CN105588937A - 酶标板包被液、封闭液及酶标板制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶标板包被液和一种酶标板封闭液，所述酶标板包被液含有pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液和G-6-PD，所述酶标板封闭液含有pH＝8.0的磷酸盐缓冲液、NADP+和G-6-P，本发明还公开了一种配合使用所述酶标板包被液和所述酶标板封闭液的预包被酶标板的制作方法，所述预包被酶标板的制作方法在包被过程中G-6-PD与待包被的抗原或抗体一同包被，封闭时NADP+可还原为NADPH，通过检测NADPH可间接的检测G-6-PD的包被均一度，进而反映抗原或抗体的包被均一度，实现在制作过程中鉴别出不合格的预包被酶标板，可保证预包被酶标板的品质。

Description

酶标板包被液、封闭液及酶标板制作方法
技术领域
本发明属于酶标板包被技术领域，具体涉及酶标板包被液、酶标板封闭液及预包被酶标板的制作方法。
背景技术
酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)具有高灵敏度、高特异性、易于标准化等诸多优点，被广泛应用于生物医疗体外诊断、生命科学研究、食品安全检测等方面。
ELISA方法是利用了抗原与抗体的特异反应以及酶与底物产生的颜色反应，原理为抗原或抗体与酶连接形成酶标抗原或抗体，再与对应的抗体或抗原反应，然后通过酶与底物产生颜色反应，通过测定颜色的变化来进行定性或定量测定，测定的对象可以是抗体也可以是抗原。ELISA方法首先需要将抗原或抗体先结合在固相载体上，例如聚苯乙烯材质的酶标板的微孔中，该过程称为包被。商业化的ELISA试剂盒，在出厂之前酶标板上就已经预先包被了抗原或抗体。抗原或抗体在酶标板中的包被质量，即包被在固相载体上的各微孔中的抗原或抗体的均一度直接决定ELISA试剂盒的检测结果的准确性。
抗原或抗体在酶标板中的包被质量受机器状态、操作手法、包被条件、环境等因素的影响，包被过程不可避免的会出现一定几率的不合格的预包被酶标板。而现有的预包被酶标板制作方法并不能在包被过程中对包被质量进行及时有效的检测，常规的检测方法是等到包被过程完全结束后再利用与检测指标相对应的成套试剂通过一次到数次的孵育、洗板、显色、终止等步骤才能明确预包被酶标板的质量，并且用于测试的预包被酶标板也会因为测试而报废。
常规的检测方法并不能对不合格品进行有效鉴别，不同预包被酶标板质量不均，稳定性得不到保障，从而影响检测结果的稳定性，检测结果的稳定性不够是ELISA方法最糟诟病的缺点之一，“试剂盒稳定性”问题在国产ELISA试剂盒产品中尤为突出。
发明内容
因此，针对现有的预包被酶标板制作方法不能对包被均一度进行有效检测的技术问题，本发明目的在于提供一种酶标板包被液和一种酶标板封闭液以及一种配合使用所述酶标板包被液和所述酶标板封闭液的可在包被制作过程中进行包被均一度检测的预包被酶标板的制作方法。
本发明的酶标板包被液含有的pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液，还含有葡萄糖-6-磷酸氢化酶。
所述酶标板包被液中，G-6-PD的酶活性为50～500UI/MG；G-6-PD的浓度为5～50μg/L，优选15～35μg/L，更优选20～30μg/L，最优选25μg/L。
本发明的酶标板封闭液含有pH＝8.0的磷酸盐缓冲液、吐温-20和BSA，还含有氧化型辅酶和6-磷酸葡萄糖。
所述酶标板封闭液中，NADP+的浓度为0.1～1mmol/L，优选0.15～0.5mol/L，更优选0.2～0.4mol/L，最优选0.3mmol/L；G-6-P的浓度为0.05～1mmol/L，优选0.08～0.4mmol/L，更优选0.1mmol/L。
所述酶标板封闭液中，吐温-20的体积分数为0.05％，BSA的浓度为0.5～5g/L，优选0.5～1g/L，更优选0.5g/L。
本发明的预包被酶标板的制作方法，其包括步骤：
1)用所述酶标板包被液溶解待包被的抗体或抗原；
2)步骤1)得到的酶标板包被液加入待包被的酶标板的各个微孔中，4℃～37℃包被2～10小时；
3)所述酶标板用洗涤液洗2～5优选3次，并拍干；
4)向所述酶标板的各个微孔中加入所述酶标板封闭液，37℃(封闭1～2小时，然后弃去封闭液、拍干、烘干；
步骤4)中酶标板封闭液封闭0.5～2小时后检测所述酶标板的包被均一度。
步骤1)中溶解后抗体或抗原在所述酶标板包被液中的浓度为0.1～10μg/mL，优选1～5μg/mL，更优选2μg/mL。
步骤2)中所述酶标板包被液的加入量为50～100μL/孔；步骤3)中，所述洗涤液用量为350μL/孔/次；步骤4)所述酶标板封闭液的加入量为250μL/孔。
步骤3)中所述洗涤液可选用通用试剂盒洗涤液，比如含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液。
步骤4)中检测所述酶标板的包被均一度具体是将所述酶标板各个微孔内封闭液在340nm波长处的吸光度，计算各个微孔吸光度的变异系数，所述变异系数反映所述酶标板的包被均一度。
本发明关键在于利用G-6-PD、G-6-P和NADP+这一组化合物之间的特异性反应，G-6-PD可使G-6-P释放出H+，同时NADP+还原成还原型辅酶(NADPH)，而利用NADPH在340nm波长处的特征吸收，可进行精确检测NADPH的量，进而可精确检测G-6-PD的量。
本发明的预包被酶标板的制作方法，首先使用添加有G-6-PD的酶标板包被液进行包被，在包被过程中G-6-PD与待包被的抗原或抗体一同包被，在包被并洗涤完后进行封闭时，使用添加有NADP+和G-6-P的酶标板封闭液，G-6-PD可使G-6-P释放出H+，同时NADP+还原成NADPH。在封闭过程中或封闭完成时使用酶标仪检测酶标板中各个微孔中的酶标板封闭液在340nm波长处的吸光度，测得的吸光度即可反映各个微孔中NADPH的量，也就间接反映各个微孔中包被的G-6-PD的量，再根据各个微孔的吸光度计算酶标板的变异系数，所述变异系数即反映了G-6-PD的包被均一度，进而可反映一同包被的抗原或抗体的包被均一度，变异系数越小，包被均一度越高，以此实现了酶标板包被质量的检测。另外，产生的NADPH具有抗氧化性可以提高预包被酶标板在保存过程中的稳定性。
本发明的积极进步效果在于：本发明的预包被酶标板的制作方法可在预包被酶标板的制作过程中，即封闭过程中，通过测定酶标板微孔内的酶标板封闭液的吸光度来对抗原或抗体的包被均一度进行无损检测，及时检测预包被酶标板的质量，对不合格的预包被酶标板进行鉴别，不仅可保证预包被酶标板的品质，而且检测过程不影响预包被酶标板的后续使用。
附图说明
图1为实施例1中的常规检测方法的检测数据对比图。
图2为实施例2中的牛奶样品中AFM1的检测数据对比图。
图3为实施例3中的玉米粉样品中AFB1的检测数据对比图。
图4为实施例4中的全脂乳清粉样品中叶酸的检测数据对比图。
具体实施方式
实例1链霉亲和素预包被酶标板的制作
1.1试剂配置
制作过程需要使用到的试剂包括酶标板包被液、洗涤液和封闭液，可根据表1中的成分及参数或含量进行配置。
表1
1.2制作步骤
1)用酶标板包被液溶解链霉亲和素，链霉亲和素浓度为2μg/mL；
2)向待包被的96孔的酶标板的各微孔中加入溶有链霉亲和素的酶标板包被液(100μL/孔)，4℃包被过夜；
3)用洗涤液洗板3次(350μL/孔/次)，并拍干；
4)加入封闭液(250μL/孔)，37℃封闭2小时；使用酶标仪检测酶标板各个微孔内封闭液在340nm波长处的吸光度，根据测得的各个微孔的吸光度计算出酶标板的变异系数，变异系数超过5％的计为不合格。弃去封闭液、拍干、烘干(37℃，1h)即得预包被酶标板，真空干燥包装，避光保存。
1.3效果检验
不合格产品检出：共包被酶标板50块，其中2块变异系数超过5％，不合格率为4％。
分别取一块合格和不合格的预包被酶标板，用常规检测方法进行包被均一度检测，即分别使用生物素标记辣根过氧化物酶对链霉亲和素的包被均一度进行检测。
步骤为：
A、将生物素标记辣根过氧化物酶溶液用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释10000倍，然后加入到酶标板的各孔中(100μL/孔)，37℃避光孵育30分钟。
B、使用洗涤液洗涤酶标板3次，并拍干。
C、加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)显色液(100μL/孔)，37℃避光显色15分钟。
D、使用1M的硫酸作为终止液(100μL/孔)，终止显色反应。
E、检测450nm波长的吸光度，计算变异系数。
如图1所示，经本发明筛选，结果为合格的预包被酶标板变异系数为4.33％，不合格的预包被酶标板变异系数为7.82％，说明通过本发明筛选的酶标板包被更为均匀。
实施例2黄曲霉毒素M1单克隆抗体预包被酶标板的制作
2.1试剂配置
根据表2中的成分及参数或含量配置酶标板包被液、洗涤液和封闭液
表2
2.2制作步骤
参考实施例1，区别在于步骤1)中链霉亲和素代替为AFM1单克隆抗体，AFM1单克隆抗体浓度为0.5μg/mL。
2.3效果检验
不合格产品检出：共包被酶标板50块，其中7块孔内变异系数超过5％，不合格率为14％。
分别取一块合格和不合格的预包被酶标板，分别用于检测AFM1含量为0.45ppb的牛奶样品。
步骤为：
A、向不含AFM1的牛奶中添加AFM1，制得AFM1含量为0.45ppb的牛奶样品。
B、向预包被酶标板微孔中加入牛奶样品(100μL/孔)，再加入辣根过氧化物酶偶联的黄曲霉毒素M1(AFM1-HRP)(50μL/孔)，混匀，37℃避光孵育30分钟。
C、使用洗涤液洗涤酶标板3次，并拍干。
D、加入TMB显色液(100μL/孔)，37℃避光显色15分钟。
E、使用1M的硫酸作为终止液(100μL/孔)，终止显色反应。
F、检测450nm波长的吸光度，计算样品中AFM1的含量。
2.4测试结果
如图2所示，合格与不合格的预包被酶标板的检出的牛奶样品中AFM1的检出值的平均值都接近0.45ppb，但是由于不合格的预包被酶标板的检出值变异度大，会出现检出值高出0.5ppb的情况，从而使得样品被判断为含量超标(国标规定牛奶样品中AFM1含量不得超过0.5ppb)。而本发明在预包被酶标板在制作过程中可将不合格的预包被酶标板检测出来，合格的预包被酶标板的包被均一度具有保障，就可避免这种情况的发生。
实例3黄曲霉毒素B1(AFB1)单克隆抗体预包被酶标板的制作
3.1试剂配制：
根据表3中的成分及参数或含量配置酶标板包被液、洗涤液和封闭液。
表3
3.2制作步骤
参考实施例1，区别在于步骤1)中链霉亲和素代替为AFB1单克隆抗体，AFB1单克隆抗体浓度为1μg/mL。
3.3效果检验
不合格产品检出：共包被酶标板50块，其中2块孔内变异系数超过5％，不合格率为4％。
分别取一块合格和不合格的预包被酶标板，分别用于检测AFB1含量为5ppb的玉米粉样品。
步骤为：
A、取经液相验证过AFB1含量为5ppb的玉米粉样品，使用70％的甲醇水溶液提取，离心后将上清进一步用PBS稀释，最终获得处理完毕的样品，稀释倍数为100倍。
B、向预包被酶标板微孔中加入样品(100μL/孔)，再加入辣根过氧化物酶偶联的黄曲霉毒素B1(AFB1-HRP)(50μL/孔)，混匀，25℃避光孵育40分钟。
C、使用洗涤液洗涤酶标板3次，并拍干。
D、加入TMB显色液(100μL/孔)，37℃避光显色15分钟。
E、使用1M的硫酸作为终止液(100μL/孔)，终止显色反应。
F、检测450nm波长的吸光度，计算样品中AFB1的含量。
4.4测试结果
如图3所示，合格与不合格的预包被酶标板的检出的玉米粉样品中AFB1的检出值均数分别为4.92ppb和4.67ppb，变异系数分别为5.46％，7.34％。说明经本发明筛选出的合格品更为稳定。
实例4叶酸抗原预包被酶标板的制作
4.1试剂配制：
根据表4的成分及参数或含量配置酶标板包被液、洗涤液和封闭液。
表4
4.2制作步骤
参考实施例1，区别在于步骤1)中链霉亲和素代替为叶酸抗原(偶联了叶酸的卵清蛋白，FA-OVA)，FA-OVA的浓度为0.2μg/mL。
4.3效果检测
不合格产品检出：共包被酶标板50块，其中3块孔内变异系数超过5％，不合格率为6％。
分别取一块合格和不合格的预包被酶标板，分别用于检测叶酸含量为2000ppb的乳粉样品。
步骤为：
A、取经液相验证过叶酸含量为0的全脂乳清粉样品，加入叶酸标样后充分混匀，使得其中叶酸含量为2000ppb，使用体积为50倍奶粉质量的PBS充分溶解奶粉，所得复原乳作为样品进行检测。
B、向预包被酶标板微孔中加入样品(100μL/孔)，再加入小鼠抗叶酸单克隆抗体(50μL/孔)，混匀，25℃避光孵育120分钟。使用洗涤液洗涤酶标板3次，并拍干。再加入HRP标记的羊抗小鼠抗体(100μL/孔)，25℃避光孵育60分钟。
C、使用洗涤液洗涤酶标板3次，并拍干。
D、加入TMB显色液(100μL/孔)，37℃避光显色15分钟。
E、使用1M的硫酸作为终止液(100μL/孔)，终止显色反应。
F、检测450nm波长的吸光度，计算样品中叶酸的含量。
4.4测试结果
如图4所示，合格与不合格的预包被酶标板的检出的样品中叶酸的检出值均数分别为2196ppb和2213ppb，变异系数分别为6.46％，10.34％。说明经本发明筛选出的合格品更为稳定。
结合上述各实施例的结果可知，本发明的预包被酶标板的制作方法可在预包被酶标板的制作过程中，即封闭过程中，通过测定酶标板微孔内的封闭液的吸光度来对抗原或抗体的包被均一度进行无损检测，及时检测预包被酶标板的质量，对不合格的预包被酶标板进行鉴别，不仅可保证预包被酶标板的品质，而且检测过程不影响预包被酶标板的后续使用。

Claims (10)

1.一种酶标板包被液，其含有pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液，其特征在于还含有：葡萄糖-6-磷酸氢化酶。
2.如权利要求1所述的酶标板包被液，其特征在于：葡萄糖-6-磷酸氢化酶的酶活性为50-500UI/MG。
3.如权利要求2所述的酶标板包被液，其特征在于：葡萄糖-6-磷酸氢化酶的浓度为5～50μg/L，优选15～35μg/L，更优选20～30μg/L，最优选25μg/L。
4.一种酶标板封闭液，其含有pH＝8.0的磷酸盐缓冲液、吐温-20和BSA，其特征在于还含有：氧化型辅酶和6-磷酸葡萄糖。
5.如权利要求4所述的酶标板封闭液，其特征在于：氧化型辅酶的浓度为0.1～1mmol/L，优选0.15～0.5mol/L，更优选0.2～0.4mol/L，最优选0.3mmol/L；6-磷酸葡萄糖的浓度为0.05～1mmol/L，优选0.08～0.4mmol/L，更优选0.1mmol/L。
6.如权利要求4所述的酶标板封闭液，其特征在于：吐温-20的体积分数为0.05％；BSA的浓度为0.5～5g/L，优选0.5～1g/L，更优选0.5g/L。
7.一种预包被酶标板的制作方法，其包括步骤：
1)用权利要求1～3任一项所述的酶标板包被液溶解待包被的抗体或抗原；
2)步骤1)得到的酶标板包被液加入待包被的酶标板的各个微孔中，4℃～37℃包被2～10小时；
3)所述酶标板用洗涤液洗2～5优选3次，并拍干；
4)向所述酶标板的各个微孔中加入权利要求4～6任一项所述的酶标板封闭液，37℃封闭1～2小时，然后弃去封闭液、拍干、烘干；
步骤4)中酶标板封闭液封闭0.5～2小时后检测所述酶标板的包被均一度。
8.如权利要求7所述的预包被酶标板的制作方法，其特征在于，步骤1)中溶解后抗体或抗原在所述酶标板包被液中的浓度为0.1～10μg/mL，优选1～5μg/mL，更优选2μg/mL。
9.如权利要求7所述的预包被酶标板的制作方法，其特征在于：步骤2)中所述酶标板包被液的加入量为50～100μL/孔；步骤3)中，所述洗涤液用量为350μL/孔/次；步骤4)所述酶标板封闭液的加入量为250μL/孔。
10.如权利要求7所述的预包被酶标板的制作方法，其特征在于：步骤4)中检测所述酶标板的包被均一度具体是将所述酶标板各个微孔内封闭液在340nm波长处的吸光度，计算各个微孔吸光度的变异系数，所述变异系数反映所述酶标板的包被均一度。
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侯方妮: "婴幼儿配方乳粉中IgG活性含量测定方法的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

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CN113267621A (zh) * 2021-05-14 2021-08-17 北京金诺百泰生物技术有限公司 一种elisa试剂盒包被板用稳定剂及其制备方法、试剂盒包被板、试剂盒
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