CN113718015B - 一种体外酶法钾测定试剂盒的制备方法 - Google Patents
一种体外酶法钾测定试剂盒的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113718015B CN113718015B CN202110992608.7A CN202110992608A CN113718015B CN 113718015 B CN113718015 B CN 113718015B CN 202110992608 A CN202110992608 A CN 202110992608A CN 113718015 B CN113718015 B CN 113718015B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- concentration
- reagent
- preparation
- dialysis
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 26
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 26
- 239000011591 potassium Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 36
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 9
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 46
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 24
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 17
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 16
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 16
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 claims description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 13
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 10
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 claims description 9
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 9
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 9
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 8
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 claims description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 6
- NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 3-(n-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCOCC1 NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N HEPPS Chemical compound OCCN1CCN(CCCS(O)(=O)=O)CC1 OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 claims description 4
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 101000833181 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) Glycerol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 claims 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 18
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 18
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 14
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 14
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 13
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 13
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 7
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 6
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical group C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 2H-pyran Chemical group C1OC=CC=C1 MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical group C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical group C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000005048 flame photometry Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002682 Hyperkalemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000019025 Hypokalemia Diseases 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 1
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000002977 intracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000008558 metabolic pathway by substance Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 1
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 208000024896 potassium deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种体外酶法钾测定试剂盒的制备方法,属于医学体外诊断领域。本发明的体外酶法钾测定试剂盒的制备方法包括以下步骤:步骤1、采用透析工艺纯化酶原材料;步骤2、采用透析纯化后的酶制备试剂盒。本发明利用透析工艺将酶原材料纯化,制备一种稳定性好的钾测定试剂盒,该试剂盒制备过程简单、空白反应低、线性范围广,适用于体外测定血清及血浆样本中钾的含量。
Description
技术领域
本发明属于医学体外诊断领域,具体涉及一种利用透析工艺纯化原材料的稳定的体外酶法钾测定试剂盒的制备方法。
背景技术
钾(Potassium,K)是细胞内液的主要阳离子,在参与蛋白质和糖的代谢、维持心肌和神经肌肉正常的应激性、维持酸碱平衡等方面起重要作用。高钾血症和低钾血症如得不到及时发现和纠正,均可引起全身各器官系统特别是心血管系统、神经系统的生理功能和机体的物质代谢发生相应的障碍,甚至有导致死亡的可能。
目前已用于检验血液或体液样本中钾含量的方法有火焰光度法、离子选择电极法(ISE)、酶法等。火焰光度法是钾离子测定的参考方法,其缺点是对高脂血症血清易出现假性低钾现象,必要时需参照膜电极法的结果。离子选择电极法虽为流行方法,准确性和精密度均好,没有污染,但专用仪器部件寿命有限,电极部分故障率高,需定期更换。而酶法检测血钾浓度速度快、特异性高,操作简单,适于广泛推广。酶动力学方法测定钾浓度的主要原理为,通过钾依赖性的丙酮酸激酶催化底物磷酸烯醇式丙酮酸,其产物丙酮酸盐在乳酸脱氢酶作用下与NADH反应生成NAD+,其在340nm的吸光值下降与钾浓度成比例:
1989年,Berry团队利用K+依赖性的丙酮酸激酶(PK)催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的反应原理,成功建立了酶动力学测定血钾的方法。由于试剂所用原材料在制备过程中或多或少的都会有K+、Na+、NH4 +的残留,而这些离子对PK均有一定的激活作用,造成空白反应过大,影响试剂稳定性、线性范围。所以,必须控制试剂的空白反应度。Berry等人采用离子交换法将原材料的阳离子全部交换成为Li+。但是离子交换法纯化速度慢、成本高,仅适用于实验室操作,并不适合工业生产。
酶动力学测定血钾的原材料中小分子原材料均可在市场上采购到超纯品,从根本上避免了空白反应度。但是,原材料中的大分子酶在制备、提取过程中无法避免地有K+、Na+、NH4 +的残留,从而影响试剂性能。因此,急需一种可以有效纯化酶原材料、适合工业生产的稳定的钾测定试剂盒的制备方法。
发明内容
鉴于以上问题,本发明的目的是利用透析工艺将酶原材料纯化,制备一种稳定性好的钾测定试剂盒,进而提供了一种体外酶法钾测定试剂盒的制备方法。该试剂盒制备过程简单、空白反应低、线性范围广,适用于体外测定血清及血浆样本中钾的含量。
为了解决上述技术问题,本发明的技术方案具体如下:
本发明提供一种体外酶法钾测定试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
步骤1、采用透析工艺纯化酶原材料
1.1、透析袋的预处理
(1)根据透析酶液的量将透析袋剪成适合的长度;
(2)透析袋在含碳酸氢钠2%、EDTA 1mmol/L的溶液中煮沸10min;
(3)透析袋冲洗后于1mmol/L的EDTA溶液中煮沸10min;
(4)冷却后置于75%乙醇中,2-8℃保存;
1.2、透析过程
(1)分别配制浓度为1-20mg/mL的谷氨酸脱氢酶(GLDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙酮酸激酶(PK)的母液;测试三种酶的母液于280nm的吸光度,分别记为A1、A2、A3;
(2)分别将各母液装入透析袋,用100倍以上的超纯水作为透析液进行透析,每3个小时换一次透析液,需更换三次;
(3)透析结束后测试三种酶母液于280nm的吸光度,分别记为B1、B2、B3;
1.3、回收率的计算
回收率=透析前酶母液的吸光度/透析后酶母液的吸光度*100%;
步骤2、试剂盒的制备
采用上述透析纯化后的酶制备试剂盒,所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2;
所述试剂R1的组成如下:
缓冲液1,pH 8.5-9.5,浓度为10-300mmol/L;
络合剂,浓度为0.01%-0.5%;
α-酮戊二酸(α-KG),浓度为1-20mmol/L;
磷酸烯醇式丙酮酸(PEP),浓度为1-20mmol/L;
二磷酸腺苷(ADP),浓度为1-20mmol/L;
谷氨酸脱氢酶(GLDH),浓度为1-10KU/L;
乳酸脱氢酶(LDH),浓度为1-10KU/L;
NADH,浓度为0.50mmol/L;
防腐剂1,浓度为0.1%-1%;
所述试剂R1的pH为8.5-9.3;
所述试剂R2的组成如下:
缓冲液2,pH 5.85-7.35,浓度为10-300mmol/L;
LiCl,浓度为10-100mmol/L;
MnCl2,浓度为5-15mmol/L;
丙酮酸激酶(PK),浓度为1-10KU/L;
防腐剂2,浓度为0.01%-0.5%;
所述试剂R2的pH为6.6-6.8;
试剂R1的配制:
取纯化水,按照试剂R1各成分的浓度顺序依次加入缓冲液1、络合剂、α-KG、PEP、ADP,搅拌至完全溶解后调pH至8.5-9.3,再按浓度顺序依次加入GLDH、LDH、NADH、防腐剂1,搅拌至完全溶解后,使用滤膜过滤;
试剂R2的配制:
取纯化水,按照试剂R2各成分的浓度按顺序依次加入缓冲液2、LiCl,搅拌至完全溶解后调pH至6.6-6.8,再按浓度顺序依次加入MnCl2、PK、防腐剂2,搅拌至完全溶解后,使用滤膜过滤。
在上述技术方案中,所述的缓冲液1为Bis-tris丙烷、EPPS、Tris、TAPS缓冲液中的一种或几种。
在上述技术方案中,所述的缓冲液2为Bis-tris丙烷、MES、Tris、MOPSO中的一种或几种。
在上述技术方案中,所述的防腐剂1为MIT、NaN3、ProClin300、HPO中的一种或几种。
在上述技术方案中,所述的防腐剂2为MIT、NaN3、ProClin300、BND中的一种或几种。
在上述技术方案中,所述的络合剂为氮杂穴醚。
在上述技术方案中,所述氮杂穴醚的结构式如下:
其中,R的结构如下:
本发明的有益效果是:
本发明利用透析工艺纯化酶原材料,既适合试剂的大批生产,又能保证空白反应度低、线性范围大、稳定性好。
本发明试剂盒制备过程简单,适用于体外测定血清及血浆样本中钾的含量。
本发明选择了一种新的络合剂,增加了对Na+的选择性和络合剂的稳定性。本发明所述的络合剂为穴醚,所述穴醚为氮杂穴醚,是由3个间隔基团R连接两个桥头N原子形成的双环配体,由于环状基团体积大,刚性强,增强了环内空腔的刚性,从而提高了其识别小分子的选择性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明实施例1的零时间校准曲线图。
图2为本发明实施例1的零时间测试空白(水)的反应曲线。
图3为本发明实施例1高温14天的校准曲线图。
图4为本发明实施例1高温14天测试空白(水)的反应曲线。
具体实施方式
本发明提供一种体外酶法钾测定试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
一、首先采用透析工艺纯化酶原材料,透析纯化工艺如下:
1.透析袋的预处理
(1)根据透析酶液的量将透析袋剪成适合的长度;
(2)透析袋在含碳酸氢钠2%、EDTA 1mmol/L的溶液中煮沸10min;
(3)透析袋冲洗后于1mmol/L的EDTA溶液中煮沸10min;
(4)冷却后置于75%乙醇中,2-8℃可保存半年。
2.透析过程
(1)分别配制谷氨酸脱氢酶(GLDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙酮酸激酶(PK)的母液,一般浓度为1-20mg/mL;测试三种酶的母液于280nm的吸光度,分别记为A1、A2、A3;
(2)分别将母液装入透析袋,用100倍以上的超纯水作为透析液进行透析,每3个小时换一次透析液,需更换三次;
(3)透析结束后分别测试三种酶母液于280nm的吸光度,分别记为B1、B2、B3;
3.回收率的计算
回收率=B1/A1*100%,其他两种酶同理。
二、采用上述透析纯化后的酶制备试剂盒
所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2;
所述试剂R1的组成如下:
所述试剂R2组成如下:
所述的缓冲液1为Bis-tris丙烷、EPPS、Tris、TAPS缓冲液中的一种或几种,缓冲液2为Bis-tris丙烷、MES、Tris、MOPSO中的一种或几种;所述的防腐剂1为MIT、NaN3、ProClin300、HPO中的一种或几种;所述的防腐剂2为MIT、NaN3、ProClin300、BND中的一种或几种;所述络合剂氮杂穴醚。
试剂R1的配制:
取纯化水,按照试剂R1各成分的浓度顺序依次加入缓冲液1、络合剂、α-KG、PEP、ADP,搅拌至完全溶解后调pH至8.5-9.3,再按浓度顺序依次加入GLDH、LDH、NADH、防腐剂1,搅拌至完全溶解后,使用0.22μM滤膜过滤;
试剂R2的配制:
取纯化水,按照试剂R2各成分的浓度按顺序依次加入缓冲液2、LiCl,搅拌至完全溶解后调pH至6.6-6.8,再按浓度顺序依次加入MnCl2、PK、防腐剂2,搅拌至完全溶解后,使用0.22μM滤膜过滤。
本发明的抗干扰原理:
血液中的丙酮酸、氨、Na离子均会影响K离子的测定结果,因此均需在反应启动前除去:
(1)除丙酮酸:
(2)除氨:
(3)除Na+:
氮杂穴醚+Na+→络合物
Berry团队利用穴醚可有效去除Na+的干扰。但是,这种结构的大环易受环境影响,容易变形。近年来,苯环、呋喃环、吡啶环等环状结构作为间隔基团R的穴醚配体成为了新的研究方向。因此,本发明选择了一种新的络合剂,增加了对Na+的选择性和络合剂的稳定性。本发明所述的络合剂为穴醚,所述穴醚为氮杂穴醚,是由3个间隔基团R连接两个桥头N原子形成的双环配体(如下图通式),由于环状基团体积大,刚性强,增强了环内空腔的刚性,从而提高了其识别小分子的选择性。
其中,R=苯环、呋喃环、吡啶环等环状结构,其结构如下:
在本发明中所使用的术语,一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义,除非另有说明。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解,该实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
以下实施例所用的谷氨酸脱氢酶(GLDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙酮酸激酶(PK)均是采用上述透析工艺纯化后的,纯化前后回收率计算如下表:
实施例1:钾测定试剂盒的制备
R1组成如下:
试剂R1的配制(1L):在容器中加入全批量的纯化水,在容器中按顺序依次加入全批量EPPS、氮杂穴醚(R=苯环)、α-KG、PEP、ADP,搅拌至完全溶解后调pH至8.5±0.05(25±0.5℃),再按顺序依次加入全批量GLDH、LDH、NADH、NaN3,依次搅拌至完全溶解后,使用0.22μM滤膜过滤。
R2组成如下:
试剂R2的配制:在容器中加入全批量的纯化水,在容器中按顺序依次加入全批量Bis-tris丙烷、LiCl,依次搅拌至完全溶解后调pH至6.6±0.05(25±0.5℃),再按顺序依次加入全批量MnCl2、PK、ProClin300依次搅拌至完全溶解后,使用0.22μM滤膜过滤。
实施例1制备的试剂盒的零时间校准曲线图、零时间测试空白(水)的反应曲线、高温14天的天校准曲线图、高温14天测试空白(水)的反应曲线分别参见图1-4。
实施例2:钾测定试剂盒的制备
R1组成如下:
试剂R1的配制:在容器中加入全批量的纯化水,在容器中按顺序依次加入全批量Bis-Tris丙烷、氮杂穴醚(R=吡喃环)、α-KG、PEP、ADP,搅拌至完全溶解后调pH至9.0±0.05(25±0.5℃),再按顺序依次加入全批量GLDH、LDH、NADH、MIT,依次搅拌至完全溶解后,使用0.22μM滤膜过滤。
R2组成如下:
试剂R2的配制:在容器中加入全批量的纯化水,在容器中按顺序依次加入全批量Tris、LiCl,依次搅拌至完全溶解后调pH至6.8±0.05(25±0.5℃),再按顺序依次加入全批量MnCl2、PK、ProClin300依次搅拌至完全溶解后,使用0.22μM滤膜过滤。
实施例3:钾测定试剂盒的制备
R1组成如下:
试剂R1的配制:在容器中加入全批量的纯化水,在容器中按顺序依次加入全批量TAPS、氮杂穴醚(R=吡喃环)、α-KG、PEP、ADP,搅拌至完全溶解后调pH至9.3±0.05(25±0.5℃),再按顺序依次加入全批量GLDH、LDH、NADH、HPO,依次搅拌至完全溶解后,使用0.22μM滤膜过滤。
R2组成如下:
试剂R2的配制:在容器中加入全批量的纯化水,在容器中按顺序依次加入全批量MOPSO、LiCl,依次搅拌至完全溶解后调pH至6.8±0.05(25±0.5℃),再按顺序依次加入全批量MnCl2、PK、BND依次搅拌至完全溶解后,使用0.22μM滤膜过滤。
实施例4:性能考察
1.空白反应度评价
表1试剂空白吸光度变化率测试结果
从表1结果可以看出,本发明实施例1的空白吸光度变化率最低,即空白反应度最小。
2.高温加速稳定性评价
将实施例1至实施例3的试剂置于37℃恒温箱和2-8℃冰箱中,于第7天、第14天取出试剂同时测试质控低/高值,如表2所示。测试结果与2-8℃冷藏试剂比较,计算相对偏差(%),要求相对偏差小于10%。
表2高温稳定性测试结果
/>
从表2结果可以看出,本发明实施例1至实施例3试剂在高温37℃条件下可以稳定14天,其中实施例2稳定性最好。
3.线性考察
对实施例2用同一批号试剂测定线性,每个样本测试3次,结果见表3。
表3线性测定结果
/>
从表3可以看出,实例1至实例3线性范围均为2-12mmol/L。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (6)
1.一种体外酶法钾测定试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、采用透析工艺纯化酶原材料
1.1、透析袋的预处理
(1)根据透析酶液的量将透析袋剪成适合的长度;
(2)透析袋在含碳酸氢钠2%、EDTA 1mmol/L的溶液中煮沸10min;
(3)透析袋冲洗后于1mmol/L的EDTA溶液中煮沸10min;
(4)冷却后置于75%乙醇中,2-8℃保存;
1.2、透析过程
(1)分别配制浓度为1-20mg/mL的GLDH、LDH、PK的母液;测试三种酶的母液于280nm的吸光度,分别记为A1、A2、A3;
(2)分别将各母液装入透析袋,用100倍以上的超纯水作为透析液进行透析,每3个小时换一次透析液,需更换三次;
(3)透析结束后测试三种酶母液于280nm的吸光度,分别记为B1、B2、B3;
1.3、回收率的计算
回收率=透析前酶母液的吸光度/透析后酶母液的吸光度*100%;
步骤2、试剂盒的制备
采用上述透析纯化后的酶制备试剂盒,所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2;
所述试剂R1的组成如下:
缓冲液1,pH 8.5-9.5,浓度为10-300mmol/L;
络合剂,浓度为0.01%-0.5%;
α-KG,浓度为1-20mmol/L;
PEP,浓度为1-20mmol/L;
ADP,浓度为1-20mmol/L;
GLDH,浓度为1-10 KU/L;
LDH,浓度为1-10 KU/L;
NADH,浓度为0.50mmol/L;
防腐剂1,浓度为0.1%-1%;
所述试剂R1的pH为8.5-9.3;
所述试剂R2的组成如下:
缓冲液2,pH 5.85-7.35,浓度为10-300 mmol/L;
LiCl,浓度为10-100mmol/L;
MnCl2,浓度为5-15mmol/L;
PK,浓度为1-10KU/L;
防腐剂2,浓度为0.01%-0.5%;
所述试剂R2的pH为6.6-6.8;
试剂R1的配制:
取纯化水,按照试剂R1各成分的浓度顺序依次加入缓冲液1、络合剂、α-KG、PEP、ADP,搅拌至完全溶解后调pH至8.5-9.3,再按浓度顺序依次加入GLDH、LDH、NADH、防腐剂1,搅拌至完全溶解后,使用滤膜过滤;
试剂R2的配制:
取纯化水,按照试剂R2各成分的浓度按顺序依次加入缓冲液2、LiCl,搅拌至完全溶解后调pH至6.6-6.8,再按浓度顺序依次加入MnCl2、PK、防腐剂2,搅拌至完全溶解后,使用滤膜过滤;
所述的络合剂为氮杂穴醚。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的缓冲液1为Bis-tris丙烷、EPPS、Tris、TAPS缓冲液中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的缓冲液2为Bis-tris丙烷、MES、Tris、MOPSO中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的防腐剂1为MIT、NaN3、ProClin300、HPO中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的防腐剂2为MIT、NaN3、ProClin300、BND中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述氮杂穴醚的结构式如下:
其中,R选自以下结构中的任意一种:
。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110992608.7A CN113718015B (zh) | 2021-08-27 | 2021-08-27 | 一种体外酶法钾测定试剂盒的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110992608.7A CN113718015B (zh) | 2021-08-27 | 2021-08-27 | 一种体外酶法钾测定试剂盒的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113718015A CN113718015A (zh) | 2021-11-30 |
CN113718015B true CN113718015B (zh) | 2024-05-07 |
Family
ID=78678459
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110992608.7A Active CN113718015B (zh) | 2021-08-27 | 2021-08-27 | 一种体外酶法钾测定试剂盒的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113718015B (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3614470A1 (de) * | 1985-05-02 | 1986-11-20 | Gary D. Flushing N.Y. Steinman | Verfahren zum messen der kaliumgehalte in biologischen fluessigkeiten |
CN1104772A (zh) * | 1987-04-10 | 1995-07-05 | 曼海姆泊灵格股份公司 | 用于测定液体中钠离子的方法和组合物 |
CN101717814A (zh) * | 2009-12-18 | 2010-06-02 | 北京九强生物技术有限公司 | 测定血清、血浆中钾离子含量的液体双试剂诊断试剂盒 |
CN106749328A (zh) * | 2016-11-21 | 2017-05-31 | 新乡学院 | 一种穴醚及其制备方法 |
-
2021
- 2021-08-27 CN CN202110992608.7A patent/CN113718015B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3614470A1 (de) * | 1985-05-02 | 1986-11-20 | Gary D. Flushing N.Y. Steinman | Verfahren zum messen der kaliumgehalte in biologischen fluessigkeiten |
CN1104772A (zh) * | 1987-04-10 | 1995-07-05 | 曼海姆泊灵格股份公司 | 用于测定液体中钠离子的方法和组合物 |
CN101717814A (zh) * | 2009-12-18 | 2010-06-02 | 北京九强生物技术有限公司 | 测定血清、血浆中钾离子含量的液体双试剂诊断试剂盒 |
CN106749328A (zh) * | 2016-11-21 | 2017-05-31 | 新乡学院 | 一种穴醚及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
"来自基因工程菌E.coli BL21/pET-DsbA-MalQ的麦芽糖转糖基酶的分离纯化及酶学性质研究";王水兴;龚珩;郭勇;夏慧玲;吴凌伟;;《食品科学》;第28卷(第12期);第258-262页 * |
"猪胰脏淀粉酶的提取、部分纯化与性质研究";闵玉涛等;《食品工业科技》;第32卷(第1期);第169-171页 * |
"生姜蛋白酶的分离纯化及其酶学性质初步研究";游庆红等;《中国酿造》(第04期);第98-100页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113718015A (zh) | 2021-11-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Morley et al. | Manual and autoanalyzer methods for measuring blood glucose using guaiacum and glucose oxidase | |
US4116635A (en) | General purpose in vitro anticoagulant | |
CN113718015B (zh) | 一种体外酶法钾测定试剂盒的制备方法 | |
Brostrom et al. | Choline kinase from brewers' yeast: Partial purification, properties, and kinetic mechanism | |
IL46545A (en) | Analytical process for enzymatic determination of substrates in biological Niger | |
Johnson et al. | Galactose oxidase enzyme electrode with internal solution potential control | |
CN107607524A (zh) | 氨测定试剂盒 | |
CN113075139B (zh) | 一种稳定的双试剂血氨测定试剂盒 | |
JP3674388B2 (ja) | アンモニアの測定方法 | |
Kyd et al. | Adenosine kinase from human erythrocytes: determination of the conditions required for assay in crude hemolysates | |
Sethi | In vitro inhibition of viral DNA polymerase activity by litmomycin | |
YAMAGUCHI et al. | Quantitative Determination of Thiamin and Its Phosphate Esters in Human Whole Blood by High-Performance Liquid Chromatography and Clinical Application | |
CN113462745A (zh) | 一种消除羟苯磺酸钙干扰的游离脂肪酸测定试剂盒 | |
CN115637265A (zh) | 用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂及制备方法 | |
CN117625735A (zh) | 一种用于检测β-羟丁酸的试剂及试剂盒 | |
CN102298015A (zh) | 甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒 | |
CN113358585A (zh) | 一种金属β-内酰胺酶活性的检测方法 | |
Sampson et al. | A comparative study of micro-ammonia determinations in plasma using two different methods | |
CN102081097A (zh) | 半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒 | |
CN102081098A (zh) | 半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒 | |
CN102297949A (zh) | 半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒 | |
CN102297981A (zh) | 半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒 | |
JPS6131098A (ja) | コリンエステラ−ゼ定量用試薬 | |
CN102297948A (zh) | 半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒 | |
CN102297982A (zh) | 半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |