CN109212176A - 一种丙酮酸测定试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种丙酮酸测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；试剂R1中含有以下成分：还原型辅酶Ⅰ（NADH）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、表面活性剂、EDTA‑Na2、防腐剂；试剂R2：三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、乳酸脱氢酶（LDH）、表面活性剂、稳定剂、防腐剂。本发明同时提供了该试剂盒的制备方法和应用，该试剂盒是一种稳定性强，准确度高，重复性好的液体试剂盒。

Description

一种丙酮酸测定试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生化试剂测定技术领域，特别涉及一种丙酮酸测定试剂盒，还涉及所述丙酮酸测定试剂盒制备方法和应用。

背景技术

丙酮酸(Pyruvic acid)又称2-氧代丙酸，是参与整个生物体基本代谢的中间产物之一，可通过乙酰辅酶A和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和三羧酸循环之间的转化，在三大营养物质的联系中起重要的枢纽作用。在正常情况下，人体可通过三羧酸循环氧化成CO2和水，使血内乳酸/丙酮酸比值维持在9左右。但当机体处于缺氧状态，丙酮酸则被还原成乳酸，该比值上升，缺氧越严重比值越高，该比值测定可推测循环衰竭的严重程度。轻微的活动会引起乳酸和丙酮酸同时升高，但比值不变。血中丙酮酸增高常见于糖尿病、心力衰竭、腹泻，严重肝损伤、急性感染等。丙酮酸脱氢酶催化丙酮酸氧化成二氧化碳和乙酰辅酶A，丙酮酸羧化酶促使二氧化碳与丙酮酸形成草酰乙酸盐，此两种酶中任何一种先天性缺乏，皆可使丙酮酸代谢受阻，血中丙酮酸及其衍生物(乳酸等)堆积，引起神经系统病变，如共济失调、动作幼稚、智力减退、痴呆以及乳酸性酸中毒。感染也可减少此两酶活性。丙酮酸代谢障碍可继发于维生素B缺乏、休克等，维生素B1的焦磷酸酯是丙酮酸在细胞内进一步氧化分解为乙酰辅酶A时的脱羧辅酶。维生素B1缺乏时，体内丙酮酸的氧化发生障碍，使丙酮酸的含量增加。糖尿病引起的酸中毒时可引起血中丙酮酸含量升高，因此丙酮酸的检测对于糖尿病的诊断具有非常重要的意义。

目前检测丙酮酸的方法有二硝基苯腙法、酶联免疫法、乳酸脱氢酶法，荧光分析法。二硝基苯肼比色法，是根据丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成有色的苯腙，但该法受到其它α-酮酸的干扰，特异性差，操作繁琐。酶联免疫法灵敏度高，特异性强，但干扰因素多，重复性不好，价格不菲；荧光分析法准确性和灵敏度高，但是试剂保存不方便，且为手工操作，耗时较长，价格不菲；乳酸脱氢酶法具有特异性高，操作简单快捷、准确安全、可自动化分析、成本较低的优点，但现有技术中国产试剂盒存在稳定性、重复性较差等缺点，本发明针对现有丙酮酸试剂盒的缺点进行改进以满足临床检测以及化学分析的要求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种丙酮酸测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种稳定性强，准确度高，重复性好的液体试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种丙酮酸测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；

试剂R1中含有以下成分：

试剂R2：

优选地，所述试剂R1的pH为8.0-10.0。

优选地，所述试剂R2的pH为6.0-8.0。

优选地，所述试剂R1中的表面活性剂选自曲拉通系列、吐温系列、brij-35和二月桂甘油硫酸酯中的一种或多种。

优选地，所述试剂R2中的表面活性剂选自曲拉通系列、吐温系列、brij-35和二月桂甘油硫酸酯中的一种或多种。

优选地，试剂R2中的稳定剂为牛血清白蛋白、葡甘露聚糖和聚乙二醇中的一种或几种。

优选地，所述试剂R1中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素和硫柳汞中的一种或多种。

优选地，所述试剂R2中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素和硫柳汞中的一种或多种。

优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为1～5:1，更优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。

上述所述的丙酮酸测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：试剂R1、R2均先加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液，用盐酸或氢氧化钠调节pH，试剂R1的pH值调节为8.0-10.0，试剂R2的pH调节为6.0-8.0，再按照比例添加其他物质溶解，制成丙酮酸测定试剂盒。

上述所述的丙酮酸测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中丙酮酸的浓度。

本发明试剂盒采用乳酸脱氢酶法，其反应原理为样本中的丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下与NADH反应生成乳酸和NAD⁺，通过测定NADH吸光度的变化，可以计算出血清中丙酮酸的含量，反应具有特异性，使用全自动生化仪进行检测，操作简单、自动化程度高，可减少人为误差，适合大多数临床实验室应用。

有益效果

1)本发明稳定的丙酮酸测定试剂盒为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用。

2)通过在试剂R2中加入牛血清白蛋白、葡甘露聚糖、聚乙二醇等组成复合稳定剂，各组分协同作用使试剂稳定性能优异，有效地增强了试剂盒的稳定性，有利于该试剂在市场中进一步的推广。

3)该试剂的准确度、重复性、线性范围等性能指标卓越，价格便宜，使用方便，有利于该试剂在市场中进一步推广。

附图说明

图1为实施例1和对比例1试剂的相关性曲线；

图2为对比例1和对比例6试剂的相关性曲线；

图3为实施例1线性的相关性曲线；

图4为实施例1和对比例1、2、3、4、5、6提供的丙酮酸测定试剂进行稳定性试验的浓度变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

本实实施例所述试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的迈瑞800全自动生化分析仪，利用终点法进行测定，检测主波长为340nm，操作如下：

加入生理盐水、样本或校准品20μl，再加入200μl的R1试剂，预孵育5min后读取吸光度

A1，之后再加入50μl的R2试剂，反应5min后读取吸光度A2，并计算ΔA。

ΔA＝A2-A1

丙酮酸含量(μmol/L)＝(ΔA测定÷ΔA标准)×C标准。

样本要求：

1.不溶血血清。

2.样本稳定性：标本2～8℃保存可稳定3天，-20℃保存可稳定2周。

实施例1

一种常规的丙酮酸测定试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2。

试剂R2：

本实施例所述试剂R1和试剂R2，配制时需先配制三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液，用盐酸或氢氧化钠调节pH，试剂R1的pH值调节为8.0-10.0，试剂R2的pH调节为6.0-8.0，再添加其它物质。

实施例2

试剂R2：

实施例3

试剂R2：

对比例1

市售的进口Sigma丙酮酸测定试剂盒。

对比例2

FDA认可的市场上常规应用的一种配方，用作理论对照。

三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液 100mmol/L；

还原型辅酶Ⅰ(NADH) 0.5mmol/L；

叠氮钠 1g/L；

试剂R2：

三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液 100mmol/L；

乳酸脱氢酶(LDH) 200U/L；

叠氮钠 1g/L。

对比例3

与实施例1中丙酮酸测定试剂盒的区别仅在于试剂2中的稳定剂不含BSA，其它与实施例1相同。

对比例4

与实施例1中丙酮酸测定试剂盒的区别仅在于试剂2中的稳定剂不含葡甘露聚糖，其它与实施例1相同。

对比例5

与实施例1中丙酮酸测定试剂盒的区别仅在于试剂2中的稳定剂不含聚乙二醇，其它与实施例1相同。

对比例6

专利CN106290212A所采用的的灵敏度高的丙酮酸检测试剂。

试剂R1：

试剂R2：

性能验证

试验一

进行相关性试验，试验方案为：实施例1、对比例1和对比例6，同时检测了40个临床血清样本，对两组检测结果进行相关性分析，计算相关系数r；以比对实施例1检测结果作为靶值，分别计算40对数据的相对偏差(Bias％)。要求r不小于0.990，相对偏差不超过±10％。

检测结果如表1所示，并获得了实施例1和对比例1试剂的相关性曲线(如图1所示)，对比例1和对比例6试剂的相关性曲线(如图2所示)。

表1相关性对比实验结果

表2对比例1分别与实施例1和对比例6的相关系数

由表1和图1的可以看出，实施例1和对比例1的试剂盒血清测试偏差最大值为2.89％，两种试剂的相关系数为0.9974，实施例1和对比例1的检测结果非常接近，因此本发明提供的实施例1检测试剂与的进口检测试剂相关性良好，完全可以替代进口试剂；由表 1和图2可以看出，对比例6和对比例1检验结果偏差较大，相关系数为0.9672，说明本发明试剂盒准确度优于对比例6。

试验三

重复性试验：用实施例1分别检测中值质控(靶值62.5±6μmol/L)和低值质控品(靶值30.4±6μmol/L)，对每份质控品进行20次检测，将共20次检测结果计算平均值、标准差和变异系数。结果见表3，由表3可以看出，实施例1检测数值接近靶值，标准偏差小，变异系数小，重复性较好。

表3质控检测结果

测试次数	中值质控	低值质控
			1	62.4	31.9
2	62.8	32.6
			3	61.6	33.1
4	62.8	31.7
			5	62.7	32.4
6	61.6	32.5
			7	62.1	31.9
8	61.6	33.4
			9	61.9	32.9
10	62.6	32.5
			11	62.9	32.4
12	61.6	32.6
			13	61.8	32.9
14	62.8	31.7
			15	61.5	33.3
16	61.7	33.2
			17	62.3	31.4
18	62.8	31.5
			19	62.7	32.7
20	62.1	31.7
			平均值(X)	62.215	32.415
标准偏差(S)	0.5173566	0.6243101
			变异系数	0.83％	1.92％

试验三

取丙酮酸钠高值样本为1000μmol/L，并进行稀释，配制6个不同浓度的样本，依次为1000μmol/L、800μmol/L、600μmol/L、400μmol/L、200μmol/L、0μmol/L浓度的样本，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。用实施例1的试剂进行检测。检测结果如表所示：

表4线性相关验证实验检测结果

理论浓度(μmol/L)	检测结果
		0	0.23
200	187.5
		400	403.8
600	588.3
		800	804.5
1000	998.9
		相关系数R	0.9996

由表4和图3可以看出，本发明实施例1随稀释浓度呈线性变化，线性相关系数达到0.9996，大于0.990，说明实施例1线性范围较广，能够符合临床病例样本的要求，对于临床检验有重要意义。

试验四

对实施例1和对比例1、2、3、4、5、6提供的丙酮酸测定试剂进行稳定性试验，试验方案为：对实施例1和对比例1、2、3、4、5提供的试剂，一起放入37℃水浴箱中，每天检测靶值为62.5±6μmol/L的质控品，并监测质控品测定值的变化。

表5试剂热稳定性验证结果

由表5和图4可以看出，与对比例1相似，本发明提供的实施例1试剂在37℃水浴条件下10天内基本无变化，稳定性较好；而对比例2、3、4、5、6试剂在37℃水浴条件下10 天内变化明显。实施例1的试剂盒稳定性优于对比实施例2、3、4、5、6试剂盒的稳定性，说明本发明聚乙二醇，牛血清白蛋白，葡甘露聚糖同时的加入，可以协同提高丙酮酸测定试剂盒的稳定性。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (10)

1.一种丙酮酸测定试剂盒，其特征在于，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；

试剂R1中含有以下成分：

NADH 0.35~0.5 mmol/L；

三羟甲基氨基甲烷缓冲液 10 ~100 mmol/L；

表面活性剂 1 ~10g/L；

EDTA-Na₂ 0.1~10mmol/L；

防腐剂 0.1 ~10g/L；

试剂R2：

三羟甲基氨基甲烷缓冲液 10 ~100 mmol/L；

乳酸脱氢酶 100~300 U/L；

表面活性剂 1 ~10g/L；

稳定剂 0.1~20g/L；

防腐剂 0.1~10g/L。

2.根据权利要求1所述的丙酮酸测定试剂盒，其特征在于，所述试剂 R1 的pH 为 8.0-10.0。

3.根据权利要求1所述的丙酮酸测定试剂盒，其特征在于，所述试剂 R2 的pH为6.0-8.0。

4.根据权利要求1所述的丙酮酸测定试剂盒，其特征在于，所述试剂 R1 中的表面活性剂选自曲拉通系列、吐温系列、brij-35和二月桂甘油硫酸酯中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的丙酮酸测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的表面活性剂选自曲拉通系列、吐温系列、brij-35和二月桂甘油硫酸酯中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的丙酮酸测定试剂盒，其特征在于，试剂 R2 中的稳定剂为牛血清白蛋白、葡甘露聚糖和聚乙二醇中一种或几种。

7.根据权利要求1所述的丙酮酸测定试剂盒，其特征在于，所述试剂 R1中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素和硫柳汞中的一种或多种，所述试剂R2中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素和硫柳汞中的一种或多种。

8.根据权利要求1所述的丙酮酸测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1与试剂R2的体积比为 1~5:1，优选所述试剂R1与试剂R2的体积比为 4:1。

9.一种权利要求1-8之一所述的丙酮酸测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：试剂R1、R2均先加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液，用盐酸或氢氧化钠调节pH，试剂R1的pH值调节为8.0-10.0，试剂R2的pH调节为6.0-8.0，再按照比例添加其他物质溶解，制成丙酮酸测定试剂盒。

10.一种权利要求1-8之一所述的丙酮酸测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中丙酮酸的浓度。