CN108196075A - 一种阿朴色氨酸酶法检测血钾离子的检测试剂及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及血丙酮酸检测技术领域，特别涉及一种经过优化后灵敏度高的丙酮酸检测试剂，试剂1中包含缓冲液、EDTA.Na2、氯化钠、保护剂、色氨酸、LDH、NADH、表面活性剂、防腐剂，试剂2中包含缓冲液、EDTA.Na2、氯化钠、保护剂、工具酶阿朴色氨酸酶、防腐剂，试剂3校准品中含有氯化钾 、氯化钠、曲拉通‑100、防腐剂等主要成分，本发明针对于不同的干扰物质，特异性的选择对应的去干扰成分，从而保证产品的准确性和特异性，并且所选择的物质多为常见的化学物质，具有稳定、成本低的优点。

Description

一种阿朴色氨酸酶法检测血钾离子的检测试剂及检测方法

技术领域

本发明涉及一种阿朴色氨酸酶法检测血钾离子的新方法，属于临床体外检测技术领域。

背景技术

血钾是维持细胞生理活动的主要阳离子，在保持机体的正常渗透压及酸碱平衡、参与糖及蛋白代谢、保证神经肌肉的正常功能等方面具有重要作用。目前检测血清钾离子的方法主要有火焰光度法、离子交换电极法、丙酮酸激酶法、色氨酸酶法等方法，其中前两者由于需要特殊的仪器设备，价格昂贵，可用于参考比对方法，但临床推广比较难，后两者可以结合全自动生化分仪，非常利于临床推广，目前临床生化检测中应用较多的主要为丙酮酸激酶法，但是本方法需要特殊的穴合剂，几乎全靠进口，价格昂贵，并且丙酮酸激酶稳定性控制并不是很理想，因而阻碍了该方法产品质量的提高和发展。后来Kimura等人提出的一种新的检测钾离子的方法，即色氨酸酶法，该方法是利用色氨酸酶能够被钾离子特异性的激活，来检测血液中的钾离子的含量，首先利用a-酮戊二酸、还原型辅酶II在GLDH的催化作用下，去除内源性的铵根离子，然后利用样本中的钾离子激活色氨酸酶，催化色氨酸和5-磷酸吡哆醛反应生成吲哚、丙酮酸以及铵根离子，紧接着铵根离子与酮戊二酸、还原型辅酶II，被GLDH催化反应，在340nm波长下监测还原性辅酶II的消耗速率，钾离子的浓度与反应中还原性辅酶II的消耗速率成正比，从而计算钾离子的浓度。该方法相对丙酮酸激酶法检测钾离子具有更好的特异性和稳定性，但是由于国内色氨酸酶的缺乏，以及自身成本不占优势等问题，目前国内应用推广较少。为使本方法更好的应用，本发明在此基础上探索出了一种以阿朴色氨酸酶为工具酶检测血液中钾离子浓度的新方法，通过对酶法检测血液中钾离子的方法进行改进和优化，以实现阿朴色氨酸酶法检测血液钾离子在临床中的推广和应用。通过探索建立起的新方案与丙酮酸激酶法检测血清中钾离子的浓度方法具有非常好的相关性，其性能和可操作性有了非常大的改进，可以在临床中广泛的推广和应用。

发明内容

本发明涉及一种阿朴色氨酸酶法检测血钾离子的新方法。

检测原理：

首先利用丙酮酸、NADH在LDH的催化作用下，去除样本中内源性的丙酮酸，然后利用样本中的钾离子同样会特异性激活阿朴色氨酸酶的特性，催化色氨酸和5-磷酸吡哆醛反应生成吲哚、丙酮酸以及铵根离子，生成的丙酮酸在LDH的催化下与NADH反应，生成乳酸盐和NAD+，在340nm波长下监测NADH的消耗速率，钾离子的浓度与反应中NADH的消耗速率成正比，从而计算钾离子的浓度，

一种阿朴色氨酸酶法检测血钾离子的新方法组成成分如下：

本发明是通过方法来实现的：

一种阿朴色氨酸酶法检测血钾离子的检测试剂，其特征在于包括以下组分：

试剂1：

缓冲液 135mmol/L,

EDTA.Na2 10mmol/L-20mmol/L，

氯化钠 10mmol/L-20mmol/L，

保护剂 1g/L-2g/L，

色氨酸 18.6mmol/L-22.5 mmol/L，

LDH 2KU/L-5 KU/L,

NADH 0.43mmol/L-0.52 mmol/L,

表面活性剂 1ml/L -2ml/L，

防腐剂 0.2g/L-0.5g/L；

试剂2:

缓冲液 200mmol/L,

EDTA.Na2 10mmol/L-20mmol/L，

氯化钠 10mmol/L-20mmol/L，

保护剂 1g/L-2g/L，

工具酶 220U/L-450U/L，

防腐剂 0.2g/L-0.5g/L；

所述的工具酶为阿朴色氨酸酶。

上述的检测试剂，优选的，还包括以下组分，

试剂3：

校准品：

含有：

氯化钾 3.7mmol/L-4.2mmol/L,

氯化钠 120mmol/L-135mmol/L，

曲拉通-100 3ml/L -5ml/L，

防腐剂 0.2g/L-0.5g/L。

上述的检测试剂，优选的：试剂R1、R2中加入缓冲液为TRIS-HCL 缓冲液。试剂R1中缓冲液为25℃，PH=9.1的浓度为135mmol/L的TRIS-HCL 缓冲液；试剂R2中缓冲液为25℃，PH=7.4的浓度为200mmol/L的TRIS-HCL 缓冲液；

上述的检测试剂，优选的：所述防腐剂为MIT.HCL(罗氏)，所述试剂R1表面活性剂为月桂二甲基氧化胺(上海花王)，试剂R2所述表面活性剂聚氧乙烯十二烷基醚(上海花王)。

上述的检测试剂，优选的：试剂R1所述保护剂为牛血清白蛋白；试剂R2所述保护剂为PEG5000。

本发明还公开一种阿朴色氨酸酶法检测血钾离子的检测方法，其特征在于采用以下步骤：

首先，取7μL检测样本加入300μL试剂R1，混合，置37℃预孵育5分钟，采用全自动分析仪，利用速率法进行测定，记录吸光度A1；

其次，再加入100μL试剂R2，混匀，在主波长340nm，副波长546nm波长下，反应5分钟后，采用全自动分析仪，利用速率法进行测定，记录A2；

第三，计算∆A，计算钾离子的浓度。

本发明的创新之处如下：

1）由于色氨酸酶非常难以获取，因此本发明采用易于获取的阿朴色氨酸酶作为关键工具酶，进行钾离子的检测；

2）为降低成本和引入更加稳定的反应体系，本发明使用乳酸脱氢酶（LDH）催化丙酮酸与NADH反应，取代原有的谷氨酸脱氢酶（GLDH）催化铵根离子与NADPH反应，新反应体系中所用的原材料无论在价格还是在稳定性方面都要优于原有方法；

3）本发明中在试剂R1和试剂R2优选月桂二甲基氧化胺(上海花王)和聚氧乙烯十二烷基醚（上海花王）增强钾离子在反应的抗干扰能力；

4）本发明中在试剂R1和试剂R2优选PEG5000和牛白作为保护剂，有利于增强酶的稳定性。

附图说明

图1：实施例2与实施例1丙酮酸激酶法检测钾的比较。

图2：实施例3与实施例1丙酮酸激酶法检测钾的比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施列1

本实施例描述的是一种丙酮酸激酶法检测血液钾离子的检测方法：

试剂1：

TRIS-HCL 170mmol/L

a-酮戊二酸 7.8mmol/L

GLDH 24KU/L

NADH 0.41mmol/L

磷酸烯醇式丙酮酸 2.9mmol/L

ADP 2.7mmol/L

乳酸脱氢酶 35KU/L

氯化锰 3.0mmol/L

氯化锂 20mmol/L

穴合剂K221 17.4mmol/L

试剂2

丙酮酸激酶 0.8KU/L

实施例2

本实施例描述的是一种阿朴色氨酸酶法检测血钾离子的新方法的配方：

试剂1：

缓冲液 135mmol/L

EDTA.Na2 10mmol/L

氯化钠 10mmol/L

保护剂 1g/

色氨酸 18.6mmol/L

LDH 2KU/L

NADH 0.43mmol/L

表面活性剂 1ml/L

防腐剂 0.2g/L

试剂2:

缓冲液 200mmol/L,

EDTA.Na2 10mmol/L

氯化钠 10mmol/L

保护剂 1g/L

工具酶 220U/L

防腐剂 0.2g/L

试剂3：

校准品：

含有：

氯化钾 3.7mmol/L

氯化钠 120mmol/L

表面活性剂 3ml/L

防腐剂 0.2g/L。

所述的工具酶为阿朴色氨酸酶；试剂R1中缓冲液为25℃，PH=9.1的浓度为135mmol/L的TRIS-HCL 缓冲液；试剂R2中缓冲液为25℃，PH=7.4的浓度为200mmol/L的TRIS-HCL 缓冲液；所述防腐剂为MIT.HCL(罗氏)，所述试剂R1表面活性剂为月桂二甲基氧化胺(上海花王)，试剂R2所述表面活性剂聚氧乙烯十二烷基醚(上海花王)；试剂R1所述保护剂为牛血清白蛋白；试剂R2所述保护剂为PEG5000。

实施例3

本实施例描述的是一种阿朴色氨酸酶法检测血钾离子的新方法的另外一个配方

试剂1：

缓冲液 135mmol/L

EDTA.Na2 20mmol/L

氯化钠 20mmol/L

保护剂 2g/L

色氨酸 22.5 mmol/L

LDH 5 KU/L

NADH 0.52 mmol/L

表面活性剂 2ml/L

防腐剂 0.5g/L

试剂2:

缓冲液 200mmol/L

EDTA.Na2 20mmol/L

氯化钠 20mmol/L

保护剂 2g/L

工具酶 450U/L

防腐剂 0.5g/L

试剂3：

校准品：

含有：

氯化钾 4.2mmol/L

氯化钠 135mmol/L

表面活性剂 5ml/L

防腐剂 0.5g/L。

所述的工具酶为阿朴色氨酸酶；试剂R1中缓冲液为25℃，PH=9.1的浓度为135mmol/L的TRIS-HCL 缓冲液；试剂R2中缓冲液为25℃，PH=7.4的浓度为200mmol/L的TRIS-HCL 缓冲液；所述防腐剂为MIT.HCL(罗氏)，所述试剂R1表面活性剂为月桂二甲基氧化胺(上海花王)，试剂R2所述表面活性剂聚氧乙烯十二烷基醚(上海花王)；试剂R1所述保护剂为牛血清白蛋白；试剂R2所述保护剂为PEG5000。

实施例4

1）本实施例描述的是将实施例2中的配方、实施例3的配方和实施例1中的丙酮酸激酶法进行同步检测，对比检测结果。

2）本实施例试剂的使用方法：

将施例2和实施3所描述的钾试剂检测方案，配制成液态试剂，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用速率法进行测定。将R1和R2按照3:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，

操作如表1，其对比检测的结果如表2

本实施例验证结果：通过表2中的实施例2中的配方、实施例3的配方和实施例1中丙酮酸激酶法检测血液钾离子的方法，进行40个临床样本的检测比对，发现结果相对偏差在10%以内，实施例2与和实施例3分别与丙酮酸激酶法检测血液钾离子的方法的相关系数分别为：R1=0.9974和R2=0.9978(附图1和附图2)具有非常好的相关性。

实施例5

本实施例描述的是将实施例2中的配方、实施例3的配方进行干扰性试验，验证试剂的抗干扰能力：

取新鲜混合血清，分成2等份，然后将每等份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表5的要求。然后分别用实施例2和实施例3中所得试剂测定血清或血浆中的钾的含量，对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表3。相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100%。

由图1和图2可以看出，实施例2和3试剂使用抗坏血酸≤5000μmol/L、甘油三酯≤22.6 mmol/L、血红蛋白≤2000mg/dL、胆红素≤684μmol/L、乳糜微粒≤7.5 mmol/L时对测试结果没有明显干扰，而现有的钾检测试剂则对于所提到的干扰物质则有不同程度的干扰，说明本发明的K检测试剂具有良好的抗干扰能力。

表1

实施例1和实施例2试剂检测方法

计算：K含量（mmol/L）＝（∆A测定÷∆A标准）×C标准。

表2

实施例2与和实施例3分别与实施例1丙酮酸激酶法的比较40个样本检测结果的比较

表3

实施例2和实施例3试剂抗干扰能力验证

Claims (6)

1.一种阿朴色氨酸酶法检测血钾离子的检测试剂，其特征在于包括以下组分：

试剂1：

缓冲液 135mmol/L,

EDTA.Na2 10mmol/L-20mmol/L，

氯化钠 10mmol/L-20mmol/L，

保护剂 1g/L-2g/L，

色氨酸 18.6mmol/L-22.5 mmol/L，

LDH 2KU/L-5 KU/L,

NADH 0.43mmol/L-0.52 mmol/L,

表面活性剂 1ml/L -2ml/L，

防腐剂 0.2g/L-0.5g/L；

试剂2:

缓冲液 200mmol/L,

EDTA.Na2 10mmol/L-20mmol/L，

氯化钠 10mmol/L-20mmol/L，

保护剂 1g/L-2g/L，

工具酶 220U/L-450U/L，

防腐剂 0.2g/L-0.5g/L；

所述的工具酶为阿朴色氨酸酶。

2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于还包括以下组分，

试剂3：

校准品：

含有：

氯化钾 3.7mmol/L-4.2mmol/L,

氯化钠 120mmol/L-135mmol/L，

曲拉通-100 3ml/L -5ml/L，

防腐剂 0.2g/L-0.5g/L。

3.根据权利要求1或2所述的检测试剂，其特征在于：试剂R1、R2中加入缓冲液为TRIS-HCL 缓冲液。

4.根据权利要求1或2所述的检测试剂，其特征在于：所述防腐剂为MIT.HCL，所述试剂R1表面活性剂为月桂二甲基氧化胺，试剂R2所述表面活性剂聚氧乙烯十二烷基醚。

5.根据权利要求1或2所述的检测试剂，其特征在于：试剂R1所述保护剂为牛血清白蛋白；试剂R2所述保护剂为PEG5000。

6.一种阿朴色氨酸酶法检测血钾离子的检测方法，其特征在于采用以下步骤：

首先，取7μL检测样本加入300μL试剂R1，混合，置37℃预孵育5分钟，采用全自动分析仪，利用速率法进行测定，记录吸光度A1；

其次，再加入100μL试剂R2，混匀，在主波长340nm，副波长546nm波长下，反应5分钟后，采用全自动分析仪，利用速率法进行测定，记录A2；

第三，计算∆A，计算钾离子的浓度。