CN115637265A - 用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂及制备方法。本发明保护剂由50‑200mM pH9.0HEPES、10‑20v/v％聚丙二醇400、10‑20m/v％山梨醇、0.1‑0.2v/v％Triton X‑100、10‑20mM二硫苏糖醇、5‑10mM EDTA和0.1‑0.2m/v％NaN₃组成。该保护剂可替代同型半胱氨酸循环酶法检测试剂盒中R2试剂的缓冲液。该保护剂的使用可显著增加SAHase、HMTase、ADA和GLDH混合酶液的稳定性，防止酶混合液室温存放中活性的下降，延长混合酶液的室温使用寿命。

Description

用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂及制备方法

技术领域

本发明属于生化诊断试剂技术领域，具体地说，涉及一种用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂及制备方法。

背景技术

同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)又称高半胱氨酸，为一种含巯基的氨基酸，主要来源于饮食摄取的甲硫氨酸，是人体内甲硫氨酸和半胱氨酸代谢及甲基活化过程中的重要中间产物，其本身并不参加蛋白质的合成。在细胞内，人体摄取的甲硫氨酸与ATP由甲硫氨酸腺苷基转移酶(MAT)催化生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM为活化的甲基供体，参与多种转甲基生理反应，生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，SAH经水解脱腺苷生成同型半胱氨酸(HCY)。约一半的Hcy由甲基四氢叶酸提供一碳单位在甲硫氨酸合成酶(MS)的作用下，生成甲硫氨酸，完成甲硫氨酸到甲硫氨酸的循环。另一半的Hcy通过转硫基途径代谢，Hcy与丝氨酸在胱硫醚β合成酶(CBS)作用下形成胱硫醚，在胱硫醚裂解酶的作用下形成半胱氨酸。

HCY在人体血浆中以两种形式存在，氧化型同型半胱氨酸和还原型同型半胱氨酸。氧化型是同型半胱氨酸在血浆中的主要存在形式，以二硫化物形式或与蛋白质结合形式存在；还原型同型半胱氨酸中游离的巯基具有很高的活性，能诱使人体内氧自由基爆发。正常情况下，血液中同型半胱氨酸在体内能被分解代谢，浓度维持在较低水平。但原发性和继发性疾病将导致血同型半胱氨酸浓度升高，形成高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHCY)。1969年Mccully从遗传性同型半胱氨酸尿症死亡儿童尸检中发现,其体循环内存在广泛的动脉血栓形成及动脉粥样硬化(AS)的病理表现，由此提出HHCY可导致动脉粥样硬化性血管性疾病的假说。多年的基础和临床研究已充分证实HCY可以直接或间接导致血管内皮细胞损伤，促进血管平滑肌细胞增殖，影响低密度脂蛋白的氧化，增强血小板功能，引起斑块，导致心血管、动脉粥样硬化和中风等疾病；HHCY会导致人体产生认知功能障碍，严重的会导致产生阿尔茨海默氏病，精神分裂症；HHCY也增加了老年人群骨折比例。同时叶酸、维生素B6、B12的缺乏将导致人体HCY升高。因此HCY已成为动脉粥样硬化、冠心病和静脉血栓等心脑血管疾病的重要临床和预警指标，也是精神性疾病、老年病、维生素缺乏等病症诊断的重要补充指标。

HCY测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC法)、气相色谱-质谱法(GC-MS法)、酶免疫检测法(ELA法)、荧光偏振免疫检测法(FPLA法)和循环酶法。色谱法具有很高的准确度和稳定性，然而，对标本的处理和操作人员、设备维护要求较高，通常作为同型半胱氨酸的参考方法，而不能用于常规样本的检测；酶联免疫法的灵敏度高、特异性强，但是操作繁琐，精密度差，耗费时间长，不适合大量样本的检测；荧光偏振免疫检测法，需要配备专用的检测仪器，单次检测成本较高。因此可适用于大型生化分析仪、操作简便，精密度好的HCY循环酶法已成为临床检测的主要技术。

目前循环酶法包括水解酶法和胱硫醚法两种方法。但胱硫醚法因不能消除正常代谢的β-胱硫醚，尤其对于肾脏疾病患者会产生特别高的β-胱硫醚，从而导致检测结果的不准确。而水解酶法特异性高，抗干扰能力强，能消除体内代谢β-胱硫醚，检测结果更为准确。因此国内外研发出了多款HCY水解酶检测试剂盒。但由于水解酶循环酶法试剂盒中需要用到S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)、Hcy甲基转移酶(HMTase)、腺苷脱氨酶(ADA)和谷氨酸脱氢酶(GLDH)混合酶液，而这4种酶普遍热稳定性不高，且SAHase、GLADH受铜等金属离子强抑制，ADA为巯基酶，GLADH中活性中心Cys的巯基至关重要，巯基存在不稳定性谁空气暴露时间延长、温度升高极易氧化成二硫键，同时一般试剂盒常用的抗巯基氧化的抗坏血酸对该GLADH有较强的抑制作用。混合酶的这些特征导致目前试剂盒在室温暴露使用时(生化分析仪的使用特点)，活性不稳定，表现为试剂盒在使用后期测值偏低，尤其是高值样本(有临床指导意义的样本)。这严重制约了试剂盒的有效利用，增加了检测成本，降低了生化分析仪的使用效率，甚至会对病例的临床指标给出错误的信息导致漏诊。因此研发HCY循环酶法检测试剂盒酶液保护剂，以延长其使用寿命，提高其有效期内测值的可靠性十分必要和迫切。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂及制备方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂，所述保护剂由50-200mM pH9.0HEPES、10-20v/v％聚丙二醇400、10-20m/v％山梨醇、0.1-0.2v/v％Triton X-100、10-20mM二硫苏糖醇、5-10mM EDTA和0.1-0.2m/v％NaN₃组成。

所述保护剂的工作浓度为：50mM pH9.0HEPES、10v/v％聚丙二醇400、5m/v％山梨醇、0.05v/v％Triton X-100、10mM二硫苏糖醇、2.5mM EDTA和0.05m/v％NaN₃。

上述酶液保护剂配方及工作浓度为大量优化实验的结果，能最大程度地维持SAHase、HMTase、ADA和GLDH四种酶的活性，且与中生北控生物科技股份有限公司生产的同型半胱氨酸(双试剂)循环酶法检测试剂盒配合使用效果最佳。

第二方面，本发明提供所述保护剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将无离子水和聚丙二醇400按1:1体积比混合，配制成50％浓度的聚丙二醇母液，记为溶液A；

(2)称取HEPES，用无离子水溶解，调pH至9.0，配制成200mM HEPES缓冲液；按终浓度分别为20m/v％、20mM、10mM和0.2m/v％的比例，称取山梨醇、二硫苏糖醇、EDTA和NaN₃，依次加入200mM HEPES缓冲液中混匀，得到混合液；然后按终浓度为0.2v/v％的比例量取Triton X-100，加入所述混合液中，配制成溶液B；

(3)将所述溶液A和B按4:5体积比混合，调pH至9.0，无离子水定容至预配制体积，用0.45μm滤膜过滤，得到pH9.0的100mM HEPES缓冲液、20％聚丙二醇400、10％山梨醇、0.1％Triton X-100、10mM二硫苏糖醇、5mM EDTA和0.1％ NaN₃组成的混合酶液保护剂；使用时，用无离子水稀释1倍至工作浓度。

第三方面，本发明提供含有所述保护剂的试剂盒(同型半胱氨酸循环酶法检测试剂盒)。

可将本发明的酶液保护剂替代同型半胱氨酸(双试剂)循环酶法检测试剂盒中R2试剂的缓冲液。使用时保护剂(pH9.0的100mM HEPES缓冲液、20％聚丙二醇400、10％山梨醇、0.1％Triton X-100、10mM二硫苏糖醇、5mM EDTA和0.1％ NaN₃)稀释1倍，加入SAHase、HMTase、ADA和GLDH四种酶，以防止分析仪使用中空气暴露的四种混合酶液的酶活性下降，提高HCY测值稳定性。

本发明中涉及的同型半胱氨酸循环酶法检测是以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为底物，通过S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)、Hcy甲基转移酶(HMTase)、腺苷脱氨酶(ADA)和谷氨酸脱氢酶(GLDH)混合液循环催化偶联NADH生成NAD实现的，其酶液为SAHase、HMTase、ADA和GLDH混合液。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明中聚丙二醇400、山梨醇可以在酶表面形成多羟基结构，防止酶聚集而失活；铜等金属离子是S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和谷氨酸脱氢酶的强抑制剂，EDTA可有效解除金属离子对该酶的抑制；Hcy甲基转移酶和谷氨酸脱氢酶活性中心巯基至关重要，二硫苏糖醇可有效防止酶活性中心巯基被氧化，Triton X-100为表面活性剂，对酶结构的维持有意义，NaN₃可有效防止微生物的污染。该保护剂的使用可显著增加SAHase、HMTase、ADA和GLDH混合酶液的稳定性，防止酶混合液室温存放中活性的下降，延长混合酶液的室温使用寿命。

具体实施方式

本发明针对目前生化分析仪上使用的同型半胱氨酸(双试剂)循环酶法检测试剂盒在使用后期因酶活下降而导致样品(尤其是高值样品)测值偏低的缺陷，提供一种酶液保护剂，以延长试剂盒在生化分析仪上的在线稳定使用时间。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂，组成如下：HEPES缓冲液、聚丙二醇400、山梨醇、Triton X-100、二硫苏糖醇、EDTA(乙二胺四乙酸二钠)和NaN₃(叠氮化钠)。

所述酶液保护剂的配方为：50-200mM pH9.0HEPES、10-20v/v％聚丙二醇400、10-20m/v％山梨醇、0.1-0.2v/v％Triton X-100、10-20mM二硫苏糖醇、5-10mM EDTA和0.1-0.2m/v％NaN₃。

本发明的酶液保护剂可采用如下方法配制而成：

1、按1:1比例混匀无离子水和聚丙二醇400，配制成50％浓度的聚丙二醇母液标为溶液A；

2、准确称取HEPES，加无离子水，搅拌溶解，调节溶液pH值为9.0，配制成200mMHEPES缓冲液；

按终浓度分别为20％、20mM、10mM、0.2％比例，准确称量山梨醇、二硫苏糖醇、EDTA和NaN₃，依次加入200mM HEPES缓冲液中，分别搅拌溶解、混匀，按终浓度为0.2％的比例准确吸取Triton X-100，加入HEPES缓冲液，混匀，配制成溶液B；

3、按4:5比例量取溶液A和B，混匀后效验pH值至9.0，无离子水定容至预配制体积，用0.45μm滤膜过滤，得到pH9.0的100mM HEPES缓冲液、20％聚丙二醇400，10％山梨醇，0.1％ Triton X-100，10mM二硫苏糖醇，5mM EDTA，0.1％ NaN₃组成的混合酶液保护剂。

该酶液保护剂的用途为：替代同型半胱氨酸(双试剂)循环酶法检测试剂盒中R2试剂的缓冲液。使用时上述保护剂稀释1倍加入SAHase、HMTase、ADA和GLDH四种酶，以防止分析仪使用中空气暴露的四种混合酶液的酶活性下降，提高HCY测值稳定性。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中涉及的同型半胱氨酸(双试剂)循环酶法检测试剂盒(京械注册20162400889)购自中生北控生物科技股份有限公司。

该检测试剂盒(可参见CN110308282B)由试剂R1、R2和HCY校准品溶液组成；

其中，试剂R1的配方为：50mM、pH8.5的Tris缓冲液，Triton X-100 1g/L，甘露醇5g/L，叔丁基对苯二酚1mM，乙二胺四乙酸二钠0.5mM，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐2mM，S-腺苷甲硫氨酸1mM，α-酮戊二酸5mM，NADH 0.4mM，NaN₃ 1g/L；

试剂R2的配方为：50mM、pH9.0的HEPES缓冲液，Triton X-100 1g/L，甘露醇5g/L，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶3KU/L，Hcy甲基转移酶5KU/L，腺苷脱氨酶2KU/L，谷氨酸脱氢酶10KU/L，NaN₃ 1g/L；

浓度分别为2μM、8μM、15μM、30μM、60μM的HCY校准品溶液。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。

实施例1用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂的制备

本实施例提供的用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂，由HEPES缓冲液、聚丙二醇400、山梨醇、Triton X-100、二硫苏糖醇、EDTA和NaN₃组成。其工作浓度为：50mMpH9.0HEPES、10v/v％聚丙二醇400、5m/v％山梨醇、0.05v/v％Triton X-100、10mM二硫苏糖醇、2.5mM EDTA和0.05m/v％NaN₃。

该酶液保护剂的制备方法如下：

1、按1:1比例混匀无离子水和聚丙二醇400，配制成50％浓度的聚丙二醇母液标为溶液A；

2、准确称取HEPES，加无离子水，搅拌溶解，调节溶液pH值为9.0，配制成200mMHEPES缓冲液；

按终浓度分别为20％、20mM、10mM、0.2％比例，准确称量山梨醇、二硫苏糖醇、EDTA和NaN₃，依次加入200mM HEPES缓冲液中，分别搅拌溶解、混匀，按终浓度为0.2％的比例准确吸取Triton X-100，加入HEPES缓冲液，混匀，配制成溶液B；

3、按4:5比例量取溶液A和B，混匀后效验pH值至9.0，无离子水定容至预配制体积，用0.45μm滤膜过滤，得到pH9.0的100mM HEPES缓冲液、20％聚丙二醇400，10％山梨醇，0.1％ Triton X-100，10mM二硫苏糖醇，5mM EDTA，0.1％ NaN₃组成的混合酶液保护剂。

该酶液保护剂的用途为：替代同型半胱氨酸(双试剂)循环酶法检测试剂盒中R2试剂的缓冲液。使用时上述保护剂稀释1倍加入SAHase、HMTase、ADA和GLDH四种酶，以防止分析仪使用中空气暴露的四种混合酶液的酶活性下降，提高HCY测值稳定性。

实施例2用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂的应用

用实施例1制备的酶液保护剂替代同型半胱氨酸(双试剂)循环酶法检测试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)中R2试剂的缓冲液，对混合酶液提供保护，延长HCY测值稳定性。

根据试剂盒R2中四种酶所设定酶量，准确吸取1/2预配体积的酶液保护剂，加S-腺苷同型半胱氨酸水解酶至3KU/L，Hcy甲基转移酶至5KU/L，腺苷脱氨酶至2KU/L，谷氨酸脱氢酶至10KU/L，无离子水定容至预配制体积。

1、仪器：HITACHI 7180。

2、测试样本：HCY高浓度质控品和低浓度质控品。

3、测试方案

(1)酶液保护剂对加速老化中酶稳定性的影响：由本发明的酶液保护剂配制的R2试剂和试剂盒中原始的R2试剂分别在30℃、37℃和45℃加速老化(R1试剂4℃保存)，每隔3天进行测定，总测定时间21天。

(2)酶液保护剂对开瓶存放中酶稳定性影响：由本发明的酶液保护剂配制的R2和试剂盒中的R2试剂模拟分析仪开瓶状态，既在8℃左右开瓶暴露于空气中，R1试剂正常4℃保存，每隔4天进行测定，总测定时间24天。

4、结果

(1)酶液保护剂对加速老化中酶稳定性影响，结果见表1：

表1酶液保护剂对加速老化中酶稳定性影响

该结果表明，酶液保护剂可有效提高S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、Hcy甲基转移酶、腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶对温度的耐受性。

(2)酶液保护剂对开瓶存放中酶稳定性影响，结果见表2：

表2酶液保护剂对开瓶存放中酶稳定性影响

该结果表明，酶液保护剂可有效提高S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、Hcy甲基转移酶、腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶抗氧化能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂，其特征在于，所述保护剂由50-200mM pH9.0 HEPES、10-20v/v％聚丙二醇400、10-20m/v％山梨醇、0.1-0.2v/v％TritonX-100、10-20mM二硫苏糖醇、5-10mM EDTA和0.1-0.2m/v％NaN₃组成。

2.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于，所述保护剂的工作浓度为：50mM pH9.0HEPES、10v/v％聚丙二醇400、5m/v％山梨醇、0.05v/v％Triton X-100、10mM二硫苏糖醇、2.5mM EDTA和0.05m/v％NaN₃。

3.权利要求2所述保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将无离子水和聚丙二醇400按1:1体积比混合，配制成50％浓度的聚丙二醇母液，记为溶液A；

(2)称取HEPES，用无离子水溶解，调pH至9.0，配制成200mM HEPES缓冲液；按终浓度分别为20m/v％、20mM、10mM和0.2m/v％的比例，称取山梨醇、二硫苏糖醇、EDTA和NaN₃，依次加入200mM HEPES缓冲液中混匀，得到混合液；然后按终浓度为0.2v/v％的比例量取TritonX-100，加入所述混合液中，配制成溶液B；

(3)将所述溶液A和B按4:5体积比混合，调pH至9.0，无离子水定容至预配制体积，用0.45μm滤膜过滤，得到pH9.0的100mM HEPES缓冲液、20％聚丙二醇400、10％山梨醇、0.1％Triton X-100、10mM二硫苏糖醇、5mM EDTA和0.1％NaN₃组成的混合酶液保护剂；使用时，用无离子水稀释1倍至工作浓度。

4.含有权利要求1或2所述保护剂的试剂盒。