CN103547679A - 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的高产量、灵敏检测 - Google Patents

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的高产量、灵敏检测 Download PDF

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Abstract

本文提供了测定生物样品中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶“G6PDH”的量的方法。本文还提供了检测G6PDH缺乏以及诊断G6PDH相关病症(如急性溶血性贫血和子痫前期)的方法。

Description

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的高产量、灵敏检测
相关申请案
本申请案涉及到并要求2010年11月24日申请的第61/416,957号美国临时申请案的优先权。本申请案的全部内容以引用的方式明确并入本文中。
技术领域
背景技术
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PD”或“G6PDH”)是戊糖磷酸途径(也称为磷酸葡萄糖酸盐途径)中的一种胞浆酶。这种代谢途径在如红细胞的细胞中产生戊醣和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(“NADPH”)，由此供应还原能量。NADPH还维持细胞中谷胱甘肽的水平，这有助于防止红血球受到氧化损害。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶受其底物葡萄糖-6-磷酸(“G6P”)刺激，形成6-磷酸葡萄糖酸-δ-内酯。其为戊糖磷酸途径的限速酶。
人体内G6PDH的遗传缺乏使其容易患上某些病症，例如非免疫溶血性贫血。确定G6PDH的存在和/或G6PDH活性的现有方法包括定性或定量荧光筛选。然而，所述方法常常具有主观性并且在许多情况下一般不能检测出G6PDH的部分缺乏。参见例如雷克罗斯GJ(Reclos GJ)等人“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏新生儿筛选(Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Deficiency Neonatal Screening)”医学筛选杂志(JMed Screen)，7：46-51(2000)和卡普兰M(Kaplan M)等人“用于新生儿时期的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏的商业筛选测试的比较(Comparison of Commercial Screening Tests forGlucose-6-Phosphate Dehydrogenase Deficiency in the Neonatal Period)”临床化学(ClinChem)，43(7)：1236-37(1997)。
发明内容
因此，在一些实施例中，申请者的教示内容提供了检测生物样品中G6PDH的量的高产量方法。所述方法包括例如：使生物样品与G6P和NADP在表面活性剂和缓冲剂存在下在合适的条件下反应，形成6-磷酸葡萄糖酸；淬灭所述生物样品，形成淬灭样品；以及通过质谱分析来检测所述淬灭样品中6-磷酸葡萄糖酸的存在或量，其中所述淬灭样品中6-磷酸葡萄糖酸的量与所述生物样品中G6PDH的量相关。
在一些实施例中，淬灭是使用酶变性剂来实现的。
在一些实施例中，质谱分析是串联质谱分析。在一些实施例中，质谱分析是使用配备有热辅助型电喷雾电离探针(例如
Figure BDA00003245084200021
(TIS)探针)的质谱仪来实现的。在一些实施例中，质谱分析是使用配备有逆相液相色谱柱的质谱仪来实现的。
在一些实施例中，检测在小于约5分钟内进行。在一些实施例中，检测在小于约3分钟内进行。在一些实施例中，所述方法允许检测约0.01毫单位或更少的G6PDH。在一些实施例中，检测实质上不受温度的波动所影响。
在一些实施例中，申请者的教示内容提供了检测个体的G6PDH缺乏的方法。所述方法包括例如：通过质谱分析来测定从个体得到的生物样品中G6PDH的量；以及将所述生物样品中G6PDH的量与适当对照值进行比较，其中当所述样品中G6PDH的量小于所述适当对照值时检测到G6PDH缺乏。
在一些实施例中，个体是新生儿或婴儿。在一些实施例中，个体是孕妇。
在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小10％指示个体的G6PDH缺乏。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小25％指示个体的G6PDH缺乏。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小50％指示个体的G6PDH缺乏。
在一些实施例中，检测G6PDH缺乏进一步包括：使生物样品与G6P和NADP在表面活性剂和缓冲剂存在下在合适的条件下反应，形成6-磷酸葡萄糖酸；淬灭所述生物样品，形成淬灭样品；以及通过质谱分析来检测所述淬灭样品中6-磷酸葡萄糖酸的存在或量，其中淬灭样品中6-磷酸葡萄糖酸的量与生物样品中G6PDH的量相关。
在一些实施例中，申请者的教示内容提供了诊断个体的急性溶血性贫血的方法。所述方法包括例如：根据申请者的教示内容检测个体的G6PDH缺乏，其中所述个体的G6PDH缺乏指示个体的急性溶血性贫血。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小25％指示个体的急性溶血性贫血。
在一些实施例中，申请者的教示内容提供了诊断个体的子痫前期的方法。所述方法包括例如：根据申请者的教示内容检测个体的G6PDH缺乏，其中所述个体的G6PDH缺乏指示个体的子痫前期。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小25％指示个体的子痫前期。
在一些实施例中，申请者的教示内容提供了用于个体的由子痫前期或急性溶血性贫血引起的死亡率和/或发病率增加的预后方法。所述方法包括例如：根据申请者的教示内容检测个体的G6PDH缺乏，其中生物样品中G6PDH的量比对照值小50％或更小指示所述个体的死亡率和/或发病率增加的预后。
在一些实施例中，适当对照值是基于正常群体中的G6PDH水平的对照值。在一些实施例中，生物样品是干血样品。
在一些实施例中，申请者的教示内容提供了检测生物样品中G6PDH的量的试剂盒。所述试剂盒可以包括例如葡萄糖-6-磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、任选地缓冲剂、任选地表面活性剂，以及关于制备促进烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、葡萄糖-6-磷酸和G6PDH的反应的反应混合物的说明书。在一些实施例中，试剂盒还包括酶变性剂。在一些实施例中，试剂盒进一步包括关于制备用于在质谱仪上分析的样品的说明书。在其它实施例中，试剂盒还包括校准曲线，所述校准曲线包括[6-磷酸葡萄糖酸/葡萄糖-6-磷酸面积]相对于G6PDH的毫单位数的图。
本文中阐述了申请者的教示内容的这些和其它特点。
附图说明
图1描绘了通过申请者的教示内容的示范性方法获得的MRM(多反应监测)中的质谱仪读数。
图2描绘了通过申请者的教示内容的示范性方法获得的MRM中的比较质谱仪读数。
图3描绘了使用申请者的教示内容的多种方法获得的示范性标准曲线。
图4A和4B描绘了通过申请者的教示内容的示范性方法获得的MRM中的质谱仪读数。
图5描绘了使用申请者的教示内容的多种方法获得的示范性标准曲线。
图6A和6B描绘了通过申请者的教示内容的示范性方法获得的MRM中的质谱仪读数。
图7A和7B分别为使用市售分析来比较申请者的教示内容的示范性方法的相关性图和布兰德-阿尔特曼图(Bland and Altman plot)。
具体实施方式
申请者的教示内容至少一部分是基于以下发现：如MS/MS、LC/MS或LC/MS/MS的质谱分析可以用于快速并精确地测定生物样品中G6PDH的量。在不希望受任何特定理论束缚的情况下，相信测定G6PDH的量(例如不是仅仅测定其存在或不存在)的能力将是有用的，例如在检测个体的部分G6PDH缺乏方面。
G6PDH将葡萄糖-6-磷酸转化为6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时将NADP还原为NADPH。然后通过葡萄糖酸内酯酶将6-磷酸葡萄糖酸内酯转化为6-磷酸葡萄糖酸。测定G6PDH活性的先前方法(包括博伊特勒方法(Beutler method))利用NADPH的形成作为酶促反应的指示标志。然而，在这种分析中通过质谱分析可能难以测定NADPH的量，因为NADP的C13同位素标记异构体与NADPH的第一C12同位素标记异构体重叠。因此，在本文所提供的方法中监测6-磷酸葡萄糖酸的量。
因此，在一些实施例中，申请者的教示内容提供了检测生物样品中G6PDH的量的高产量方法。这种方法包括使生物样品与G6P和NADP(例如在表面活性剂和缓冲剂存在下)在合适的条件下反应，形成6-磷酸葡萄糖酸；淬灭所述生物样品，形成淬灭样品；以及通过质谱分析来检测所述淬灭样品中6-磷酸葡萄糖酸的存在或量。在这种方法中，淬灭样品中6-磷酸葡萄糖酸的量与生物样品中G6PDH的量相关。
如本文中所使用，术语“高产量”是指在相对短的时间段内分析大量样品的过程。高产量分析可以使用例如96孔、384孔和1536孔盘来实现。在一些实施例中，高产量方法的目的是以超过以下的速率筛选样品：每周约250个样品、每周约300个样品、每周约350个样品、每周约400个样品、每周约450个样品、每周约500个样品、每周约550个样品、每周约600个样品、每周约650个样品、每周约700个样品、每周约750个样品、每周约800个样品、每周约850个样品、每周约900个样品、每周约950个样品、每周约1000个样品、每周约1100个样品、每周约1200个样品、每周约1300个样品、每周约1400个样品、每周约1500个样品。在一些实施例中，高产量方法的目的是以超过每周约1000个样品的速率筛选样品。
在一些实施例中，本文所描述的方法允许检测低水平的G6PDH。举例来说，本文所描述的方法允许检测约1.00毫单位或更少的G6PDH、约0.90毫单位或更少的G6PDH、约0.80毫单位或更少的G6PDH、约0.70毫单位或更少的G6PDH、约0.60毫单位或更少的G6PDH、约0.50毫单位或更少的G6PDH、约0.45毫单位或更少的G6PDH、约0.40毫单位或更少的G6PDH、约0.35毫单位或更少的G6PDH、约0.30毫单位或更少的G6PDH、约0.25毫单位或更少的G6PDH、约0.20毫单位或更少的G6PDH、约0.15毫单位或更少的G6PDH、约0.10毫单位或更少的G6PDH、约0.05毫单位或更少的G6PDH、约0.04毫单位或更少的G6PDH、约0.03毫单位或更少的G6PDH、约0.02毫单位或更少的G6PDH或甚至约0.01毫单位或更少的G6PDH。在一些实施例中，本文所描述的方法允许检测约0.10毫单位或更少的G6PDH。在一些实施例中，本文所描述的方法允许检测约0.05毫单位或更少的G6PDH。在一些实施例中，本文所描述的方法允许检测约0.01毫单位或更少的G6PDH。在一些实施例中，本文所描述的方法允许检测至少约0.01毫单位的G6PDH的G6PDH水平。在一些实施例中，本文所描述的方法允许检测至少0.01毫单位的G6PDH的G6PDH水平。
在一些实施例中，本文提供了G6PDH的量的检测实质上不受温度、pH值和/或盐浓度的波动所影响的方法。在一些实施例中，本文提供了G6PDH的量的检测实质上不受温度波动所影响的方法。在一些实施例中，本文提供了G6PDH的量的检测实质上不受检测期间的温度波动所影响的方法。在一些实施例中，本文提供了G6PDH的量的检测实质上不受样品储藏期间的温度波动所影响的方法。
在一些实施例中，使用内部标准物来更精确地测量样品中检测到的6-磷酸葡萄糖酸的量。在一些实施例中，内部标准物是加入到样品中的化合物/物质，其不会与样品中的其它物质反应并且由此提供恒定值。在一些实施例中，内部标准物是一定水平的天然存在于样品中的其它化合物/物质之一。在一些实施例中，葡萄糖-6-磷酸可以用作内部标准物。
如本文中所使用，术语“生物样品”是指(但不限于)宿主身体的样品。适用于申请者的教示内容的生物样品可以是新鲜的(例如在分析前几小时内取出)、经过冷藏或冷冻的(例如取出并放置于冷藏库或冷冻器中直到分析为止)或经过干燥的(例如取出并放置于瓦特曼纸(Whatman paper)上或直接点渍于瓦特曼纸上)。示范性生物样品包括例如血液、间质液、脊髓液、唾液、尿液、泪液、汗液等。另外的生物样品包括(但不限于)细胞或组织或其培养物(或继代培养物)、粗细胞溶解物或处理过的细胞溶解物(包括全细胞溶解物)、体液、组织提取物或细胞提取物、粪便、脑液、羊水、淋巴液或腺体分泌液。样品在与本文所描述的底物接触之前可以通过所属领域中已知的任何方法进行处理。举例来说，可以使样品经历沉淀步骤、柱色谱步骤、加热步骤等。如果样品含有可能会干扰G6PDH活性的其它酶的话，那么可以将灭活剂(例如活性位点定向的不可逆抑制剂)加入到样品中以使不需要的活性失活。在一些实施例中，生物样品是血液样品。在一些实施例中，生物样品是干血样品。
“检测(detect/detection)”打算涵盖G6PDH酶或其酶活性的检测、测量和/或表征。举例来说，可以在筛选、检测或表征酶活性调节剂的过程中检测酶活性。
在一些实施例中，检测G6PDH的量在小于约10分钟内进行。在一些实施例中，检测G6PDH的量在小于约7.5分钟内进行。在一些实施例中，检测G6PDH的量在小于约5分钟内进行。在一些实施例中，检测G6PDH的量在小于约4分钟内进行。在一些实施例中，检测G6PDH的量在小于约3分钟内进行。在一些实施例中，检测G6PDH的量在小于约2.5分钟内进行。在一些实施例中，检测G6PDH的量在小于约2分钟内进行。
如本文中所使用，术语“淬灭”是指使试剂失活或使化学反应停止。应了解，淬灭是指灭活或停止而与达成灭活或停止的机制无关。作为具体的非限制性实例，淬灭可能归因于pH值变化或淬灭剂的加入，淬灭剂可以与G6PDH或G6P反应以使其不再可用于反应。因此，淬灭样品是指G6PDH或G6P不再经历反应的样品。如本文中所使用，术语“淬灭试剂”是能够与G6PDH或G6P相互作用以使G6PDH或G6P被淬灭并且因此不能进一步反应的任何试剂。在一些实施例中，淬灭剂是酶变性剂。举例来说，在一些实施例中，淬灭剂使G6PDH变性。酶变性剂通常引发酶结构(例如二级、三级或四级结构)的非共价变化。淬灭试剂的实例包括(但不限于)乙腈、甲醇以及其混合物。
术语“缓冲剂”是指通常由弱酸和其共轭碱或弱碱和其共轭酸组成的溶液，其中溶液的pH值在加入少量酸或碱时变化极小。合适的缓冲剂包括西格玛公司目录(SigmaCatalog)的“生物缓冲剂(Biological Buffers)”部分中以及在线的sigmaaldrich.com所描述的缓冲剂。示范性缓冲剂包括(但不限于)磷酸钾缓冲剂、MES、MOPS、HEPES、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷，Trizma)、N-二甘氨酸(bicine)、TAPS、CAPS等。缓冲剂按足以产生并维持所需pH值的量存在。举例来说，pH值可以从2到12、从4到11或从6到10。
术语“表面活性剂”是指一种分子，其具有通常积极地偏好被水溶剂化的极性头基和通常不易被水溶剂化的疏水性尾部。表面活性剂可以是离子性(亦即阴离子性、阳离子性)或非离子性的。示范性表面活性剂包括(但不限于)聚山梨醇酯/吐温(Tween)(例如吐温20和吐温80)、普洛尼克(pluronic)(例如F68和F88)、曲拉通(Triton)(例如
Figure BDA00003245084200061
X-114、X-102、X-45、X-15)、泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)、脱水山梨糖醇酯或斯潘(Span)(例如斯潘20和斯潘80)、脂质(例如磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺)、醇乙氧基化物(例如
Figure BDA00003245084200062
56、C16H33(OCH2CH2)10OH、
Figure BDA00003245084200063
58、C16H33(OCH2CH2)20OH)、脂肪酸和脂肪酸酯、类固醇(例如胆固醇)、螯合剂(例如EDTA)、胺乙氧基化物、葡萄糖苷、葡糖酰胺、聚环氧烷、十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸钠、辛基葡糖苷钠、月桂基-磺基甜菜碱、肉豆蔻基-磺基甜菜碱、亚油烯基-磺基甜菜碱、硬脂酰基-磺基甜菜碱、月桂基-肌氨酸、肉豆蔻基-肌氨酸、亚油烯基-肌氨酸、硬脂酰基-肌氨酸、亚油烯基-甜菜碱、肉豆蔻基-甜菜碱、十六烷基-甜菜碱、月桂酰胺基丙基-甜菜碱、椰油酰胺基丙基-甜菜碱、亚油酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-甜菜碱、棕榈酰胺基丙基-甜菜碱、异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱、月桂酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-二甲胺、棕榈酰胺基丙基-二甲胺、异硬脂酰胺基丙基-二甲胺、甲基椰油基-牛磺酸钠、甲基油基-牛磺酸二钠、MONAQUATTM表面活性剂、聚乙二醇、聚丙二醇，以及乙二醇与丙二醇的共聚物。其它表面活性剂可以见于例如麦古基安氏乳化剂和清洁剂(McCutcheon′s Emulsifiers and Detergents)，糖果制造商出版公司(Manuf.ConfectionersPub.Co.)，新泽西州格伦罗克，2000和柯克-奥斯默(Kirk-Othmer)，化学技术百科全书(Encyclopedia of Chemical Technologies)，第2版，第19卷，第512-564页中。
在一些实施例中，使G6PDH与G6P接触以下反应时间：至少约15秒、约30秒、约45秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟或约60分钟。在一些实施例中，使G6PDH与G6P接触至少约15分钟的反应时间。在一些实施例中，使G6PDH与G6P接触至少约30分钟的反应时间。在一些实施例中，使G6PDH与G6P接触至少15分钟的反应时间。在一些实施例中，使G6PDH与G6P接触至少30分钟的反应时间。
申请者的教示内容的方法可以使用串联质谱仪和具有选择并碎裂分子离子的能力的其它质谱仪来实施。串联质谱仪(和在某种程度上的单级质谱仪)具有根据分子离子的质荷(m/z)比选择并碎裂分子离子的能力，然后记录所得片段离子(子离子)光谱。更具体地说，子片段离子光谱可以通过使所选的离子经历离解能级(例如碰撞诱导的离解(collision-induced dissociation，CID))来产生。举例来说，对应于特定m/z比的化合物的离子可以从第一质量分析中选择，在第二质量分析中碎裂并再分析。可以进行所述串联质量分析的代表性仪器包括(但不限于)磁性四扇区、串联飞行时间、三重四极杆、离子阱以及混合四极杆飞行时间(Q-TOF)质谱仪。
这些类型的质谱仪可以与各种电离源结合使用，包括(但不限于)电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)和基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorptionionization，MALDI)。可以使用电离源产生用于第一质量分析的带电物质，其中分析物并非已经具有固定电荷。另外的质谱分析仪器和碎裂方法包括MALDI-MS仪器中的源后衰变(post-source decay)和使用MALDI-TOF-TOF MS的高能CID。串联质谱仪的评述可以见于(例如)R.埃伯索尔德(R.Aebersold)和D.古德利特(D.Goodlett)所著“蛋白质组学中的质谱分析(Mass Spectrometry in Proteomics.)”，《化学评述(Chem.Rev.)》101：269295(2001)中。
在一些实施例中，质谱分析是串联质谱分析。在一些实施例中，质谱分析是使用配备有热辅助型电喷雾电离探针(例如(TIS)、Turbo-V或类似探针)的质谱仪来实现的。在一些实施例中，质谱分析利用多反应监测(MRM)。产生质谱的示范性方法可以见于例如第6,930,305号美国专利和第7,145,133号美国专利中，这两个专利都以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，质谱分析利用AB Sciex API4000TM串联质谱仪。
在一些实施例中，样品处理可以涉及分离，例如在质量分析之前。举例来说，可以分离样品的组分并且仅对样品混合物的一部分进行质量分析。以这种方式，可以降低分析的复杂性，因为可以个别地分析所分离的分析物。分离可以通过色谱法进行。举例来说，可以使用液相色谱/质谱分析(LC/MS)或液相色谱/串联质谱分析(LC/MS/MS)实现这种样品分离和质量分析。此外，可以使用适于分离所关注的分析物的任何色谱分离过程。举例来说，色谱分离可以是正相色谱、逆相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱或亲和色谱。分离也可以用电泳方式进行。电泳分离技术的非限制性实例包括(但不限于)1D电泳、2D电泳和/或毛细管电泳。在一些实施例中，本文所提供的质谱分析是使用配备有逆相液相色谱柱的质谱仪来实现的。
本文还提供检测个体的G6PDH缺乏的方法。这种方法包括通过质谱分析来测定从个体得到的生物样品中G6PDH的量；以及将所述生物样品中G6PDH的量与适当对照值进行比较，其中当所述样品中G6PDH的量小于所述适当对照值时检测到G6PDH缺乏。G6PDH缺乏一般是X连锁遗传性遗传缺陷，这通常归因于G6PDH基因的突变。这种缺乏是常见的，存在于全世界超过4亿人(通常是非洲、中东和南亚血统)中。
G6PDH基因存在于X染色体的长臂(Xq28带)上并且跨度为约18.5千碱基。在一些实施例中，G6PDH缺乏是归因于G6PDH基因突变。G6PDH基因突变可以见于例如博伊特勒E.(Beutler E.)，“G6PD缺乏(G6PD Deficiency)”血液(Blood)，84(11)：3613-3636，(1994)中。在一些实施例中，G6PDH缺乏是归因于表1中所列的基因突变之一。
Figure BDA00003245084200081
Figure BDA00003245084200091
在一些实施例中，个体的G6PDH缺乏是由从个体得到的生物样品中G6PDH的量来指示，所述量比对照值小约5％、比对照值小约10％、比对照值小约15％、比对照值小约20％、比对照值小约25％、比对照值小约30％、比对照值小约35％、比对照值小约40％、比对照值小约45％、比对照值小约50％、比对照值小约55％、比对照值小约60％、比对照值小约65％、比对照值小约70％、比对照值小约75％、比对照值小约80％、比对照值小约85％、比对照值小约90％、比对照值小约95％或比对照值小约100％。举例来说，在一些实施例中，个体的G6PDH缺乏是由从个体得到的生物样品中G6PDH的量比对照值小至少约10％来指示。在一些实施例中，个体的G6PDH缺乏是由从个体得到的生物样品中G6PDH的量比对照值小至少约25％来指示。在一些实施例中，个体的G6PDH缺乏是由从个体得到的生物样品中G6PDH的量比对照值小至少约50％来指示。举例来说，在一些实施例中，个体的G6PDH缺乏是由从个体得到的生物样品中G6PDH的量比对照值小至少10％、至少25％或至少50％来指示。
如本文中所使用，术语“个体”是指动物，如哺乳动物，包括(但不限于)人类、灵长类动物、母牛、绵羊、山羊、马、猪、狗、猫、兔、天竺鼠、大鼠、小鼠或其它牛科、羊科、马科、犬科、猫科动物、啮齿动物或鼠类物种。在一些实施例中，个体是人类。在一些实施例中，个体是新生儿或婴儿。在一些实施例中，个体是孕妇。
在一些实施例中，申请者的教示内容提供了筛选具有调节G6PDH的能力的化合物的方法。在一些实施例中，可以使用本文所描述的方法研究G6PDH活性调节剂(例如增强剂或抑制剂)的作用。此外，也可以使用本文所描述的方法研究G6PDH的底物特异性。
在一些实施例中，本文描述了诊断G6PDH相关病症的方法。如本文中所使用，术语“G6PDH相关病症”是指至少部分可归因于G6PDH缺乏的疾病和/或病症。在一些实施例中，G6PDH相关病症包括可归因于至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、约100％的G6PDH缺乏的疾病和/或病症。在一些实施例中，G6PDH相关病症包括可归因于至少25％的G6PDH缺乏的疾病和/或病症。在一些实施例中，G6PDH相关病症包括可归因于至少50％的G6PDH缺乏的疾病和/或病症。在一些实施例中，G6PDH相关病症包括可归因于至少75％的G6PDH缺乏的疾病和/或病症。
在一些实施例中，G6PDH相关病症选自慢性溶血、急性溶血性贫血、蚕豆病、新生儿高胆红素血症以及子痫前期。其它G6PDH相关病症可以包括例如血小板异常、皮肤蒂状瓣损失、运动表现障碍、癫痫发作病症、白内障发病率增加、精神分裂症或抑郁症、肾素释放减弱、糖尿病、胰岛素释放异常、心血管疾病、胆结石、肌红蛋白尿、对感染的易感性增加、白细胞功能异常、肝炎的黄疸升高、智力迟钝或血清脱氢表雄酮硫酸盐增加。参见例如博伊特勒E.(Beutler E.)，“G6PD缺乏(G6PD Deficiency)”血液(Blood)，84(11)：3613-3636，(1994)。
在一些实施例中，G6PDH相关病症是由能够诱导G6PDH缺乏的物质引起或诱发的病症。所述物质包括(但不限于)蚕豆；抗疟疾药，如伯氨喹(primaquine)、帕马喹(pamaquine)和氯喹(chloroquine)；磺酰胺，如磺胺(sulfanilamide)、新明磺(sulfamethoxazole)和磺胺米隆(mafenide)；硝化呋喃妥因(nitrofurantoin)；乙酰水杨酸；非那西丁(acetophenetidine)；噻唑砜(thiazolesulfone)；亚甲基蓝(methylene blue)；萘；止痛剂，如阿司匹林(aspirin)、非那吡啶(phenazopyridine)和乙酰苯胺(acetanilide)；以及少数非磺胺类抗生素，如萘啶酮酸(nalidixic acid)、硝化呋喃妥因、异烟肼(isoniazid)和呋喃唑酮(furazolidone)。
在一些实施例中，本文提供了诊断个体的急性溶血性贫血的方法。所述方法包括根据上文所描述的方法检测个体的G6PDH缺乏，其中所述个体的G6PDH缺乏指示个体的急性溶血性贫血。
在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约90％指示个体的急性溶血性贫血。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约80％指示个体的急性溶血性贫血。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约70％指示个体的急性溶血性贫血。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约60％指示个体的急性溶血性贫血。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约50％指示个体的急性溶血性贫血。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约40％指示个体的急性溶血性贫血。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约30％指示个体的急性溶血性贫血。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约20％指示个体的急性溶血性贫血。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约10％指示个体的急性溶血性贫血。
在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小75％指示个体的急性溶血性贫血。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小50％指示个体的急性溶血性贫血。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小25％指示个体的急性溶血性贫血。
在一些实施例中，本文提供了诊断个体的子痫前期的方法。所述方法包括根据上文所描述的方法检测个体的G6PDH缺乏，其中所述个体的G6PDH缺乏指示个体的子痫前期。
在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约90％指示个体的子痫前期。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约80％指示个体的子痫前期。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约70％指示个体的子痫前期。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约60％指示个体的子痫前期。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约50％指示个体的子痫前期。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约40％指示个体的子痫前期。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约30％指示个体的子痫前期。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约20％指示个体的子痫前期。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小至少约10％指示个体的子痫前期。
在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小75％指示个体的子痫前期。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小50％指示个体的子痫前期。在一些实施例中，样品中G6PDH的量比对照值小25％指示个体的子痫前期。
在一些实施例中，本文提供了预测个体的由子痫前期或急性溶血性贫血引起的死亡率和/或发病率增加的预后方法。所述方法包括根据上文所描述的方法检测个体的G6PDH缺乏，其中生物样品中G6PDH的量比对照值小50％或更小指示所述个体的死亡率和/或发病率增加的预后。在一些实施例中，生物样品中G6PDH的量比对照值小75％或更小指示个体的死亡率和/或发病率增加的预后。
如本文中所使用，术语“适当对照值”是基于正常群体中的G6PDH水平的对照值。也就是说，在一些实施例中，适当对照值是预定值。在一些实施例中，适当对照值是在已知具有正常G6PDH活性的单一个体中检测到的水平。在一些实施例中，适当对照值是从具有正常G6PDH活性的个体群体得到的平均水平。在一些实施例中，适当对照值是在投与能够诱导G6PDH缺乏的物质之前在患者中检测到的水平。
在一些实施例中，本文所提供的诊断或预后方法包括以下任一个步骤：使生物样品与G6P和NADP在表面活性剂和缓冲剂存在下在合适的条件下反应，形成6-磷酸葡萄糖酸；淬灭生物样品，形成淬灭样品；以及通过质谱分析来检测淬灭样品中6-磷酸葡萄糖酸的存在或量。在所述方法中，淬灭样品中6-磷酸葡萄糖酸的量与生物样品中G6PDH的量相关。
还提供了进行本文所描述的方法的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包含用于制备反应混合物的葡萄糖-6-磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、表面活性剂以及缓冲剂，所述反应混合物促进烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、葡萄糖-6-磷酸和G6PDH的反应。缓冲剂和/或表面活性剂可以按干燥形式或液体形式提供于容器中。上文提供了示范性的合适缓冲剂和表面活性剂。缓冲剂通常至少以足以产生混合物的特定pH值的量存在于试剂盒中。在一些实施例中，以具有预选pH值和缓冲剂浓度的储备溶液形式提供缓冲剂。在一些实施例中，试剂盒中还提供酸和/或碱以将反应混合物调整到所需pH值。试剂盒可以另外包括淬灭溶液，例如酶变性剂，如乙腈∶甲醇混合物。试剂盒可以另外包括一种或一种以上稀释剂，例如适用于质谱分析系统中的溶剂。试剂盒可以另外包括有益于酶活性的其它组分，如盐(例如KCl、NaCl或NaOAc)、金属盐(例如Ca2+盐(如CaCl2)、MgCl2、MnCl2、ZnCl2或Zn(OAc))和/或可以适用于G6PDH酶的其它组分。这些其它组分可以按干燥形式或液体形式彼此分开提供或混合在一起。
葡萄糖-6-磷酸和/或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸可以按干燥形式或液体形式与缓冲剂一起或分开提供。为了促进在反应混合物中的溶解，葡萄糖-6-磷酸和/或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸可以按与反应混合物的其它组分可混溶的水溶液、部分水溶液或非水性储备溶液形式提供。
在一些实施例中，试剂盒进一步包括使用说明书。举例来说，试剂盒可以包括关于制备促进烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、葡萄糖-6-磷酸和G6PDH的反应的反应混合物的说明书。在一些实施例中，试剂盒包括关于制备用于在质谱仪上分析的样品的说明书。在一些实施例中，试剂盒进一步包含预制的校准曲线，如图3中所示的曲线，其将允许使用者基于使用质谱仪所测定的6-磷酸葡萄糖酸的量来测定样品中G6PDH的量。举例来说，预制的校准曲线可以是[6-磷酸葡萄糖酸/葡萄糖-6-磷酸面积]相对于G6PDH的毫单位数的图。在一些实施例中，试剂盒包括具有预定量的G6PDH的标准样品，以使得使用者可以获得其自己的校准曲线。在一些实施例中，试剂盒进一步包括关于如何制成校准曲线的说明书。说明书可以包括以下任何组合：
a.将葡萄糖-6-磷酸与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸在缓冲剂和/或表面活性剂存在下混合一段设定的时间(例如15分钟、20分钟、25分钟、30分钟等)；
b.使用淬灭溶液淬灭样品；
c.使用质谱仪分析淬灭样品；
d.制成校准曲线；
e.将淬灭样品的分析(例如质谱)与校准曲线进行比较。
多种组合物和方法的操作可以根据以下非限制性实例来进一步了解，所述实例不应视为以任何方式限制申请者的教示内容的范围。
范例
实例1：DBS样品
在本发明实例中利用从新生儿筛选程序得到的具有干血斑(Dried Blood Spot，DBS)的滤纸。从滤纸上移出3mm直径的圆片并且使用50μL“试剂1”将这个圆片上的血液样品加入到1.5mL埃彭多夫管(Eppendorf tube)中。“试剂1”是通过将3体积的双蒸水、3体积的250mM K2HPO4、2体积的1％分子生物学用皂角苷、1体积的7.5mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和1体积的10mM葡萄糖-6-磷酸混合来调配的。密封埃彭多夫管，并且在温和混合后，在37℃下将所述管放入培育箱中30分钟。通过加入100μL1∶1乙腈∶甲醇(LC-MS级)混合物来淬灭反应物。离心后，用240μL20mM丁基-二甲基-碳酸氢铵(Butyl-Dimethyl-Ammonium Bicarbonate，BDMAB)的水溶液稀释10μL澄清上清液。
将2μL这种溶液注射到LC/MS/MS系统中，所述系统包括配备有Phenomenex C18柱的Agilent1200LC系统和配备有TIS探针的AB Sciex API4000TM串联质谱仪。通过将样品注射到保持50℃下的柱上来进行液相色谱法并且以等度模式用300μL/min的LC洗脱剂(20mM BDMAB+3％MetOH)流动2.5分钟。在MRM、负离子模式中，使用TIS，在-4500伏特下并且使用350℃标称枪温来操作质谱仪。所利用的转变如下：
对于葡萄糖-6-磷酸，259.2＞79.0，其中DP：-60V和CE：-70eV
对于6-磷酸葡萄糖酸，275.2＞79.0，其中DP：-60V和CE：-70eV
对于NADP，742.1＞79.0，其中DP：-80V和CE：-130eV。
在“Quant”或“MultiQuant”模式中，将对应于转变275.2＞79.0和259.2＞79.0的痕迹分别处理成分析物(6-磷酸葡萄糖酸)和内部标准物(G6P)。如实例2中所描述，将所获得的比率与使用市售G6PDH获得的校准曲线进行比较。
使用监测NADP的转变742.1＞79.0作为用于假阳性结果的内部检查，因为酶缺乏将伴有高NADP信号。因此，虽然6-磷酸葡萄糖酸和NADP的痕迹都很小或不存在，但仍将结果视为假的。
图1示出了从干血样品得到的MRM中的示范性质谱仪读数，显示G6P、6-磷酸葡萄糖酸以及NADP的水平。图1代表G6PDH的正常水平。图2将正常样品与不具有G6PDH活性的样品进行比较。
实例2：酶校准
用50％双蒸水、30％250mM K2HPO4以及20％的1％分子生物学用皂角苷的溶液溶解市售酶标准物(例如西格玛G5885号(Sigma#G5885))，获得100毫单位/毫升。在1.5mL埃彭多夫管中，将0、1、2、4、10、20以及40μL这种溶液(对应于0、0.1、0.2、0.4、1.0、2.0以及4.0毫单位的酶)加入到50μL“试剂1”(实例1中所描述)中。密封埃彭多夫管，并且在温和混合后，在37℃下将所述管放入培育箱中30分钟。通过加入100μL1∶1乙腈∶甲醇(LC-MS级)混合物来淬灭反应物。离心后，用240μL20mM丁基-二甲基-碳酸氢铵(BDMAB)的水溶液稀释10μL澄清上清液。如实例1中一样，将2μL这种溶液注射到LC/MS/MS系统中。在“Quant”或“MultiQuant”模式中，将对应于转变275.2＞79.0和259.2＞79.0的痕迹分别处理成“分析物”和“内部标准物”。通过以毫单位表示的绝对读数对试样进行定量评估并且参考打孔圆片上血液的量(3.1μL)。作为参照，正常保留约3毫单位/DBS的酶活性。结果示于下表2中。
表2
0.0mU 0.1mU 0.2mU 0.4mU 1.0mU 2.0mU 4.0mU
预期浓度 0.000000 0.100000 0.200000 0.400000 1.000000 2.000000 4.000000
测试编号 3 3 3 3 3 3 0
平均值 0.000 0.102329 0.162332 0.359533 0.936305 2.043591 N/A
标准偏差 0.000 0.004045 0.011148 0.006903 0.033458 0.024109 N/A
％CV N/A 3.952955 6.867237 1.920072 3.573362 1.179734 N/A
精确度 N/A 102.329354 81.165960 89.883345 93.630452 102.179570 N/A
基于所取样的实际血液体积，这些方法的可检测性似乎是正常样品的平均酶活性的约1/300。已观察到多达约3-4毫单位/斑点的线性度(参见图3)，但必要时可以通过缩短培育时间来延长线性度。
实例3：干血样品的分析
利用来自医院中的常规分析并且根据地方伦理委员会指南(local ethical committeeguideline)预先收集并使用的不记名过量样品来组织相关性研究。将血液样品点渍于格思里卡(Guthrie card)上，干燥并且送去进行LC/MS/MS测量。如上文实例1所描述，通过LC/MS/MS进行分析。作为参照，如在常规医院实验室中所实施，使用宝维森试剂盒(BioVision Kit)(目录号K757-100，来自美国加利福尼亚州94043山景城琳达维斯塔大道980号的宝维森研究产品公司(BioVision Research Products，980Linda Vista Avenue，Mountain View，CA94043USA))预先测量样品。
图4A和4B示出了从两个干血样品得到的MRM中的两个示范性质谱仪读数，其表示如通过宝维森试剂盒(BV)测量的高G6PDH活性和低G6PDH活性。由这些图可见，LC-MS/MS能够测量高G6PDH活性和低G6PDH活性。因为不存在可用于两种分析的均质校准，所以使用呈现极端活性值的上述样品生成LC-MS/MS分析的校准曲线。用作LC-MS/MS的标准物的校准示于图5中。
从样品分析得到的结果提供于表3中，表3还提供一系列使用BV试剂盒所获得的值。对于LC/MS/MS和BV试剂盒，G6PDH活性都以毫单位/毫升(mU/mL)表示，其中对于LC/MS/MS来说未针对血色素进行标准化。
表3
Figure BDA00003245084200151
*样品n8、n10以及n17被视为低活性样品。
图6A和6B描绘了从当作未知物的两个干血样品得到的MRM中的两个示范性质谱仪读数。这些读数表示低G6PDH活性和高G6PDH活性，其中LC/MS/MS分析分别给出了40和1202毫单位/毫升的测量值，并且BV分析分别给出了20和1230mU/mL的测量值。另外，图7A和7B是使用本发明研究中所测量的值生成的相关性图和布兰德-阿尔特曼图(测量两种临床测量方法之间的一致性)。由上述资料和图可见，在使用LC/MS/MS所获得的值与使用BV试剂盒所获得的值之间存在良好一致性，尤其对于低活性样品来说。
等效物
所属领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文所描述的教示内容的具体实施例的等效物。所述等效物打算涵盖于以下权利要求书中。

Claims (27)

1.一种检测生物样品中G6PDH的量的高产量方法，所述方法包括：
使生物样品与G6P和NADP在表面活性剂和缓冲剂存在下在合适的条件下反应，形成6-磷酸葡萄糖酸；
淬灭所述生物样品，形成淬灭样品；以及
通过质谱分析来检测所述淬灭样品中6-磷酸葡萄糖酸的存在或量，
其中所述淬灭样品中6-磷酸葡萄糖酸的量与所述生物样品中G6PDH的量相关。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述淬灭是使用酶变性剂来实现的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述质谱分析是串联质谱分析。
4.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述质谱分析是使用配备有热辅助型电喷雾电离探针的质谱仪来实现的。
5.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述质谱分析是使用配备有逆相液相色谱柱的质谱仪来实现的。
6.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述检测在约5分钟内进行。
7.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述检测在约3分钟内进行。
8.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述方法允许检测约0.01毫单位或更少的G6PDH。
9.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述检测实质上不受温度波动所影响。
10.一种检测个体的G6PDH缺乏的方法，所述方法包括：
通过质谱分析来测定从个体得到的生物样品中G6PDH的量；以及
将所述生物样品中G6PDH的量与适当对照值进行比较，
其中当所述样品中G6PDH的量小于所述适当对照值时检测到G6PDH缺乏。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述个体是新生儿或婴儿。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述个体是孕妇。
13.根据权利要求10到12中任一权利要求所述的方法，其中所述样品中G6PDH的量比所述对照值小10％指示所述个体的G6PDH缺乏。
14.根据权利要求10到13中任一权利要求所述的方法，其中所述样品中G6PDH的量比所述对照值小25％指示所述个体的G6PDH缺乏。
15.根据权利要求10到14中任一权利要求所述的方法，其中所述样品中G6PDH的量比所述对照值小50％指示所述个体的G6PDH缺乏。
16.一种诊断个体的急性溶血性贫血的方法，所述方法包括：
根据权利要求10所述的方法检测个体的G6PDH缺乏，
其中所述个体的G6PDH缺乏指示所述个体的急性溶血性贫血。
17.根据权利要求16所述的方法，其中样品中G6PDH的量比对照值小25％指示所述个体的急性溶血性贫血。
18.一种诊断个体的子痫前期的方法，所述方法包括：
根据权利要求10所述的方法检测个体的G6PDH缺乏，
其中所述个体的G6PDH缺乏指示所述个体的子痫前期。
19.根据权利要求18所述的方法，其中样品中G6PDH的量比对照值小25％指示所述个体的子痫前期。
20.一种用于个体的由子痫前期或急性溶血性贫血引起的死亡率和/或发病率增加的预后方法，其包括：
根据权利要求10所述的方法检测个体的G6PDH缺乏，
其中生物样品中G6PDH的量比所述对照值小50％或更小指示所述个体的死亡率和/或发病率增加的预后。
21.根据权利要求10到20中任一权利要求所述的方法，其中所述适当对照值是基于正常群体中的G6PDH水平的对照值。
22.根据权利要求10到21中任一权利要求所述的方法，其进一步包括：
使所述生物样品与G6P和NADP在表面活性剂和缓冲剂存在下在合适的条件下反应，形成6-磷酸葡萄糖酸；
淬灭所述生物样品，形成淬灭样品；以及
通过质谱分析来检测所述淬灭样品中6-磷酸葡萄糖酸的存在或量，
其中所述淬灭样品中6-磷酸葡萄糖酸的量与所述生物样品中G6PDH的量相关。
23.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述生物样品是干血样品。
24.一种检测生物样品中G6PDH的量的试剂盒，所述试剂盒包含：
葡萄糖-6-磷酸，
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，
任选地缓冲剂，
任选地表面活性剂，以及
关于制备促进烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、葡萄糖-6-磷酸和G6PDH的反应的反应混合物的说明书。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其进一步包含酶变性剂。
26.根据权利要求24或25所述的试剂盒，其进一步包含关于制备用于在质谱仪上分析的样品的说明书。
27.根据权利要求24到26中任一权利要求所述的试剂盒，其进一步包含校准曲线，所述校准曲线包含[6-磷酸葡萄糖酸/葡萄糖-6-磷酸面积]相对于G6PDH的毫单位数的图。
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