或血浆)时的反应曲线问题；此外在确定试剂R1中缓冲液组分以及适宜pH后，还可加入合适类型的等渗调节剂，并调整等渗调节剂的浓度范围在6-10g/L。实验中发现，等渗调节剂除了发挥常规的稳定作用外，还可以与R1中的缓冲液产生协同作用共同改善反应曲线，降低反应曲线的波动。
(2)本发明中的试剂盒，其试剂R2中的稳定剂选用多种组分组合，并经过稳定剂筛选实验，复合稳定剂相较于其他单一稳定剂或该稳定剂中的任意单一试剂而言，稳定效果更好。本发明提供的检测试剂盒，其在37℃下的加速稳定性实验中可以达到9-11天，其在2-8℃下的定标稳定性实验中可以达到35-40天。
综上所述，本发明的试剂R1组分中选择适宜的缓冲液以及pH,再选择适宜的等渗调节剂以及适宜的浓度，试剂R2组分中选择复合稳定剂，通过这一改进使所研发的试剂盒在检测特殊样本(尤其是低龄儿童血清或血浆)时，反应曲线波动小，而且该试剂盒长时间放置稳定性良好。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1-3
实施例1-3分别涉及一种反应曲线更好、稳定度更高的总胆汁酸检测试剂盒，试剂盒包括试剂R1及试剂R2，所述试剂R1、R2的各组分及浓度见表1：
表1
Figure BDA0001611324110000041
本实施例1～3描述的总胆汁酸检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化分析仪，以日立7170全自动生化分析仪为例。
分析方法：速率法；
测定波长：主波长405nm、副波长660nm；
样本：试剂R1：试剂R2＝3:210:70(单位ul)
操作方法：210ul试剂R1加入3ul样本，于37℃孵育5min后加入70ulR2，延迟60秒读数，读数时间约180秒，其具体操作如表2所示:
表2
Figure BDA0001611324110000051
实施例4反应曲线的观察评估
评估方法：通过调整试剂R1至不同pH并且加入不同类型及浓度的等渗调节剂建立实施例4、对比例4-1,4-2和4-3,观察并记录反应曲线的波动情况，实施例4和对比例4-1,4-2和4-3各组分的用量以及具体结果见表3；
评估标准：用“+”的多少来表示反应曲线的漂移或波动情况，“+”越多，表示曲线漂移越厉害，波动越大，曲线越差；反之，“+”越少，表示曲线漂移越小，波动越小，曲线越平稳。
表3
Figure BDA0001611324110000061
由表3结果表明，本发明通过调整试剂R1的pH并且同时要加入合适浓度的等渗调节剂，可以使得反应曲线变化最小，曲线更好。
实施例5稳定剂的筛选试验及对比验证实验
稳定剂筛选：选择不同的稳定剂类型的一种或几种的组合建立实施例5和对比例5-1、5-2，同时在37℃下进行加速破坏，间隔相同破坏时间后进行定标，记录关键因数K值。我们以K＝1000(综合多个不同厂家的技术要求)为判定标准，超出该值，说明试剂不符合要求。下面仅列出2组对比例的对比效果，但是要知道具体对比例还包括许多其他多种不同稳定剂的组合，其中实施例和对比例的配方见表4，加速破坏实验过程中，K值变化情况见表5。
表4
Figure BDA0001611324110000071
表5
试剂 因数 0天 1天 3天 5天 7天
对比例5-1 K值 663 671 782 946 1409
对比例5-2 K值 682 721 913 1025 1613
实施例5 K值 609 612 619 624 640
结果表明，实施例5的K值变化最小，且均符合技术要求；对比例5-1和5-2都在破坏过程中出现了K值超标(1000)的结果。说明本发明提供的试剂盒中的稳定剂组合相较于其他稳定剂组合或者单一稳定剂而言具有突出的稳定作用，效果显著。
实施例6稳定性考察
稳定性试验：将参比试剂(其他厂家的试剂)和按照本发明试剂盒组分配置的试剂(自配试剂)同时在37℃下进行破坏，并间隔相同破坏时间后进行定标，记录K值，再与第一天的初始K值进行偏差计算，比较大小。对比结果见表6。
表6
Figure BDA0001611324110000081
对比结果表明，本发明提供的试剂盒的加速破坏稳定性更好，尤其是从第9天开始，对比结果非常明显。
实施例7定标稳定性实验评估
评估方法：首先将参比试剂和自配试剂同时定标(相同校准值)，然后每天测质控(低值和高值)，做好记录，再与质控靶值计算偏差，偏差在±10％以内表示在控。
实验过程中发现，在前25天参比试剂和自配试剂的质控偏差变化均在10％以内；但从第26天开始，参比试剂的质控偏差变化逐渐升高，到第30天时，偏差超过15％，而自配试剂的质控偏差变化仍然在10％以内；从第31天开始，自配试剂的质控偏差变化才逐渐升高，到第40天时，偏差超过15％。
上述实验对比结果表明，本发明提供的试剂盒的定标稳定性更好。
本专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种总胆汁酸检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括缓冲液、表面活性剂、防腐剂、等渗调节剂和Thio-NAD；所述试剂R2包括缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、还原型辅酶I和3α-羟基类固醇脱氢酶，其特征在于：
所述试剂R1中的缓冲液为甘氨酸缓冲液，且所述缓冲液的pH为4.2；
所述试剂R1中的表面活性剂为Brij35；
所述试剂R1中的等渗调节剂为MgCl2；
所述试剂R1中的防腐剂为NaN3 ；
所述试剂R2中的缓冲液为Tris，且所述缓冲液的pH为7.9；
所述试剂R2中的表面活性剂为Triton100 ；
所述试剂R2中的防腐剂为Proclin300 ；
所述试剂R2中的稳定剂为BSA、TCEP和谷胱甘肽；
所述试剂R1中缓冲液的终浓度为40mM、表面活性剂的浓度为0.8g/L、防腐剂的浓度为0.5g/L、所述MgCl2的终浓度为2g/L和Thio-NAD的浓度为0.8g/L；所述试剂R2中缓冲液的终浓度为50mM、表面活性剂的浓度为5g/L、防腐剂的浓度为1.2g/L、还原型辅酶I的浓度为2mmol/L和3α-羟基类固醇脱氢酶的浓度为15KU/L；稳定剂中BSA、TCEP和谷胱甘肽的终浓度分别为2g/L、5g/L和 6g/L。
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