CN105067541A - 一种硫代氧化型辅酶ⅰ试剂及其应用 - Google Patents

一种硫代氧化型辅酶ⅰ试剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种硫代氧化型辅酶Ⅰ(Thio-NAD)试剂，所述试剂的组成成分包括：Thio-NAD、缓冲液、表面活性剂和稳定剂；所述表面活性剂选自由聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇对异辛基苯基醚、聚乙二醇单月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烃基乙二醇醚和烷基聚乙烯乙二醇醚中所组成的组中的一种或两种。通过上述技术方案，本发明所提供的Thio-NAD试剂2-8℃开盖使用状态,稳定时间可以达到20-30天，在2-8℃密闭避光存储过程中的稳定时间可以达到10-15个月。

Description

一种硫代氧化型辅酶Ⅰ试剂及其应用
技术领域
本发明涉及生化检测领域，具体的，涉及一种硫代氧化型辅酶Ⅰ(Thio-NAD)试剂及其应用。
背景技术
硫代氧化型辅酶Ⅰ(Thio-NAD)，淡黄色或黄色粉末，在很多脱氢酶的作用下，它们可以传递作用物分子的氢，生成还原型Thio-NADH，Thio-NADH在400nm左右有特异吸收峰，所以临床生化领域中，广泛利用Thio-NAD和Thio-NADH的特点，作为监测生化反应的指标，用来计算被测物的浓度或者活力。例如，在总胆汁酸测定技术中，Thio-NAD可以与3α-HSD一起特异性氧化胆汁酸，生成3-酮类固醇和还原性辅酶(NADH)，体系中有一定量的NADH存在时，又反向生成胆汁酸，每一次循环比原来的反应提高一倍的灵敏度，如此往复循环，从而放大微量的胆汁酸，产生大量的水溶性非染料的硫代还原型辅酶(Thio-NADH)，最后测定生成的Thio-NADH的吸光度变化，测得胆汁酸的含量。此外，Thio-NAD还参与其他的酶循环体系测定样本中某组份的浓度或活力，如欧洲专利EP2460888A1提供的脱氢酶和脱氢酶底物测定方法和试剂、0477001A2提供的高敏肌醇测定方法、美国专利US8440442B2提供的磷酸测定方法、5266463提供高敏左旋肉碱测定方法和试剂。
由于Thio-NAD溶液会进行氧化还原反应，试剂不稳定，这种特性会影响上述试剂的性能。目前还没有一种行之有效的方式来保护Thio-NAD的稳定性。
因此有必要设计一种新的、使Thio-NAD保持稳定的复合试剂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的Thio-NAD溶液稳定性差的缺陷，提供一种在2-8℃开盖使用状态下和在2-8℃度密闭避光存储条件下持续稳定的Thio-NAD试剂。
为达到以上目的，本发明提供了一种硫代氧化型辅酶Ⅰ(Thio-NAD)试剂，所述试剂的组成成分包括：
Thio-NAD、缓冲液、表面活性剂和稳定剂所述缓冲液选自由磷酸盐缓冲液、焦磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸缓冲液、2-N-吗啡乙磺酸缓冲液、咪唑缓冲液所组成的组中的一种；所述表面活性剂选自由聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇对异辛基苯基醚、聚乙二醇单月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烃基乙二醇醚和烷基聚乙烯乙二醇醚中所组成的组中的一种或两种。
可选的，所述稳定剂选自由NaCl、KCl、MgCl2和EDTA.2Na和EDTA.2K所组成的组中的一种或多种。
可选的，在所述试剂中，Thio-NAD的浓度为0.01-10mmol/L、缓冲液的终浓度为5-500mmol/L、表面活性剂的浓度按质量体积百分含量(w/v)计为0.05-20％、稳定剂的浓度为0.1-20g/L。
可选的，在所述试剂中，Thio-NAD的浓度为0.5-5mmol/L、缓冲液的终浓度为10-100mmol/L、表面活性剂的浓度按质量体积百分含量(w/v)计为2-10％、稳定剂的浓度为1-10g/L。
可选的，所述试剂的pH为3.0-5.5。
可选的，所述缓冲液为甘氨酸缓冲液和2-N-吗啡乙磺酸(MES)中的至少一种。
可选的，所述表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚(EMULGEN109P)和聚乙二醇对异辛基苯基醚(曲拉通TX-100)中的至少一种。
可选的所述稳定剂为MgCl2和EDTA.2Na中的至少一种。
本发明还提供了所述Thio-NAD试剂的应用。
可选的，所述应用包括制备总胆汁酸测定试剂、酶循环法高敏肌醇测定试剂、酶循环法高敏左旋肉碱测定试剂、酶循环法磷酸测定试剂、酶循环法脱氢酶测定试剂等。
通过上述技术方案，本发明所提供的Thio-NAD在2-8℃开盖使用状态下的稳定时间可以达到20-30天。在2-8℃密闭避光存储过程中的稳定时间可以达到10-15个月。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
本发明提供了一种Thio-NAD试剂，所述试剂的组成成分包括：
Thio-NAD、缓冲液、表面活性剂和稳定剂；所述缓冲液选自由磷酸盐缓冲液、焦磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸缓冲液、2-N-吗啡乙磺酸缓冲液、咪唑缓冲液所组成的组中的一种；所述表面活性剂选自由聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇对异辛基苯基醚、聚乙二醇单月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烃基乙二醇醚和烷基聚乙烯乙二醇醚中所组成的组中的一种或两种；所述稳定剂选自由NaCl、KCl、MgCl2和EDTA.2Na或EDTA.2K所组成的组中的一种或多种。
其中，所述试剂为稳定且均一的液体，Thio-NAD、表面活性剂和稳定剂均溶解于缓冲液中。
在本发明中，所述缓冲液的终浓度表示利用Thio-NAD、缓冲液、表面活性剂和稳定剂等组分配制所述试剂后，试剂中起缓冲作用的有效成分的终浓度，例如，当所述缓冲液为2-N-吗啡乙磺酸时，缓冲液的终浓度表示配制获得的试剂中2-N-吗啡乙磺酸的浓度。当缓冲液由两种或两种以上有效成分组成时，缓冲液的终浓度指代几种有效成分的总浓度。
优选的，为了获得更好的稳定效果，所述表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基和聚乙二醇对异辛基苯基醚中的至少一种。
根据本发明的试剂，所述稳定剂选自由NaCl、KCl、MgCl2和EDTA.2Na或EDTA.2K所组成的组中的一种或多种，优选的为了获得最佳的稳定效果，所述稳定剂选自MgCl2和EDTA.2Na中的至少一种。
可选的，在所述试剂中，Thio-NAD的浓度为0.01-10mmol/L、缓冲液的终浓度为5-500mmol/L、表面活性剂的浓度为0.05-20％(w/v)、稳定剂的浓度为0.1-20g/L。
优选的，在所述试剂中，Thio-NAD的浓度为0.5-5mmol/L、缓冲液的终浓度为10-100mmol/L、表面活性剂的浓度为2-10％(w/v)、稳定剂的浓度为1-10g/L。
可选的，所述试剂的pH为3.0-5.5，优选的pH为3.5-4.5。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚(EMULGEN109P)和聚乙二醇对异辛基苯基醚(曲拉通TX-100)中的至少一种，所述稳定剂为MgCl2和EDTA.2Na中的至少一种。
其中，所述试剂在制备后在2-8℃开盖使用状态,稳定时间可以达到20-30天，在2-8℃度密闭避光存储条件下，稳定时间可以达到10-15个月。
可选的，所述试剂还可以包括去干扰剂和防腐剂等，其中，所述去干扰剂可以为丙酮酸钠、草酸、草酸盐类或草氨酸，去干扰剂的浓度为1-5mmol/L。
本发明还提供了所述Thio-NAD试剂的制备方法，本发明对于制备过程中各成分的混合顺序没有特别要求，可以直接将所述原料混合物中的各组分进行同时、分批或分步混合，只要能得到均匀的稳定相即可，优选通过搅拌使混合更加均匀。
本发明还提供了所述Thio-NAD试剂的应用。可选的，所述应用包括制备总胆汁酸测定试剂、酶循环法高敏肌醇测定试剂、酶循环法高敏左旋肉碱测定试剂、酶循环法磷酸测定试剂、酶循环法脱氢酶测定试剂等。
下面通过实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1-21
按照表1列出的组分含量制备Thio-NAD试剂，将各组分混合，得到均匀的稳定相，分别得到Thio-NAD试剂1-21。
表1
实施例1-21中，各组分的具体选择如下：
实施例1-17和21中，表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚(EMULGEN109P)，缓冲液为2-N-吗啡乙磺酸缓冲液，稳定剂为MgCl2和EDTA.2Na按照质量比1:1混合制成。
实施例18中，表面活性剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚(曲拉通TX-100)，缓冲液为2-N-吗啡乙磺酸缓冲液，稳定剂为MgCl2和EDTA.2Na按照质量比1:1混合制成。
实施例19中，表面活性剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚(曲拉通TX-100)，缓冲液为甘氨酸缓冲液，稳定剂为MgCl2和EDTA.2Na按照质量比1:1混合制成。
实施例20中，表面活性剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚(曲拉通TX-100)，缓冲液为2-N-吗啡乙磺酸，稳定剂为EDTA.2K。
实施例1-20中，去干扰剂为草氨酸钠。
对比例1
按照实施例1相同的方法制备Thio-NAD试剂，不同的是，将表面活性剂替换为TWEEN20，得到Thio-NAD试剂22。
对比例2
按照实施例1相同的方法制备Thio-NAD试剂，不同的是，将稳定剂替换为聚乙二醇，得到Thio-NAD试剂23。
测试例1
本测试例测定Thio-NAD试剂1-23的稳定性。测试Thio-NAD试剂1-23在8℃开盖使用状态下的稳定时间以及在8℃度密闭避光存储过程中的稳定时间，结果列于表2。
稳定时间的评价方法为：试剂8℃开盖使用状态下，30天之内，每天测定Thio-NAD的含量；试剂8℃度密闭避光存储条件下，在15个月的保存期内，每月测定Thio-NAD的含量。
利用中国专利CN201110298422.8中提供的检测方法测定Thio-NAD的含量，残留含量大于90％判定为稳定，否则判定为不稳定。结果列于表2。
表2
测试例2
测试例2用于说明实施例1和对比例1-2中制备获得的Thio-NAD试剂在总胆汁酸测定时的稳定性。
1)试剂配制：
试剂A为实施例1和对比例1-2中制备获得的Thio-NAD试剂1、22、23。试剂B的成分如表3所示。
表3
成份 用量
pH8.5N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)缓冲液 0.2M
NADH 6g/L
3α-HSD 12KU/L
巯基乙醇 5g/L
牛血清白蛋白 2g/L
TWEEN20 1％
防腐剂NaN3 2mM
2)检测方法
采用具有双试剂功能的自动生化分析仪(光径1cm、测试温度37℃、主波长405nm、副波长660nm)，按照样本：试剂A：试剂B＝3μL：210μL：70μL的方式加样，加入试剂B1分钟后，读取2～4分钟的吸光度值，测定质控品。
3)测试时间和稳定性评价方式
试剂8℃开盖使用状态下,30天之内，每天测定质控品；计算每次测定结果与初期测定结果的相对偏差，相对偏差小于±15％判定为稳定。试剂8℃度密闭避光存储过程中，在15个月的保存期内，每月测定；计算每次测定结果与初期测定结果的相对偏差，相对偏差小于±15％判定为稳定。
4)测定结果列于表4
表4
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种硫代氧化型辅酶Ⅰ试剂，其特征在于，所述试剂的组成成分包括：
Thio-NAD、缓冲液、表面活性剂和稳定剂；所述缓冲液选自由磷酸盐缓冲液、焦磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸缓冲液、2-N-吗啡乙磺酸缓冲液、咪唑缓冲液所组成的组中的一种；所述表面活性剂选自由聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇对异辛基苯基醚、聚乙二醇单月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烃基乙二醇醚和烷基聚乙烯乙二醇醚中所组成的组中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述稳定剂选自由NaCl、KCl、MgCl2、EDTA.2Na或EDTA.2K所组成的组中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于，在所述试剂中，Thio-NAD的浓度为0.01-10mmol/L、缓冲液的终浓度为5-500mmol/L、表面活性剂的浓度按质量体积百分含量计为0.05-20％、稳定剂的浓度为0.1-20g/L。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，在所述试剂中，Thio-NAD的浓度为0.5-5mmol/L、缓冲液的终浓度为10-100mmol/L、表面活性剂的浓度按质量体积百分含量计为2-10％、稳定剂的浓度为1-10g/L。
5.根据权利要求1、2和4中任意一项所述的试剂，其特征在于，所述试剂的pH为3.0-5.5。
6.根据权利要求1、2和4中任意一项所述的试剂，其特征在于，缓冲液为甘氨酸缓冲液和2-N-吗啡乙磺酸中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚和聚乙二醇对异辛基苯基醚中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述稳定剂为MgCl2和EDTA.2Na中的至少一种。
9.权利要求1-8中任意一项所述的试剂的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括制备总胆汁酸测定试剂、酶循环法高敏肌醇测定试剂、酶循环法高敏左旋肉碱测定试剂、酶循环法磷酸测定试剂、酶循环法脱氢酶测定试剂。
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