CN101717814A - 测定血清、血浆中钾离子含量的液体双试剂诊断试剂盒 - Google Patents
测定血清、血浆中钾离子含量的液体双试剂诊断试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种测定血清、血浆中钾离子含量的液体双试剂诊断试剂盒。该试剂盒用K+依赖性丙酮酸激酶(PK)可催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化为丙酮酸的反应原理,再借助NADH以乳酸脱氢酶(LDH)为指示酶,在340nm处检测NADH的减少,每分钟吸光度(ΔA/min)的变化与K+含量成正比,从而建立酶偶联连续测定钾离子的方法。另外本发明在体系中加入能缓慢生成还原型烟酰辅酶所需的酶和底物系统,在试剂中形成酶-底物-辅酶的慢反应系统,使得辅酶能缓慢循环补充,当浓度达到一定平衡的时候,就可以使试剂达到稳定。这种液体双试剂的试剂盒使用方便、简洁,可以在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上快速检测,不需要特殊或者额外的仪器,其成本也低廉。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶法测定血清、血浆中钾离子含量的液体双试剂诊断试剂盒。
背景技术
人体内的钾是维持细胞生理活动的主要阳离子,是保持机体的正常渗透压及酸碱平衡,参与糖及蛋白质代谢,保证神经肌肉的正常功能所必需。钾离子大部分存在于细胞内,少量存在于细胞外液,且浓度较恒定。人体内的钾盐主要来源于食物。血清钾盐测定实为细胞外液钾离子测定,但体内的钾离子经常不断地在细胞内与体液之间相互交换,以保持动态平衡。因此血清钾浓度的高低,在一定程度上也可间接的反映细胞内钾离子的水平。正常情况下人体内血钾合理的参考值范围3.5mmol/L-5.1mmol/L。
血清钾升高:血清钾高于5.1mmol/L称为高钾血症。
(1)急性肾功能衰竭:由于肾功能严重受损、尿少或尿闭,体内的钾不能经肾排出体外,同时因肾组织细胞受破坏,致使细胞内的钾离子大量进入细胞外液,使血钾升高。
(2)严重溶血或组织损伤:此时红细胞或肌肉组织内的钾大量释放至细胞外液,使血清钾升高。
(3)急性酸中毒或组织缺氧:此时细胞内大量钾离子转移到细胞外液,使血清钾升高,如休克和循环衰竭等症。
(4)肾上腺皮质功能减退:肾排泄钾的功能主要由肾皮质激素调节,当肾上腺皮质功能减退时,肾上腺皮质激素分泌减少,使肾排钾能力降低,排钠增多,故血钾升高而血钠降低,即阿狄森氏病。
(5)食入或注射大量钾盐:食入或经静脉注入大量钾盐,超过肾排钾能力,尤其是肾排钾功能降低时更易发生高钾血症。
(6)其他:醛固酮缺乏或长期应用抗醛固酮利尿剂及家族性高血钾性周期性麻痹等,均可使血钾升高。
血清钾增高可引起严重的肌肉、心肌和呼吸功能的抑制性应激紊乱,以及特异的心电图改变。血清钾高于7mmol/L时,就有这些现象出现,超过10mmol/L时,即可发生心室纤颤,心脏停搏而导致死亡。
血清钾降低:
(1)钾的摄入量不足:长期低钾饮食、禁食或厌食等。
(2)钾的丢失增加:严重呕吐或腹泻、胃肠减压,大量应用排钾利尿剂及肾上腺皮质激素,肾上腺皮质功能亢进或醛固酮增多症;某些慢性消耗性疾病(如恶性肿瘤),由于细胞分解过多,大量钾从尿液排出,代谢性碱中毒时,肾排钾增多;大量出汗也可经皮肤丢钾,使血清钾降低;小儿中毒性消化不良、成人的吸收不良综合症、长期胃肠引流术等等都可产生低钾血症。
(3)肾脏疾病:在急性肾功能衰竭由少尿期转入多尿期时,由尿中丢失大量电解质而得低钾症。
(4)钾在体内分布异常:有时体内并非真正缺钾,只是分布异常而使血清钾降低。常见于:①心力衰竭、肾性水肿或大量输入无钾盐液体,细胞外液被稀释,血清钾降低;②大量应用胰岛素促使葡萄糖被利用或形成糖原时,细胞外钾大量移入细胞内以保持细胞内、外的相对平衡,结果使血清钾降低;③急性碱中毒时细胞外液的钾急剧转入细胞内,引起低钾血症;④家族性周期性麻痹患者,发作时细胞外钾可转入细胞内,发生低钾血症。
近年来,随着科学技术的发展,检测手段不断提高。离子选择性电板在临床上的广泛应用,使钾离子的测定向着快速、简便、准确、特异性的方向发展。临床上检测钾离子基本上分为比浊、火焰光度分析、离子选择性电板及酶法。
1.四苯硼钠比浊法
血清中钾离子与四苯硼钠作用,生成不溶性的四苯硼钾,产生的浊度在一定范围内与钾离子的浓度成正比。根据浊度可测得血清钾的含量。此法简单.不需特殊仪器,适合于基层使用。但影响因素较多,准确性不够好,现临床上已基本淘汰此法。
2.火焰光度分析法
火焰光度分析法是一种发射光谱分析,样品中的钾原子被火焰的热能激发处于激发态.激发态的原子不稳定,迅速回到基态,放出能量。发射出元素特有的波长辐射谱线。利用此原理进行光谱分析。血清等标本用去离子水适当稀释后由压缩空气喷成气雾,再与可燃气体混合,点燃成火焰,钾的火焰呈深红色,波长为767nm,用相应波长的滤光片将谱线分离,然后通过光电管或光电池转换成电讯号,经激光放大器放大后进行测量。样品溶液中钾离子的浓度越大,所发射的光谱也愈强:用已知量的标准液与待测标本液对比计算出标本中钾离子的浓度。用此法测定结果较正确可靠。但有缺点:需要气源、火源,安全性差;开机时需反复校准稳定,对急诊标本的个别检测不太方便;测定中需要特定的去离子水或锂溶液,试验麻烦且试剂保存困难;不稳定的压缩空气可直接影响火焰光度计工作的稳定性;标本中的蛋白质、脂质能改变样品溶液的粘度,影响样品的喷雾速度,使火焰的发射光强度发生变化,导致测定结果的误差。现临床上较少应用。
3.离子选择性电极法
离子选择性电极分析法是以测定电池的电动势为基础的定量分析方法。离子选择性电极是一种化学传感器,它能将溶液中某种特定离子的活度转变成电位信号,然后通过仪器来测量样品中被测离子接触电极时,在电极膜基质的含水层内发生离子迁移,迁移离子的电荷改变存在着电势,因而使膜面间的电位发生变化,在测量电极与参比电极间产生一个电位差。电极电位随溶液中离子活度变化的关系可用Nernst方程式表示:
从Nernst公式中可以看出,在一定的实验条件下,离子选择性电极的电极电位(E)与溶液中被测离子活度(或浓度)的对数成线性关系。由此可求得标本中离子的活度或浓度。理想的情况是,每个电极都具有单离子选择性,使电极只对一种离子有反应。实际情况却不是这样的,所有的离子选择电极都存在有干扰离子。况且,尽管能对离子特异性电极进行校正,但通常特异性仍不是绝对的,所以用电极法测得的结果也不是十分准确的。同时,测定成本也比较高,尤其是辅助材料和仪器比较昂贵。
4.酶法
近几年出现的血清钾离子的酶法测定方法。该测定方法的理论基础是血离子都有激活酶的作用。利用K+依赖性丙酮酸激酶(PK)可催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化为丙酮酸的反应原理,再借助NADH以乳酸脱氢酶(LDH)为指示酶,在340nm处监测NADH的减少,每分钟吸光度(ΔA/min)的变化与K+含量成正比,从而建立酶偶联连续测定钾离子的方法。酶法测定不仅准确而且更为方便,可以与其他的常规项目一起使用全自动分析仪进行检测,摆脱了原来的电极法的仪器,同时也降低了检测成本。
由于现有酶法试剂都为干粉试剂使用不便,复融后稳定性差。给临床使用造成一定的影响,同时复融后的稳定期多为一周或更短,在样本检测的准确性上带来一定的为误差,因此业界需要一种使用方便、简洁,可以在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上快速检测,不需要特殊或者额外的仪器,且成本低廉的酶法检测钾离子试剂盒。
发明内容
目前市场上存在的检测钾离子的试剂盒均为干粉的试剂盒。本发明则提供了一种为液体试剂的试剂盒。
在设计本发明时需要考虑的几个问题是:
1)根据选择的底物选定钾离子测定的最适反应条件,如缓冲液的浓度,离子强度和pH等等;
2)还原型辅酶的最适稳定pH及辅酶再生循环系统的慢反应pH;
3)丙酮酸激酶的最适稳定及最适反应的条件,如缓冲液的浓度,离子强度和pH等。
4)乳酸脱氢酶的最适稳定及最适反应的条件,如缓冲液的浓度,离子强度和pH等。
5)样本中氨干扰的去除;
6)整个体系的稳定性问题;
7)兼顾上述所有条件下的反应速率问题。
在此基础上,本发明提供了一种用于检测血清、血浆中钾离子的液体双试剂的试剂盒。在本发明的一个具体实施方案中,所述试剂盒主要采取以下的方法及步骤:
首先,将需要测定的样品与含有烯醇式丙酮酸(PEP)、腺苷二磷酸(ADP)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)、还原型辅酶及再生酶循环系统的各种物质混匀,使之发生以下反应,
由于血清中的氨对检测钾离子的浓度会产生干扰,体系中加入除氨系统消除氨的干扰,反应如下:
然后,将反应后的混合物在全自动生化分析仪上,检测340nm处吸光度的下降速度,从而测算出钾离子浓度的大小。
测定过程中,被测样品与试剂的比例按体积控制在1∶10-1∶100,反应温度控制在20℃-50℃,反应时间控制在1-10分钟,检测时设定副波长在405nm以上。
本发明提供了一种可以简便快捷并可以快速检验血清、血浆中K离子含量的酶法液体双试剂诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂,能够利用紫外、可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪测定出血清、血浆中K离子含量,测定过程中不受血清中其他离子的干扰。稳定性强,测定速度快。准确度高,为临床及化学分析中推广酶法检测K离子含量提供了有力支撑。
本发明的试剂盒包括50-250mM,pH 6.0-11的缓冲液、5-30mM的烯醇式丙酮酸(PEP)、5-20mM的腺苷二磷酸(ADP)、0.1-1mM的还原型辅酶、0.2-5KU的丙酮酸激酶(PK)、1.0-100KU/L的乳酸脱氢酶(LDH),其还包括由再生系统酶、底物和辅酶组成的再生酶循环系统和酶的保护体系。该再生酶循环系统包括浓度为5-100mM的底物、10-1000U的系统酶。
特别地,本发明提供的试剂盒中所述的烯醇式丙酮酸选自单环烯醇式丙酮酸、三环烯醇式丙酮酸或者以上两种物质的盐类。所述的腺苷二磷酸为腺苷二磷酸或者腺苷二磷酸盐。所述的丙酮酸激酶可以选自不同生物来源,可以是来自兔肌组织或者由微生物提取。
本发明的试剂盒还包括一种在单试剂制备中的再生酶循环系统,通过在检测试剂中加入指示性辅酶的生成补充体系,利用反应的可逆性,由产物逆向生成原反应物,从而补充原反应物的量。该试剂盒通过在反应体系中偶联了一步再生酶循环系统,从而从技术上确保了单试剂中各组分在制备、储存和应用过程的稳定
本发明所述的再生酶循环系统的反应速率小于主反应的速率,不干扰主反应。本发明优选的再生酶循环系统包括葡萄糖脱氢酶-葡萄糖或其类似物系统、葡萄糖6磷酸脱氢酶-葡萄糖6磷酸或其类似物系统、甘油脱氢酶-甘油或其类似物系统、乳酸脱氢酶-丙酮酸或其类似物系统。
本发明优选的还原型辅酶是还原型烟酰辅酶或其类似物。更优选的还原型烟酰辅酶或其类似物是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH。优选地,所述的还原型辅酶NADH的吸光度在0.6-2.0之间,波长340nm,光径10mm。
配制本发明的试剂盒所选择的缓冲液的pH范围在6.0-11.0之间。所述的缓冲液可以是下列缓冲体系的任意一种:Tris-HCL缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸缓冲液、磷酸缓冲液等等。
本发明提供的试剂盒优选地还包括0.1-5g/L的螯合剂、0.1-3g/L的防腐剂、1-30%的稳定剂、0.1-5g/L的表面活性剂、0.1-5mM的反应加速剂。
上述提及的螯合剂可以是选自下述成分的一种:18-冠醚-6,15-冠醚-5,Kryptofix 221,Kryptofix 222。其使用目的主要在于螯合样本中的一价金属离子,减少一价金属离子对测量的干扰。其优选的浓度范围是:0.1-5.0g/L。
上述提及的稳定剂可以是选自下述成分的一种或多种:乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、硫基乙醇、甘露醇、山梨醇、乳糖、海藻糖、黄素腺嘌呤二核苷酸和黄素单核苷酸等。
上述提及的表面活性剂可以是选自下述成分的一种或多种:阳离子表面活性剂指:十六烷基三甲基溴化铵,十六烷基氯化吡啶等。阴离子表面活性剂是指:十二烷基磺酸钠,十二烷基苯磺酸钠,胆酸钠等。两性表面活性剂是指:Triton X系列,烷基、甜菜碱系列等。其优选的浓度范围是:0.1-5g/L。
上述提及的反应加速剂可以是选自下述成分的一种或多种:二价阳离子,如镁离子、锰离子、钙离子等。其优选浓度范围在:0.1-5mM。
上述提及反应的防腐剂可以是选自下述成分中的一种或多种:迭氮系列,如迭氮钠,迭氮锂、MIT、以及生物防腐剂PC系列,如PC-300。烷基糖苷,分子量在500-5000范围内。其优选浓度范围在:0.1-5g/L。
根据本发明公开的方法,配制成的试剂盒主要成分如下,但是本领域技术人员可以理解该试剂盒的成分并不限于下述成分,其可以包括与所述成分功能相同的其他等价试剂,也包括本领域技术人员所熟知的配制试剂盒所常用的其他成分或物质:
缓冲液 50-250mM(pH 6.0-11.0)
烯醇式丙酮酸 5-30mM
腺苷二磷酸 5-20mM
还原型辅酶 0.1-1mM
丙酮酸激酶 0.2-5KU
乳酸脱氢酶 1-100KU
谷氨酸脱氢酶 0.1-20KU
α-酮戊二酸 1-50mM
D-葡萄糖 5-100mM
葡萄糖脱氢酶 10-1000U
稳定剂 1-30%
防腐剂 0.1-3g/L
螯合剂 0.1-5g/L
表面活性剂 0.1-5g/L
反应加速剂 0.1-5mM
本发明的有益效果主要表现在:1)该方法所配制试剂为液体双试剂,所以使用方便,操作简单;2)该试剂可在全自动生化分析仪上快速检测,也可在半自动或者手动仪器上使用,所以便于推广应用;3)参与偶联反应的成分都是外加的,不会引入额外的内外源物质的污染;4)本发明偶联的再生酶循环系统速率要小于主反应的速率,不干扰主反应;5)本发明配制的液体双试剂盒,稳定性好,可以长时间使用,37℃稳定性实验证明一年半后空白吸光度A0≥1.5,试剂开盖放置1个月测值稳定,试剂冻存后稳定性良好。
本发明技术方案的突出的特点和显著进步主要表现在:
(1)本发明完全采用再生循环酶法,提高了试剂稳定性。
(2)本发明采用铵离子去除系统和表面活性剂,试剂检测不受铵离子和脂类影响。试剂的特异性高。检测准确。
(3)该方法操作简单,可快速得到检测结果。
(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测,不需要特殊或额外仪器,测试成本低廉,便于行业内推广应用。
(5)本法提供了液体钾离子诊断试剂盒,试剂稳定性好。试剂中各酶的活性保存完好,很好的保证了应用该试剂的检测效果。同时配制为液体双试剂可以有效降低干扰的同时,降低试剂各组分之间的交叉影响,使检测结果更加可信,试剂更加稳定。
以下将结合实施例对本发明进行详细说明,其中实施例仅仅是说明而非限定的作用,本领域技术人员完全可以在以下披露的具体实施例的技术上作出改进,但是不超过本发明权利要求的范围或者本发明精神之内所作出的改进都会落入本发明的保护范围。
附图说明
图1显示了实施例1的试剂盒的开盖稳定性试验结果。
图2显示了国内某厂家干粉酶法试剂盒的开盖稳定性试验结果。
图3显示了实施例2的试剂盒于4-8℃保存试剂线性曲线。
图4显示了实施例2试剂盒于37℃加速稳定性试验5天后的线性曲线。
图5显示了使用实施例2的试剂盒检测样品的血清中钾离子的含量与离子选择电极检测的相关性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例,不应理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例1
按以下成分和用量配制钾离子诊断试剂盒
试剂1
Tris缓冲液 100mM
烯醇式丙酮酸 5mM
腺苷二磷酸 5mM
氯化镁 5mM
Kryptofix 221 3.0g/L
NADH 0.5mM
葡萄糖 5mM
葡萄糖脱氢酶 10U/L
MIT 0.5g/L
试剂2
Tris缓冲液 10mM
乳酸脱氢酶 50KU/L
丙酮酸激酶 2KU/L
MIT 0.5g/L
PEG 6000 1.0g/L
在全自动生化分析仪(奥林巴斯-400)上设定:反应温度37℃、反应时间1.5分钟、测试主波长340nm、测试副波长410nm。被测钾离子样品与试剂比为:样品∶试剂1∶试剂2=5μl∶180μl∶60μl,反应为降反应。
先加入样品和试剂1,两者在全自动生化分析仪内部自动混匀,检测,记录在主副波长下的吸光度值。在3分钟后加入试剂2,两者在全自动生化分析仪内部自动混匀,1分钟后开始记录主副波长的吸光度下降情况。根据速率法或终点法,对照相应的标准曲线计算出样品中钾离子的含量。
该实施例配制试剂盒稳定性好,配制液体试剂进行37℃加速稳定性试验,37℃加速稳定性试验5天可模拟现实4-8℃保存1年。结果如表1所示:
表1
时间 | 空白吸光度 | 定标1吸光度变化(2.9mmol/l) | 定标2吸光度变化(5.8mmol/l) |
第一天 | 1.9325 | 0.0771 | 0.1502 |
37℃3天 | 1.7455 | 0.071 | 0.1368 |
37℃4天 | 1.6856 | 0.072 | 0.139 |
37℃5天 | 1.6387 | 0.0703 | 0.1352 |
第五天下降百分比 | -15.20% | -8.82% | -9.99% |
国外进口某知名厂家干粉酶法钾离子检测试剂,其复融试剂4-8℃保存的稳定性结果如表2所示:
表2
国内某厂家干粉酶法钾离子检测试剂,其复融试剂4-8℃保存的稳定性结果如表3所示:
表3
时间 | 新溶 | 复融后7天 | 偏差 |
空白吸光度 | 1.5 | 1.3579 | -9.4% |
定标吸光度12mmol/l | 0.0913 | 0.0835 | -8.5% |
定标吸光度26mmol/l | 0.1875 | 0.1705 | -9.1% |
以上数据明显表明本发明试剂稳定性比原有的市场上的试剂明显改善。
本实施例开盖稳定性试验结果
试剂定标后开盖放置试剂仓中,定期检测固定质控品。检测试剂在使用过程中的稳定性性能。本实施例开盖稳定性结果具体如表4和图1所示:
表4
国内某厂家干粉酶法钾离子检测试剂,其复融试剂定标后开盖放置试剂仓中,定期检测固定质控品。开盖稳定性结果具体如表5和图2所示:
表5
时间(天) | 质控品I 6.04(5.56-6.52) | 质控品II 3.98(3.66-4.30) |
1 | 6.46 | 3.79 |
2 | 6.14 | 3.58 |
4 | 5.57 | 3.34 |
6 | 5.37 | 3.20 |
通过以上数据明显显示,本发明的试剂盒在4℃开盖稳定性能指标表现卓越。试剂在临床使用过程中稳定性良好,对检测的数据的可信性提供有力支持。
本实施例在运输条件下的稳定性,具体实验结果见表6
表6
时间 | 空白吸光度 | 定标吸光度变化(2.9mmol/l) | 定标吸光度变化(5.8mmol/l) |
未经运输4℃保存 | 1.8971 | 0.0616 | 0.1233 |
北京往返上海试剂 | 1.8621 | 0.0626 | 0.1245 |
下降百分比 | -1.8% | 1.6% | 1.0% |
由此可见本发明试剂在运输颠簸和温度不恒定的条件下,稳定性能依然良好。
实施例2
在实施例1的基础上加入除氨系统和表面活性剂。试剂特异性增强。
具体配方如下:
试剂1
Tris缓冲液 200mM
烯醇式丙酮酸 5mM
腺苷二磷酸 5mM
氯化镁 5mM
谷氨酸脱氢酶 10KU/L
α-酮戊二酸 10Mm
Triton X 405 0.5g/L
Kryptofix 221 3.0g/L
NADH 0.5mM
葡萄糖 5mM
葡萄糖脱氢酶 10U/L
MIT 0.5g/L
试剂2
Tris缓冲液 10mM
乳酸脱氢酶 50KU/L
丙酮酸激酶 2KU/L
MIT 0.5g/L
PEG 6000 1.0g/L
甘油 100g/L
试剂盒的抗干扰实验
(1)分别按照本领域的常规技术配制含有抗坏血酸、胆红素、血红蛋白,甘油三酯不同浓度的待测样品,测定实施例2的试剂盒对各种干扰物的抗干扰能力(每个样品一式三份,取其平均值)。检测结果(平均值)如表7所示:
表7
(2)分别按照本领域的常规技术配制含有血液中的不同金属离子,按照其线性最高浓度配制待测样品,测定实施例2的试剂盒对各种干扰物的抗干扰能力(每个样品一式三份,取其平均值)。检测结果(平均值)检测结果(平均值)如表8所示:
表8
(3)分别按照本领域的常规技术血浆处理办法配制样本,测定实施例2的试剂盒对各种干扰物的抗干扰能力(每个样品一式三份,取其平均值)。检测结果(平均值)如表9所示:
表9
干扰物质 | 1 | 2 | 3 | 均值 | 偏差 |
对照 | 3.71 | 3.70 | 3.72 | 3.71 | |
60U/ml肝素钠 | 3.80 | 3.81 | 3.80 | 3.81 | 2.6% |
根据以上数据可以看出,本发明试剂盒抗干扰能力优越,试剂检测样本的准确性高。
实施例3本发明试剂盒的准确性和精密度
分别采用本领域常规的检测方法,对实施例2制备的试剂盒的准确性和精密度进行检测。
1.准确性
对靶值为3.98(3.66-4.30)的质控液I和靶值为6.04(5.56-6.52)的质控液II在相同条件下,采用试剂盒对同一质控液的钾离子浓度连续检测20次,将检测结果的平均值与靶值范围进行比较,以检测所述的试剂盒的准确性。对试剂盒准确性的检测结果如表10所示:
2.精密度
在相同条件下,采用试剂盒对两份质控液的钾离子含量连续检测20次,比较每个试剂盒的变异系数,以检测所述的试剂盒的精密度。对试剂盒的精密度的检测结果如表10所示。
表10
表10的结果表明:试剂盒20次检测结果的平均值在靶值范围内,不准确度相对偏差(CV(%))不超过±5%。说明本发明的试剂盒的准确度符合诊断试剂盒的技术指标。
表10的结果表明:试剂盒检测的同一样品的钾离子浓度的变异系数不超过±10%,说明本发明的试剂盒的精密度符合诊断试剂盒的技术指标。
实施例4:试剂盒的灵敏度检测
采用本领域技术人员已知的方法,对实施例2制备的试剂盒的灵敏度进行检测。将空白液和同一份用生理盐水进行等比稀释5个梯度的样品,在检测仪器上采用试剂盒连续对吸光度测定20次,读取每次测定原始吸光度值,然后计算出扣除空白吸光度后的各样品的吸光度的值,计算其均值,标准偏差。这里采用99.7%的可能性来计算检测低限。将每个样本的均值减去3倍的各自的标准偏差,然后与空白液的3倍的标准偏差比较,如果前者高于后者,我们就认定有99.7%的可能性出现的最小吸光度一定大于空白的吸光度,能定量的报告结果。
1)试剂盒的测值的原始数据(如表11)
表11
2)试剂盒测值的原始吸光度的数据(如表12)
表12
3)扣除空白后的吸光度数据(表13)
表13
根据以上数据:
检测低限:0.36*0.00179/0.01067=0.06mmol/l
生物检测限:0.36mmol/l
功能灵敏度=0.36mmol/l
实施例5试剂盒的线性范围
采用本领域技术人员已知的方法,对实施例2制备的试剂盒的线性范围检测。将高值标本进行等比稀释10个浓度的样品,在检测仪器上采用试剂盒连续测定3次,计算其均值。将检测出的样品的测量值与稀释比例进行相关对比。求出节距为零的回归方程。通过回归方程求出每个样本的理论值。根据计算出的理论值和检测均值之间求出该浓度时检测的线性偏差。要求回归方程的回归系数R2>0.99,各浓度的线性偏差均小于10%。
实施例2试剂盒,4-8℃保存试剂线性范围数据(如表14和图3)
表14
实施例2试剂盒的于37℃加速稳定性试验5天后的数据(如表15和图4)。
表15
稀释比例 | 1 | 2 | 3 | 测量均值 | 理论值 | 线性偏差 |
1 | 9.95 | 10.1 | 9.98 | 10.010 | 9.949 | 0.61% |
0.9 | 9.11 | 8.86 | 8.83 | 8.933 | 8.954 | -0.24% |
0.8 | 8.19 | 7.97 | 7.84 | 8.000 | 7.960 | 0.51% |
0.7 | 7.06 | 7.08 | 6.89 | 7.010 | 6.965 | 0.65% |
0.6 | 5.98 | 5.78 | 5.82 | 5.860 | 5.970 | -1.84% |
0.5 | 4.8 | 4.98 | 4.89 | 4.890 | 4.975 | -1.70% |
0.4 | 4.11 | 4.02 | 4.01 | 4.047 | 3.980 | 1.68% |
0.3 | 3.07 | 3.1 | 2.98 | 3.050 | 2.985 | 2.18% |
0.2 | 1.92 | 1.87 | 1.67 | 1.820 | 1.990 | -8.54% |
0.1 | 0.86 | 0.88 | 0.94 | 0.893 | 1.0 | -9.21% |
0 | -0.11 | -0.06 | -0.07 | -0.08 | 0 |
根据以上数据,本发明试剂盒在1-10mmol/l的范围内检测呈线性分布。
实施例6:与现在常规医院检验钾离子含量的电极法进行相关实验。
从医院收取已经经过电极法检测的病人样本,在Olympus 400上,用实施例2的试剂盒按照常规方法检测样品的血清中钾离子的含量,其结果如表16和图5所示:
表16
表16的结果说明用本发明公开的试剂盒对已临床样品的血清、血浆钾离子浓度检测结果与临床常用方法相符,说明本发明的试剂盒可以适用于临床对血清、血浆钾离子浓度的检测。
总之,本本发明的试剂盒的有点在于,液体双剂盒,操作简单,使用方便,可以应用于全自动和半自动等各种生化分析仪器上;通过加入除氨系统加速反应消除内外源氨的干扰,偶联辅酶的循环再生系统,增强试剂的稳定性、准确性、抗干扰性,长时间存放之后仍可以准确测定样本中的钾离子浓度。
本领域技术人员可以理解,本发明公开的方法及由此生产的液体双试剂盒可以广泛应用于Hitachi、Olympus和Synchron各种全自动生化分析仪。各仪器的测定条件如下:温度37℃、反应时间1.5分钟、测试主波长340nm、副波长405nm、测定样本与试剂盒的比例是5∶180∶60,反映方向为负反应,延迟时间为1分钟,检测时间1.5分钟。根据现有技术和临床工作人员的经验,在不需要进行创造性劳动的前提下,本领域技术人员可以对各种检测仪器的最佳检测参数进行优化。对各种检测仪器的参数的优化落在本发明要求保护的范围之内。
Claims (20)
1.一种测定钾离子浓度的液体双试剂试剂盒,其包括50-250mM,pH 6.0-10的缓冲液、5-30mM的烯醇式丙酮酸、5-20mM的腺苷二磷酸、0.1-1mM的还原型辅酶、0.2-5KU的丙酮酸激酶、1.0-100KU/L的乳酸脱氢酶,其还包括由再生系统酶、底物组成的再生酶循环系统。
2.根据权利要求1的试剂盒,其中所述的再生酶循环系统包括浓度为5-100mM的底物、10-1000U的系统酶。
3.根据权利要求1或2的试剂盒,其特征在于所述烯醇式丙酮酸选自单环烯醇式丙酮酸,三环烯醇式丙酮酸或者以上两种物质的盐类。
4.根据权利要求1或2的试剂盒,其特征在于所述腺苷二磷酸选自腺苷二磷酸或者腺苷二磷酸盐。
5.根据权利要求1或2的试剂盒,其特征在于所述丙酮酸激酶来自兔肌组织或者从微生物中提取。
6.根据权利要求1或2的试剂盒,其特征在于所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、三乙醇氨缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、硼酸-硼酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸缓冲液或者磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求1或2的试剂盒,其特征在于所述的再生酶循环系统的反应速率小于主反应的速率,不干扰主反应。
8.根据权利要求1或2的试剂盒,其中所述的再生酶循环系统包括葡萄糖脱氢酶-葡萄糖或其类似物系统、葡萄糖6磷酸脱氢酶-葡萄糖6磷酸或其类似物系统、甘油脱氢酶-甘油或其类似物系统、乳酸脱氢酶-丙酮酸或其类似物系统。
9.根据权利要求1或2的试剂盒,其特征在于所述的还原型辅酶是还原型烟酰辅酶或其类似物。
10.根据权利要求9的试剂盒,其特征在于所述的还原型烟酰辅酶或其类似物是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH。
11.根据权利要求10的试剂盒,其特征在于所述的还原型辅酶NADH的吸光度在0.6-2.0之间,波长340nm,光径10mm。
12.根据权利要求1或2的试剂盒,其特征在于还包括由谷氨酸脱氢酶和α酮戊二酸组成的除氨系统。
13.根据权利要求1或2的试剂盒,其特征在于还包括0.1-5g/L的螯合剂、0.1-3g/L的防腐剂、1-30%的稳定剂、0.1-5g/L的表面活性剂、0.1-5mM的反应加速剂。
14.根据权利要求13的试剂盒,其特征在于所述螯合剂为18-冠醚-6,15-冠醚-5,Kryptofix 221,Kryptofix 222中的一种或几种。
15.根据权利要求13的试剂盒,其特征在于所述稳定剂为乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、硫基乙醇、甘露醇、山梨醇、乳糖、海藻糖、黄素腺嘌呤二核苷酸和黄素单核苷酸中的一种或几种。
16.根据权利要求13的试剂盒,其特征在于所述表面活性剂可以是选自下述成分的一种或多种:十六烷基三甲基溴化铵,十六烷基氯化吡啶,十二烷基磺酸钠,十二烷基苯磺酸钠,胆酸钠,Triton X系列,烷基、甜菜碱系列。
17.根据权利要求13的试剂盒,其特征在于所述反应加速剂选自下述成分的一种或多种:镁离子,锰离子,钙离子。
18.根据权利要求13的试剂盒,其特征在于所述防腐剂分子量在500-5000范围内,选自迭氮钠、迭氮锂、MIT、PC-300、烷基糖苷。
19.一种测定钾离子的液体双试剂试剂盒,其包括:
试剂1
Tris缓冲液 100mM
烯醇式丙酮酸 5mM
腺苷二磷酸 5mM
氯化镁 5mM
Kryptofix 221 3.0g/L
NADH 0.5mM
葡萄糖 5mM
葡萄糖脱氢酶 10U/L
MIT 0.5g/L
试剂2
Tris缓冲液 10mM
乳酸脱氢酶 50KU/L
丙酮酸激酶 2KU/L
MIT 0.5g/L
PEG 6000 1.0g/L
和使用说明书。
20.一种测定钾离子的液体双试剂试剂盒,其包括:
试剂1
Tris缓冲液 200mM
烯醇式丙酮酸 5mM
腺苷二磷酸 5mM
氯化镁 5mM
谷氨酸脱氢酶 10KU/L
α-酮戊二酸 10Mm
Triton X 405 0.5g/L
Kryptofix 221 3.0g/L
NADH 0.5mM
葡萄糖 5mM
葡萄糖脱氢酶 10U/L
MIT 0.5g/L
试剂2
Tris缓冲液 10mM
乳酸脱氢酶 50KU/L
丙酮酸激酶 2KU/L
MIT 0.5g/L
PEG 6000 1.0g/L
甘油 100g/L
和使用说明书。
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