JP2022525276A - 複数の分析物の同時分析 - Google Patents

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Abstract

【課題】複数の分析物の同時分析に関する。【解決手段】 変性、標準化、抽出、混合モード液体クロマトグラフィーおよび質量分析を含むステップを実施することによって、単一の試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性またはレベルを同時に決定することができる方法、装置およびシステムを記載し、それによって、単一の試料中の分析物の存在、同一性またはレベルが決定される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／８２５，６１０号の利益を主張し、この出願は、すべての目的のために参照により本明細書に完全に組み込まれる。
分析化学の常識では、生体分子内に見られる化学物質多様性は広大であり、大きすぎて単一の方法を使用して研究することができない。したがって、主に均質な生体分子のサブセットの分析に力が注がれてきた。これらの方法の中で、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ）は、これらの分析の多くで不可欠な分析プラットフォームとして浮上し、多くの小分子および高分子の特性評価に使用されている。この汎用性にもかかわらず、ＬＣ－ＭＳは依然として一般的に単一のクラスの生化学物質の分析に使用されている。マルチオミクス研究において生体情報の異なる層を組み合わせることへの関心が高まっている。マルチオミクスは、ゲノミクス、エピゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、グライコプロテオミクス、グライコミクス、リピドミクス、メタボロミクス、フラクソミクス、イオノミクス、マイクロバイオミクス、フェノミクス、メタロミクス、およびエクスポソミクスなどの様々な分析を１つのプラットフォームに統合する機会を提供する。しかしながら、これらの方法は、計算方法を使用して別個のデータセットを統合することを目的としており、データ取得の前にこれらの異なるクラスの分析物を組み合わせる可能性は検討されないままである。
本発明が対象とするのは、多様な生体分子の組み合わせ分析を単一の機器の実行へと実行するための能力を目的とするものである。
一態様では、方法は、単一の試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性または量を実質的に同時に決定するために提供され、この方法は、
ａ．試料中の生体高分子を変性させる変性試薬または処理で試料を処理し、それによって変性試料を形成することであって、変性試薬または処理は、標準化試薬に加えられたときに標準化試薬の成分を変性させない、形成することと、
ｂ．変性試料を標準化試薬で処理することであって、標準化剤は、変性試料中の複数の分析物を、標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種に変換し、これらの種は、複数モードのクロマトグラフィーによって分離され、質量分析によって個別に同定されることができ、それによって標準化された試料を形成する、処理することと、
ｃ．標準化された試料を抽出試薬で処理し、内部に可溶性分析物種および分析物フラグメント種を保持し、それによって抽出された試料を形成することと、
ｄ．抽出された試料を、複数モードのクロマトグラフィー、続いて質量分析（ＭＳ）に供し、それによって、内部に存在する各標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種についてのそこからのデータが生成されることと、
ｅ．抽出された試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性またはレベルをデータから計算的に決定することと、を含む。
単一の試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性または量を実質的に同時に決定するための方法のいくつかの実施形態では、複数の分析物は、化学的に関連する分析物および化学的に関連しない分析物を含む。いくつかの実施形態では、分析物は、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、電解質、金属、代謝産物、揮発性化合物、外因性化学物質、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、分析物は、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、電解質、金属、小分子、揮発性化合物、外因性化学物質、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、試料は生物試料である。いくつかの実施形態では、試料は、全血、血漿、血清、尿、糞便、脳脊髄液、唾液、汗、唾液、細胞または組織試料である。いくつかの実施形態では、試料は、水溶液、水性懸濁液または水性組織を含む。いくつかの実施形態では、試料は、ステップ（ａ）の前または最中にホモジナイズされ得る。いくつかの実施形態では、変性試薬または処理は、１つ以上の溶媒、１つ以上のカオトロピック剤、熱、圧力、照射、１つ以上の参照標準、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、溶媒は、メタノール、エタノールまたはアセトニトリルであり得る。いくつかの実施形態では、溶媒はメタノールである。いくつかの実施形態では、水性試料は、ほぼ等量のメタノール中でホモジナイズされる。いくつかの実施形態では、変性試薬または処理は、金属キレート化剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、金属キレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたはＤＭＳＡである。いくつかの実施形態では、金属キレート剤はＥＤＴＡである。いくつかの実施形態では、変性ステップおよび変性試料を標準化試薬で処理することは、実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、標準化試薬は、試料中の生体高分子を解重合する１つ以上の酵素を含む。いくつかの実施形態では、標準化試薬は膵臓内部溶解酵素（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｎｄｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）を含む。いくつかの実施形態では、標準化試薬は、１つ以上のプロテイナーゼ、１つ以上のヌクレアーゼ、１つ以上のグリコシダーゼ、１つ以上のリパーゼ、１つ以上のキレート剤、１つ以上の緩衝剤、１つ以上の還元剤、１つ以上の誘導体化剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、誘導体化剤はヨードアセトアミドである。いくつかの実施形態では、標準化試薬はトリプシンを含む。いくつかの実施形態では、標準化試薬は、トリプシン、リボヌクレアーゼＡ、ＥＤＴＡ、重炭酸アンモニウムまたはアミラーゼを含む。いくつかの実施形態では、標準化試薬がＤＮＡｓｅ Ｉを含む場合、ＥＤＴＡは同時に存在しない。いくつかの実施形態では、プロテイナーゼは、変性試料の標準化試薬の他の成分とのインキュベーションと同時にまたはその後に変性試料に加えられる。いくつかの実施形態では、標準化剤で処理することは、約３７℃の温度で０～約２４時間のインキュベーションを含む。いくつかの実施形態では、抽出試薬は、標準化された試料に１：１（ｖ／ｖ）で加えられる。いくつかの実施形態では、抽出試薬は、アセトニトリルおよびアセトンを含む。いくつかの実施形態では、アセトニトリルおよびアセトンは、１：１（ｖ／ｖ）で存在する。いくつかの実施形態では、内部に可溶性種を保持することは、遠心分離または濾過によって達成される。いくつかの実施形態では、複数モードのクロマトグラフィーは、逆相分離、陽イオン交換分離、陰イオン交換分離、イオン対分離、順相分離、イオン移動度分離、サイズ排除分離、キラル分離、アフィニティー分離、配位子交換分離、極性非イオン分離、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、１つ以上のイオン化付加物をさらに含む。いくつかの実施形態では、イオン化付加物は、アンモニウム、プロトン、ナトリウム、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、メドロネート、尿素、ビウレット、トリウレット、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、質量分析データ取得は、正および負のイオンモードの両方で動的排除を伴う、低または高解像度のＭＳ２データ非依存性またはデータ依存性取得を伴う高解像度フルスキャンを含む。いくつかの実施形態では、抽出された試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性または量をＬＣ－ＭＳデータから計算的に決定することは、標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種のＬＣ－ＭＳデータを、既知量の既知の分析物から生成されたそれらの種の質量分析と比較することを含む。
一態様では、方法は、単一の生物試料中に存在する複数の、化学的に関連する分析物および化学的に関連しない分析物の存在、同一性または量を実質的に同時に決定するために提供され、この試料は水性試料であり、この方法は、
ａ．試料をメタノールを含む等量の変性試薬で処理することであって、変性剤は試料中の生体高分子を変性させ、それによって変性試料を形成し、変性試薬または処理は、標準化試薬に加えられたときに標準化試薬の成分を変性させない、処理することと、
ｂ．変性試料を、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１：２０ｍ／ｍのトリプシン：試料タンパク質を含む標準化試薬で、ｐＨ７．８、３７℃で４時間処理することであって、標準化剤は、変性試料中の複数の分析物を、標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種に変換し、これらの種は、複数モードのクロマトグラフィーによって分離され、質量分析によって個別に同定されることができ、それによって標準化された試料を形成する、処理することと、
ｃ．標準化された試料を、１：１のアセトニトリル：アセトンを含む等量の抽出試薬で処理し、試料を遠心分離し、内部に可溶性分析物種および分析物フラグメント種を含む上清を保持し、それによって抽出された試料を形成することと、
ｄ．抽出された試料を、複数モードのクロマトグラフィー、続いて質量分析（ＭＳ）に供し、それによって、内部に存在する各標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種についてのそこからのデータが生成されることと、
ｅ．抽出された試料中に存在する複数の分析物の存在、量または同一性をデータから計算的に決定することと、を含む。
一態様では、生物試料が由来する生体源の病的状態を決定するための方法は、
ａ．上記の方法に従って、生物試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性または量を実質的に同時に決定することと、
ｂ．内部の分析物の存在、同一性または量を、当該病状を伴わない生体源試料からの生物試料のものと比較することであって、病的状態は、複数の分析物の存在、同一性またはレベルの変化から同定可能である、比較することと、
ｃ．当該生体源の病的状態を決定することと、を含む。
生体源の病的状態を決定するための方法のいくつかの実施形態では、病的状態を決定することからの結果を使用して、生体源への介入を選択またはモニターする。
一態様では、装置は、単一の試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性または量を実質的に同時に決定するために提供され、この装置は、
ａ．試料中の生体高分子を変性させ、それによって変性試料を形成するための手段であって、この変性は、標準化試薬に加えられたときに標準化試薬の成分を変性させない、手段と、
ｂ．試料を標準化するための手段であって、変性試料中の複数の分析物は、標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種に変換され、これらの種は、複数モードのクロマトグラフィーによって分離され、質量分析によって個別に同定されることができる、手段と、
ｃ．標準化された試料を抽出し、内部に可溶性分析物種および分析物フラグメント種を保持するための手段と、
ｄ．抽出された試料を、複数モードのクロマトグラフィー、続いて質量分析（ＭＳ）に供するための手段であって、それによって、内部に存在する各標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種についてのそこからのデータが生成される、手段と、
ｅ．抽出された試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性または量をデータから計算的に決定するための手段と、を含む。
装置のいくつかの実施形態では、複数の分析物は、化学的に関連する分析物および化学的に関連しない分析物を含む。いくつかの実施形態では、分析物は、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、電解質、金属、小分子、揮発性化合物、外因性化学物質、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、試料は生物試料である。いくつかの実施形態では、試料は、全血、血漿、血清、尿、糞便、脳脊髄液、唾液、汗、唾液、細胞または組織試料である。いくつかの実施形態では、試料は、水溶液、水性懸濁液または水性組織を含む。いくつかの実施形態では、試料をホモジナイズするための手段は、ステップ（ａ）の前または最中に提供される。いくつかの実施形態では、試料中の生体高分子を変性させるための手段は、１つ以上の溶媒、１つ以上のカオトロピック剤、熱、圧力、照射、１つ以上の参照標準、もしくはそれらの任意の組み合わせを含む、変性試薬または処理の使用を含む。いくつかの実施形態では、溶媒は、メタノール、エタノールまたはアセトニトリルである。いくつかの実施形態では、溶媒はメタノールである。いくつかの実施形態では、水性試料は、ほぼ等量のメタノール中でホモジナイズされる。いくつかの実施形態では、変性させることは、金属キレート化をさらに含む。いくつかの実施形態では、金属キレート化は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたはＤＭＳＡによって提供される。いくつかの実施形態では、金属をキレート化することは、ＥＤＴＡによって提供される。いくつかの実施形態では、変性させることおよび標準化することは、実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、標準化することは、試料中の生体高分子を解重合する１つ以上の酵素を含む標準化試薬を使用して達成される。いくつかの実施形態では、標準化試薬は膵臓内部溶解酵素を含む。いくつかの実施形態では、標準化試薬は、１つ以上のプロテイナーゼ、１つ以上のヌクレアーゼ、１つ以上のグリコシダーゼ、１つ以上のリパーゼ、１つ以上のキレート剤、１つ以上の緩衝剤、１つ以上の還元剤、１つ以上の誘導体化剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、誘導体化剤はヨードアセトアミドである。いくつかの実施形態では、標準化試薬はトリプシンを含む。いくつかの実施形態では、標準化試薬は、トリプシン、リボヌクレアーゼＡ、ＥＤＴＡ、重炭酸アンモニウムまたはアミラーゼを含む。いくつかの実施形態では、標準化試薬がＤＮＡｓｅ Ｉを含む場合、ＥＤＴＡは同時に存在しない。いくつかの実施形態では、プロテイナーゼは、変性試料の標準化試薬の他の成分とのインキュベーションと同時にまたはその後に変性試料に加えられる。いくつかの実施形態では、標準化する手段は、約３７℃の温度で０～約２４時間のインキュベーションを含む。いくつかの実施形態では、抽出するための手段は、標準化された試料に１：１（ｖ／ｖ）で加えられた抽出試薬を使用して達成される。いくつかの実施形態では、抽出試薬は、アセトニトリルおよびアセトンを含む。いくつかの実施形態では、アセトニトリルおよびアセトンは、１：１（ｖ／ｖ）で存在する。いくつかの実施形態では、内部に可溶性種を保持するための手段は、遠心分離または濾過によって達成される。いくつかの実施形態では、複数モードのクロマトグラフィーのための手段は、逆相分離、陽イオン交換分離、陰イオン交換分離、イオン対分離、順相分離、イオン移動度分離、サイズ排除分離、キラル分離、アフィニティー分離、配位子交換分離、極性非イオン分離、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーで使用される移動相は、１つ以上のイオン化付加物をさらに含む。いくつかの実施形態では、イオン化付加物は、アンモニウム、プロトン、ナトリウム、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、メドロネート、尿素、ビウレット、トリウレット、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、質量分析データ取得は、正および負のイオンモードの両方で動的排除を伴う、低または高解像度のＭＳ２データ非依存性またはデータ依存性取得を伴う高解像度フルスキャンを含む。いくつかの実施形態では、抽出された試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性または量をＬＣ－ＭＳデータから計算的に決定するための手段は、標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種のＬＣ－ＭＳデータを、既知量の既知の分析物から生成されたそれらの種の質量分析と比較することを含む。
一態様では、生物試料が由来する生体源の状態を決定するための方法は、
ａ．上記の装置を使用して、生物試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性または量を実質的に同時に決定することと、
ｂ．内部の分析物の存在、同一性または量を、当該病状を伴わない生体源試料からの生物試料のものと比較することであって、病的状態は、複数の分析物の存在、同一性または量の変化から同定可能である、比較することと、
ｃ．当該生体源の病的状態を決定することと、を含む。
直前の段落の方法のいくつかの実施形態では、状態を決定することは、生体源への介入を選択またはモニターするために使用される。
一態様では、システムは、単一の試料中に存在する複数の、化学的に関連する分析物および化学的に関連しない分析物の存在、同一性または量を実質的に同時に決定するために提供され、このシステムは、
ａ．試料中の生体高分子を変性させ、それによって変性試料を形成する変性試薬または処理であって、変性試薬または処理は、標準化試薬に加えられたときに標準化試薬の成分を変性させない、変性試薬または処理と、
ｂ．試料中の複数の分析物を、混合モード液体クロマトグラフィーによって分離され、タンデム質量分析によって個別に同定されることができる、標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種に変換する、標準化試薬と、
ｃ．可溶性分析物種および分析物フラグメント種を抽出する抽出試薬と、
ｄ．内部に可溶性分析物種および分析物フラグメント種を保持し、それによって抽出された試料を形成するための分離行程と、
ｅ．可溶性分析物種および分析物フラグメント種を分解する複数モードのクロマトグラフィーと、
ｆ．個々の種に関するデータを生成する質量分析と、
ｇ．各標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種のデータから、試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性またはレベルを計算的に決定するための１つ以上のアルゴリズムと、を含む。
システムのいくつかの実施形態では、複数の分析物は、化学的に関連する分析物および化学的に関連しない分析物を含む。いくつかの実施形態では、分析物は、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、電解質、金属、小分子、揮発性化合物、外因性化学物質、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、試料は生物試料である。いくつかの実施形態では、試料は、全血、血漿、血清、尿、糞便、脳脊髄液、唾液、汗、唾液、細胞または組織試料である。いくつかの実施形態では、試料は、水溶液、水性懸濁液または水性組織を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の前または最中に、試料はホモジナイズされる。いくつかの実施形態では、変性試薬または処理は、１つ以上の溶媒、１つ以上のカオトロピック剤、熱、圧力、照射、１つ以上の参照標準、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、溶媒は、メタノール、エタノールまたはアセトニトリルである。いくつかの実施形態では、溶媒はメタノールである。いくつかの実施形態では、水性試料は、ほぼ等量のメタノール中でホモジナイズされる。いくつかの実施形態では、変性試薬または処理は、金属キレート化剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、金属キレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたはＤＭＳＡである。いくつかの実施形態では、金属キレート剤はＥＤＴＡである。いくつかの実施形態では、変性ステップおよび変性試料を標準化試薬で処理することは、実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、標準化試薬は、試料中の生体高分子を解重合する１つ以上の酵素を含む。いくつかの実施形態では、標準化試薬は膵臓内部溶解酵素を含む。いくつかの実施形態では、標準化試薬は、１つ以上のプロテイナーゼ、１つ以上のヌクレアーゼ、１つ以上のグリコシダーゼ、１つ以上のリパーゼ、１つ以上のキレート剤、１つ以上の緩衝剤、１つ以上の還元剤、１つ以上の誘導体化剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、誘導体化剤はヨードアセトアミドである。いくつかの実施形態では、標準化試薬はトリプシンを含む。いくつかの実施形態では、標準化試薬は、トリプシン、リボヌクレアーゼＡ、ＥＤＴＡ、重炭酸アンモニウムまたはアミラーゼを含む。いくつかの実施形態では、標準化試薬がＤＮＡｓｅ Ｉを含む場合、ＥＤＴＡは同時に存在しない。いくつかの実施形態では、プロテイナーゼは、変性試料の標準化試薬の他の成分とのインキュベーションと同時にまたはその後に変性試料に加えられる。いくつかの実施形態では、標準化剤で処理することは、約３７℃の温度で０～約２４時間のインキュベーションを含む。いくつかの実施形態では、抽出試薬は、標準化された試料に１：１（ｖ／ｖ）で加えられる。いくつかの実施形態では、抽出試薬は、アセトニトリルおよびアセトンを含む。いくつかの実施形態では、アセトニトリルおよびアセトンは、１：１（ｖ／ｖ）で存在する。いくつかの実施形態では、内部に可溶性種を保持することは、遠心分離または濾過によって達成される。いくつかの実施形態では、複数モードのクロマトグラフィーは、逆相分離、陽イオン交換分離、陰イオン交換分離、イオン対分離、順相分離、イオン移動度分離、サイズ排除分離、キラル分離、アフィニティー分離、配位子交換分離、極性非イオン分離、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーで使用される移動相は、１つ以上のイオン化付加物をさらに含む。いくつかの実施形態では、イオン化付加物は、アンモニウム、プロトン、ナトリウム、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、メドロネート、尿素、ビウレット、トリウレット、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、質量分析データ取得は、正および負のイオンモードの両方で動的排除を伴う、低または高解像度のＭＳ２データ非依存性またはデータ依存性取得を伴う高解像度フルスキャンを含む。いくつかの実施形態では、抽出された試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性または量をＬＣ－ＭＳデータから計算的に決定することは、標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種のＬＣ－ＭＳデータを、既知量の既知の分析物から生成されたそれらの種の質量分析と比較することを含む。
一態様では、生物試料が由来する生体源の病的状態を決定するための方法は、
ａ．上記のシステムに従って、生物試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性または量を実質的に同時に決定することと、
ｂ．内部の分析物の存在、同一性または量を、当該病状を伴わない生体源試料からの生物試料のものと比較することであって、病的状態は、複数の分析物の存在、同一性または量の変化から同定可能である、比較することと、
ｃ．当該生体源の病的状態を決定することと、を含む。
直前の段落の方法のいくつかの実施形態では、病的状態は、生体源への治療的介入を選択またはモニターするために使用される。
一態様では、本開示は、試料から異なるタイプの複数の分析物を同定するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）異なるタイプの複数の分析物を含有するか、または含有することが疑われる試料を、複数の分析物またはそれらの誘導体を含む溶液を生成するのに十分な条件に供することと、
（ｂ）機器を使用して溶液を処理して、複数の分析物またはそれらの誘導体を同定し、それによって複数の分析物を同定し、複数の分析物またはそれらの誘導体は、機器の単一の実行で同定されることと、を含む。
上記または本明細書の他の箇所に記載の試料から異なるタイプの複数の分析物を同定するための方法のいくつかの実施形態では、複数の分析物は、タンパク質、核酸、小分子、脂質、炭水化物、電解質、および金属からなる群から選択される分析物のうちの少なくとも３つのタイプを含む。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、小分子、脂質、および炭水化物から選択される分析物のうちの少なくとも１つのタイプと、タンパク質、核酸、電解質、および金属から選択される分析物のうちの少なくとも２つのタイプと、を含む。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、タンパク質、および核酸から選択される分析物のうちの少なくとも１つのタイプと、小分子、脂質、および炭水化物から選択される分析物のうちの少なくとも２つのタイプと、を含む。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、小分子、脂質、およびタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、小分子、脂質、炭水化物、およびタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、小分子、脂質、炭水化物、および電解質を含む。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、小分子、脂質、炭水化物、電解質、および金属を含む。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、タンパク質および核酸の一方または両方をさらに含む。いくつかの実施形態では、小分子は、内因性小分子、外因性小分子、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、外因性化学物質を含む。いくつかの実施形態では、複数の分析物のうちの少なくとも１つは揮発性化合物である。
上記または本明細書の他の箇所に記載の試料から異なるタイプの複数の分析物を同定するための方法のいくつかの実施形態では、溶液中の複数の分析物またはそれらの誘導体は、試料に含有されるか、または含有されることが疑われる複数の分析物とは異なる分子サイズまたは質量の分布を有する。いくつかの実施形態では、溶液中の複数の分析物またはそれらの誘導体は、試料に含有されるか、もしくは含有されることが疑われる複数の分析物とは異なる、荷電分子の量、親水性分子の量、疎水性官能基を有する分子の量、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、溶液中の複数の分析物またはそれらの誘導体は、試料に含有されるか、または含有されることが疑われる複数の分析物よりも、所定の範囲に収まる分子の大きな質量パーセントを有する。いくつかの実施形態では、溶液中の複数の分析物またはそれらの誘導体は、試料に含有されるか、または含有されることが疑われる複数の分析物よりも狭い分子サイズまたは質量の分布を有する。いくつかの実施形態では、溶液中の複数の分析物またはそれらの誘導体は、試料に含有されるか、または含有されることが疑われる複数の分析物よりも、荷電分子の大きな質量パーセントを有する。いくつかの実施形態では、溶液中の複数の分析物またはそれらの誘導体は、試料に含有されるか、または含有されることが疑われる複数の分析物よりも、オクタノール－水分配係数で測定した際に、親水性分子の大きな質量パーセントを有する。いくつかの実施形態では、溶液中の複数の分析物またはそれらの誘導体は、試料に含有されるか、または含有されることが疑われる複数の分析物よりも狭い質量対電荷比（ｍ／ｚ）の分布を有し、その結果、溶液中の複数の分析物またはそれらの誘導体は、試料に含有されるか、または含有されることが疑われる複数の分析物よりも、質量分析によって検出可能な範囲に収まる分子の大きな質量パーセントを有する。いくつかの実施形態では、質量分析によって検出可能な範囲は、１００ダルトン／電子電荷（Ｄａ／ｅ）～２，０００Ｄａ／ｅである。いくつかの実施形態では、溶液中の複数の分析物またはそれらの誘導体は、各々、１５ダルトン／電子電荷（Ｄａ／ｅ）～４，０００Ｄａ／ｅの質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有する。
上記または本明細書の他の箇所に記載の試料から異なるタイプの複数の分析物を同定するための方法のいくつかの実施形態では、（ａ）は、処理された試料を得るために、以下の、（ｉ）試料をホモジナイズすることと、（ｉｉ）試料を変性剤と接触させ、それによって複数の分析物のうちの少なくとも１つのコンフォメーションを変化させることと、（ｉｉｉ）試料をキレート剤と接触させ、それによって複数の分析物のうちの少なくとも１つとキレート錯体を形成することと、（ｉｖ）試料を誘導体化剤と接触させ、それによって複数の分析物のうちの少なくとも１つの誘導体を形成することと、（ｖ）試料を還元剤と接触させ、それによって複数の分析物のうちの少なくとも１つを修飾することと、（ｖｉ）試料を酵素と接触させ、それによって複数の分析物のうちの少なくとも１つのフラグメントを生成することと、のうちの１つまたは任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、（ｉｉｉ）は１回以上行われる。いくつかの実施形態では、（ｖｉ）は１回以上行われる。いくつかの実施形態では、（ｉ）は、（ｉｉ）の前または実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）は（ｉｉｉ）と実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）は、（ｖｉ）の前または実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｖｉ）は、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）のうちの１つ以上と実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｖｉ）は（ｉｖ）と実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｖｉ）は、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）と実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｉｉｉ）は少なくとも２回、１回は（ｉ）と実質的に同時に、および再度（ｖｉ）と実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｖｉ）は少なくとも２回、１回は（ｉｉ）と実質的に同時に、および再度（ｉｖ）と実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）と実質的に同時に行われる（ｖｉ）で使用される酵素はプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、（ｉ）は、１：５～５：１の体積比で水およびメタノールの混合物中で実施される。いくつかの実施形態では、変性剤は、溶媒、カオトロピック剤、および参照標準を含む。いくつかの実施形態では、溶媒は、メタノール、エタノール、およびアセトニトリルから選択される。いくつかの実施形態では、溶媒はメタノールである。いくつかの実施形態では、キレート剤は、（ｉｉｉ）の各存在とは独立して、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、およびジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡである。いくつかの実施形態では、誘導体化剤はペプチドアルキル化剤である。いくつかの実施形態では、誘導体化剤はヨードアセトアミドである。いくつかの実施形態では、酵素は、（ｖｉ）の各存在とは独立して、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、およびリパーゼからなる群から選択される１つまたは任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、グリコシダーゼはアミラーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはトリプシンである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＤＮＡｓｅ ＩおよびリボヌクレアーゼＡの一方または両方を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡｓｅ ＩおよびＥＤＴＡは、（ｖｉ）において同時に存在しない。いくつかの実施形態では、（ｖｉ）は、重炭酸アンモニウム緩衝液中で実施される。いくつかの実施形態では、（ｖｉ）は、約３７℃で約２４時間以下インキュベートすることを含む。
上記または本明細書の他の箇所に記載の試料から異なるタイプの複数の分析物を同定するための方法のいくつかの実施形態では、（ａ）は、処理された試料から複数の分析物またはそれらの誘導体を抽出試薬で抽出し、それによって溶液を得ることをさらに含む。いくつかの実施形態では、抽出することは、処理された試料に体積で１：１で抽出試薬を加えることを含む。いくつかの実施形態では、抽出試薬は、体積で１：１のアセトニトリルおよびアセトンを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）は、遠心分離または濾過によって、溶液から不溶性不純物を除去することをさらに含む。
上記または本明細書の他の箇所に記載の試料から異なるタイプの複数の分析物を同定するための方法のいくつかの実施形態では、（ｂ）は、複数の分析物またはそれらの誘導体を電子ビームに供し、それによって、複数の分析物またはその誘導体のうちの少なくとも１つの、少なくとも１つのイオン化形態またはフラグメントを生成することを含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、複数の分析物またはそれらの誘導体を、少なくとも３つの直交クロマトグラフィーモードを含む混合モードクロマトグラフィーマトリックスと接触させることをさらに含み、少なくとも３つの直交クロマトグラフィーモードの各々は、溶液から複数の分析物またはそれらの誘導体の所与のタイプを分離するように構成される。いくつかの実施形態では、直交クロマトグラフィーモードのうちの少なくとも１つは、分析物の少なくとも１つの誘導体を溶液から分離する。いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィーマトリックスは、陽イオン交換特性、陰イオン交換特性、イオン排除特性、配位子交換特性、サイズ排除特性、キラル特性、逆相特性、アフィニティー特性、親水性特性、多座特性、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも３つの特性を含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、複数の分析物およびそれらの誘導体を少なくとも３つの移動相で溶出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数の分析物およびそれらの誘導体の第１の画分は、第１の移動相によって溶出され、第１の移動相は、水および０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）を含み、複数の分析物およびそれらの誘導体の第２の画分は、第２の移動相によって溶出され、第２の移動相は、アセトニトリルおよび０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）を含み、複数の分析物およびそれらの誘導体の第３の画分は、第３の移動相によって溶出され、第３の移動相は、１：１（ｖ／ｖ）のメタノール／水、２００ｍＭの酢酸アンモニウム、およびギ酸を含む。
上記または本明細書の他の箇所に記載の試料から異なるタイプの複数の分析物を同定するための方法のいくつかの実施形態では、少なくとも３つの移動相のうちの少なくとも１つ、または第１の移動相、第２の移動相、および第３の移動相のうちの少なくとも１つは、アンモニウム、プロトン、ナトリウム、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、メドロネート、尿素、ビウレット、およびトリウレットからなる群から選択される１つ以上のイオン化付加物を含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、複数の分析物またはそれらの誘導体の各々の質量を質量分析によって決定することを含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、複数の分析物またはそれらの誘導体の各々の量を質量分析によって決定することを含む。いくつかの実施形態では、質量分析は、正および負のイオンモードの両方で動的排除を伴うか、または伴わない、データ非依存性またはデータ依存性取得によって生成される低または高解像度のフルスキャンまたはフラグメントスキャン質量分析である。いくつかの実施形態では、質量または量を決定することが、低または高解像度質量分析特性を、１つ以上の参照質量フルまたはスペクトルと比較することを含む。いくつかの実施形態では、溶液は水溶液であり、任意選択的に水混和性有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、試料は生物試料である。
一態様では、本開示は、対象における疾患または状態を決定するための方法を提供し、この方法は、（ｉ）複数の分析物の各々について同定された量を得るために、対象の単一の試料から、個別にまたは一括して、疾患または状態と関連することが知られている複数の分析物を同定することであって、複数の分析物は他のタイプの分析物を含む、同定することと、（ｉｉ）複数の差の値を得るために、複数の分析物の各々について、参照量と同定された量との間の差を決定することと、（ｉｉｉ）複数の差の値に基づいて疾患または状態を決定するために、訓練された機械学習アルゴリズムを使用することと、を含む。
上記または本明細書の他の箇所に記載の対象における疾患または状態を決定するための方法のいくつかの実施形態では、（ｉ）は、（ａ）複数の分析物を含有するか、または含有することが疑われる単一の試料を、複数の分析物またはそれらの誘導体を含む溶液を生成するのに十分な条件に供することと、（ｂ）溶液を使用して、複数の分析物またはそれらの誘導体を同定し、それによって複数の分析物を同定することと、を含む。いくつかの実施形態では、訓練された機械学習アルゴリズムは、１７０以下の訓練試料を含む複数の訓練試料を使用して訓練される。いくつかの実施形態では、訓練されたアルゴリズムは、３０以下の訓練試料を含む複数の訓練試料を使用して訓練される。いくつかの実施形態では、訓練されたアルゴリズムは、少なくとも３０の訓練試料を含む複数の訓練試料を使用して訓練される。いくつかの実施形態では、訓練された機械学習アルゴリズムは、少なくとも１７０の訓練試料を含む複数の訓練試料を使用して訓練される。いくつかの実施形態では、対象における疾患または状態を決定するための方法は、（ｉ）の前に、複数の訓練試料の各々から複数の分析物を同定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、少なくとも８０％の精度で決定される。いくつかの実施形態では、精度は少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、加齢、心血管疾患、炎症、心不全、および認知症からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）、コルチゾール、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、およびＮ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ＰｒｏＢＮＰ）、およびそれらの誘導体からなる群から選択される１つ以上の分析物を含む。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ポリペプチド、および代謝産物からなる群から選択される２つ以上の分析物を含む。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ポリペプチド、および代謝産物からなる群から選択される３つ以上の分析物を含む。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、および代謝産物を含む。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、ポリペプチド、および代謝産物を含む。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の図面の説明および本発明の詳細な説明から理解されよう。
図面の簡単な説明
本発明とみなされる主題は、本明細書の結論部分で特に指摘され、明確に特許請求される。しかしながら、本発明は、その目的、特徴、および利点とともに、構成および動作方法の両方に関して、添付の図面とともに読まれる場合、以下の詳細な説明を参照することによって最良に理解され得る。
本発明の全体的な概念を示す。 ヒト血漿で検出されたものとして提示された選択された分析物を示す。時間および強度のピーク面積を、それぞれ横軸および縦軸に示す。選択された分析物は、ナトリウム、コレステロール、フェニルアラニン、クレアチニン、フルクトサミン（および異性体）、トリグリセリド異性体（５２：２）、トリプシンアルブミンペプチド、ならびにビリルビンである。 ５回の繰り返しで５つの異なる血漿試料にわたる選択された分析物の箱ひげ図を示す。各分析物の名称を各ドットプロットの上に記載し、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓのｐ値は、試料の中央値間の差のいずれかが統計的に有意であるかどうかを示す。試料番号およびｌｏｇ１０スケールの強度のピーク面積を、それぞれ横軸および縦軸に示す。点は各試料の５回の測定値を示し、水平線はすべての繰り返しの４分位を示す。選択された分析物は、クレアチン、タウリン、尿酸、ヘモグロビンのトリプシンペプチド、血清アルブミンのトリプシンペプチド、コレステロール、ホスファチジルコリン異性体（３４：２）、およびトリグリセリド異性体（５２：２）である。 酵素なしで消化し、記載された手順に従って分析したマウス肝臓ホモジネートから得られたスペクトルを示す。時間および質量電荷比を横軸および縦軸に示し、色の輝度の増加はより高いイオン強度を表す。選択した分析物クラスのおおよその位置は、以前の観察に従って標識されている。 ＲＮａｓｅ Ａで消化し、記載された手順に従って分析したマウス肝臓ホモジネートから得られたスペクトルを示す。時間および質量電荷比を横軸および縦軸に示し、色の輝度の増加はより高いイオン強度を表す。選択した分析物クラスのおおよその位置は、以前の観察に従って標識されている。 ＲＮａｓｅ Ａおよびトリプシンで消化し、記載された手順に従って分析したマウス肝臓ホモジネートから得られたスペクトルを示す。時間および質量電荷比を横軸および縦軸に示し、色の輝度の増加はより高いイオン強度を表す。選択した分析物クラスのおおよその位置は、以前の観察に従って標識されている。 トリプシンで消化し、記載された手順に従って分析した培養ヒト肝臓がん細胞から得られたスペクトルを示す。時間および質量電荷比を横軸および縦軸に示し、色の輝度の増加はより高いイオン強度を表す。選択した分析物クラスのおおよその位置は、以前の観察に従って標識されている。 トリプシンで消化し、記載された手順に従って分析したヒト血漿から得られたスペクトルを示す。時間および質量電荷比を横軸および縦軸に示し、色の輝度の増加はより高いイオン強度を表す。選択した分析物クラスのおおよその位置は、以前の観察に従って標識されている。 トリプシンで消化し、ｏｍｎｉ－ＭＳの手順に従って分析したウシ脂肪から得られたスペクトルを示す。時間および質量電荷比を横軸および縦軸に示し、色の輝度の増加はより高いイオン強度を表す。選択した分析物クラスのおおよその位置は、以前の観察に従って標識されている。 トリプシンで消化し、ｏｍｎｉ－ＭＳの手順に従って分析した、得られたヒト尿のスペクトルを示す。時間および質量電荷比を横軸および縦軸に示し、色の輝度の増加はより高いイオン強度を表す。選択した分析物クラスのおおよその位置は、以前の観察に従って標識されている。 左パネル、代表的な血漿試料および繰り返しにわたるイオンビンの代表的なペアワイズ散布図。横軸および縦軸は、イオンビン内で見られるｌｏｇ１０の強度計数に対応する。右パネル：血漿試料および繰り返しの相関関係に基づく階層的クラスタリング。縦軸はプロファイル間の相関関係における距離であり、試料はおおよそ相関関係による最短距離に従って順序付けられる。 単一の血液試料からの各々が保持時間において質量対電荷比で測定された様々なマルチオミックに検出された分析物と、年齢（または加齢）と関連する臨床変数との間の統計的関連を示すマンハッタンプロットを示す。統計的関連の結果を、偽発見率（ＦＤＲ）閾値：＜０．２（赤色の三角形）、０．２（含める）～０．５（緑色の四角）、および≧０．５（灰色の円）でフィルタリングした。 図１２Ａのマンハッタンプロットで分析された血液試料のマルチオミックスペクトログラムを示す。０．３偽発見率（ＦＤＲ）閾値に収まる分析物を四角でマークした。 機械学習モデルの自由度を変化させながら、ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ交差検証を使用して年齢に関する一連の予測の平均絶対誤差（ＭＡＥ）を示す。 予測年齢（本明細書に記載の方法を使用）と実際の年齢とを比較することによる予測精度を示す。相関係数（ｒ）をプロットの上に示し、サンプルサイズ（ｎ）をプロットの下に示す。 単一の血液試料からの各々が保持時間において質量対電荷比で測定された様々なマルチオミックに検出された分析物と、心血管疾患（ＡｐｏＢ）と関連する臨床変数との間の統計的関連を示すマンハッタンプロットを示す。統計的関連の結果を、偽発見率（ＦＤＲ）閾値：＜０．２（赤色の三角形）、０．２（含める）～０．５（緑色の四角）、および≧０．５（灰色の円）でフィルタリングした。 図１３Ａのマンハッタンプロットで分析された血液試料のマルチオミックスペクトログラムを示す。０．３偽発見率（ＦＤＲ）閾値に収まる分析物を四角でマークした。 機械学習モデルの自由度を変化させながら、ＡｐｏＢのｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ交差検証に関する一連の予測の平均絶対誤差（ＭＡＥ）を示す。 予測されたＡｐｏＢ（本明細書に記載の方法を使用）と実際のＡｐｏＢとを比較することによる予測精度を示す。相関係数（ｒ）をプロットの上に示し、サンプルサイズ（ｎ）をプロットの下に示す。 単一の血液試料からの各々が保持時間において質量対電荷比で測定された様々なマルチオミックに検出された分析物と、心不全（ＮＴ－ＰｒｏＢＮＰ）と関連する臨床変数との間の統計的関連を示すマンハッタンプロットを示す。統計的関連の結果を、偽発見率（ＦＤＲ）閾値：：＜０．２（赤色の三角形）、０．２（含める）～０．５（緑色の四角）、および≧０．５（灰色の円）でフィルタリングした。 図１４Ａのマンハッタンプロットで分析された血液試料のマルチオミックスペクトログラムを示す。０．３偽発見率（ＦＤＲ）閾値に収まる分析物を四角でマークした。 機械学習モデルの自由度を変化させながら、ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ交差検証を使用したＮ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ＰｒｏＢＮＰ）に関する一連の予測の平均絶対誤差（ＭＡＥ）を示す。 予測されたＮＴ－ＰｒｏＢＮＰ（本明細書に記載の方法を使用）と実際のＮＴ－ＰｒｏＢＮＰとを比較することによる予測精度を示す。相関係数（ｒ）をプロットの上に示し、サンプルサイズ（ｎ）をプロットの下に示す。 単一の血液試料からの各々が保持時間において質量対電荷比で測定された様々なマルチオミックに検出された分析物と、炎症（ＣＲＰ）と関連する臨床変数との間の統計的関連を示すマンハッタンプロットを示す。統計的関連の結果を、偽発見率（ＦＤＲ）閾値：＜０．２（赤色の三角形）、０．２（含める）～０．５（緑色の四角）、および≧０．５（灰色の円）でフィルタリングした。 図１５Ａのマンハッタンプロットで分析された血液試料のマルチオミックスペクトログラムを示す。０．３偽発見率（ＦＤＲ）閾値に収まる分析物を四角でマークした。 機械学習モデルの自由度を変化させながら、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ交差検証に関する一連の予測の平均絶対誤差（ＭＡＥ）を示す。 予測されたＣＲＰ（本明細書に記載の方法を使用して）と実際のＣＲＰとを比較することによる予測精度を示す。相関係数（ｒ）をプロットの上に示し、サンプルサイズ（ｎ）をプロットの下に示す。 単一の血液試料からの各々が保持時間において質量対電荷比で測定された様々なマルチオミックに検出された分析物と、認知症と関連する臨床変数との間の統計的関連を示すマンハッタンプロットを示す。統計的関連の結果を、偽発見率（ＦＤＲ）閾値：＜０．２（赤色の三角形）、０．２（含める）～０．５（緑色の四角）、および≧０．５（灰色の円）でフィルタリングした。 図１６Ａのマンハッタンプロットで分析された血液試料のマルチオミックスペクトログラムを示す。０．３偽発見率（ＦＤＲ）閾値に収まる分析物を四角でマークした。 機械学習モデルの自由度を変化させながら、認知症と関連する臨床バイオマーカーのｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ交差検証に関する一連の予測の平均絶対誤差（ＭＡＥ）を示す。 予測された認知症と関連する臨床バイオマーカー（本明細書に記載の方法を使用して）と実際の認知症と関連する臨床バイオマーカーとを比較することによる予測精度を示す。相関係数（ｒ）をプロットの上に示し、サンプルサイズ（ｎ）をプロットの下に示す。 いくつかの実施形態による、コンピュータシステムの概略図を示す。
本主題は、本開示の一部を形成する以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。本発明は、本明細書に記載および／または示される特定の製品、方法、条件またはパラメータに限定されず、本明細書で使用される用語は、例としてのみ特定の実施形態を説明することを目的としており、特許請求された発明を限定することを意図しない。
本明細書で別段の定義がない限り、本出願に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
上記および本開示全体で用いられるように、以下の用語および略語は、特に明記しない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
本開示において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数形の参照を含み、特定の数値への参照は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、少なくともその特定の値を含む。したがって、例えば、「化合物」への言及は、当業者に知られているそのような化合物およびその同等物のうちの１つ以上への言及などである。本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、２つ以上を意味する。値の範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。
同様に、先行詞「約」を使用することにより、値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。すべての範囲は包括的かつ組み合わせることができる。本開示の文脈において、「約」特定の量とは、その量が、記載された量の±２０％以内、好ましくは記載された量の±１０％以内、またはより好ましくは、記載された量の±５％以内であることを意味する。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「療法」（およびそれらの異なる形態）という用語は、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段を含む治療的処置（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を指し、その目的は、疾患または状態と関連する望ましくない生理学的変化を予防または緩和する（減少させる）ことである。有益なまたは望ましい臨床結果には、検出可能であろうと検出不可能であろうと、症状の軽減、疾患または状態の程度の低下、疾患または状態の安定化（すなわち、疾患または状態が悪化しない場合）、疾患または状態の進行の遅延または減速、疾患または状態の改善または緩和、および疾患または状態の寛解（部分的であろうと全体的であろうと）が含まれるが、これらに限定されない。治療を必要とするものは、疾患もしくは状態を有しやすいもの、または疾患もしくは状態が抑制されるべきものと同様に、すでに疾患もしくは状態を有するものを含む。本明細書で使用される場合、「成分」、「組成物」、「製剤」、「化合物の組成物」、「化合物」、「薬物（ｄｒｕｇ）」、「薬理学的活性剤」、「活性剤」、「治療剤」、「療法」、「治療薬」または「薬物（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）」という用語は、文脈が指示するように、本明細書において交換可能に使用され、対象（ヒトまたは動物）に投与されたときに、局所的および／または全身的作用による所望の薬理学的および／または生理学的効果を誘導する化合物（複数可）または物質の組成物を指す。パーソナライズされた組成物または方法は、対象において同定または企図された特定の必要性を満たすように調整（ｔａｉｌｏｒ）または個別化されたレジメンにおける生成物または生成物の使用を指す。
「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、本発明による組成物または製剤による治療が提供される動物、例えばヒトを指す。本明細書で使用される「対象」または「生体源」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を指す。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」という用語は、本明細書では言い換え可能に使用され、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（エグマウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマなどの哺乳類、および爬虫類、両生類、トリ、シチメンチョウなどの非哺乳類が挙げられる。特定の実施形態では、「生体源」には、微生物、真菌、蘚苔類（ｍｏｓｓ ｌｉｖｅｒｗｏｒｔｓ）などの非動物生体、ならびに穀物、果物、野菜、およびそれらから作られた食品を含む他のヒトおよび動物の食用物を含むがこれらに限定されない植物が含まれる。本明細書に記載の組成物は、サルおよびヒトなどの霊長類、馬、ウシ、ネコ、イヌ、ウサギ、ならびにラットおよびマウスなどのげっ歯類を含む任意の好適な哺乳動物を治療するために使用することができる。一実施形態では、治療される哺乳動物はヒトである。ヒトは、あらゆる年齢のあらゆるヒトであり得る。一実施形態では、ヒトは成人である。別の実施形態では、ヒトは子供である。ヒトは、男性、女性、妊娠中、中年、青年、または高齢者である可能性がある。本発明の方法のいずれかによれば、一実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象は非ヒト霊長類である。別の実施形態では、対象はネズミ科（ｍｕｒｉｎｅ）であり、これは、一実施形態ではマウスであり、別の実施形態ではラットである。別の実施形態では、対象は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ラプリン（ｌａｐｒｉｎｅ）またはブタである。別の実施形態では、対象は哺乳動物である。
特定の薬物、化合物、組成物、製剤（またはそれらの組み合わせ）が本明細書で「示される」と言われる対象の状態および障害は、その薬物または化合物または組成物または製剤が規制当局によって明示的に承認されている状態および障害に限定されず、医師または他の健康または栄養の専門家によって、その薬物または化合物または組成物または製剤またはそれらの組み合わせによる治療に適していることが知られている、または合理的に信じられている他の状態および障害も含まれる。
生体系に存在する膨大な量の分子情報を解読することに大きな関心が寄せられている。単純な生物試料でも圧倒的な化学物質の多様性が見られるため、自然界に見られる分析物の様々なサブセットを検出および測定するのに、高度に専門化された分析方法が必要とされている。本発明者らは、ＬＣ－ＭＳを使用して、様々な生物学的標本における単一の分析実行において多様な範囲の分子種を定量化する方法を記載する。このアッセイは、複雑な生化学システムを分析するための直接的なアプローチを提供し、生物医学研究における独自の機会を提供する。この枠組は、試料を質量分析計に導入する前に、化学物質の標準化および包含を目的とした様々なステップおよび試薬と直交混合モード（または複数モードの）クロマトグラフィーを組み合わせることにより、多様な生体分子の分析を単一の機器実行に統合する。このアプローチを使用すると、数千のタンパク質、脂質、小分子、電解質、さらにはオリゴ糖およびオリゴヌクレオチドの同時定量化が提供される（図１）。
一実施形態では、生物試料は、最初にメタノール溶液中でホモジナイズおよび変性される。次に、分析物を化学的に標準化してＬＣ－ＭＳの適合性を向上させ、例えば、高分子を酵素によって加水分解して小分子のようなフラグメントにし、中性脂質および電解質などの検出が不十分な分子をイオン化付加物と対にする。ＬＣ－ＭＳに適合しない破片は、水混和性有機溶媒を使用して沈殿させ、遠心清澄化後に包括的な混合極性抽出物を得る。分析物は、質量分析データを取得する前に、直交混合モード（または複数モードの）クロマトグラフィーを使用して分離される。フルＭＳスキャンおよびＭＳ／ＭＳフラグメンテーションスキャンは、正および負の両方のイオン化分子を捕捉するための極性切り替えを有するこれらのマルチオミクス調製物に対して取得される。試料処理方法のより詳細な説明は、さらに以下および実施例に見出され得る。
以下の実施例に示されるように、この方法が化学的に多様な分子の分離および定量化を可能にすることを実証するために、タンパク質、脂質、代謝産物および電解質を含む代表的な分析物のセットを分析用に選択した。糖およびオリゴ糖などの極性中性化合物を除いて、ほとんどの化合物はクロマトグラフィーで保持された。これらの分析物は、内因性レベルでヒト血漿調製物中に検出可能であった（図２）。
定量化におけるこの方法の再現性を実証するために、５つの空腹時血漿試料調製物を５回分析した。代表的な分析物の小さなセットを検査したところ、測定は試料間を区別するのに十分な精度であった（図３）。ＫＮＩＭＥ（ｖ３．６．２）ＯｐｅｎＭＳ（ｖ２．４．０）プラグインを使用してこれらのデータの無標識特徴定量化により、合計９８，７９７のデアイソトープ特徴が得られ、これらの特徴のうちの１２，１５０は、２０％未満の平均試料内変動係数（ＣＶ）および試料間ＣＶよりも小さい平均試料内ＣＶを有した。プールされた血漿の半網羅的なＢｏｘＣａｒ様データ依存性取得フラグメンテーションスキャン分析で１０回の６０分間の実行にわたって狭められた前駆体スキャンウィンドウを使用して、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（ｖ２．２．０）を使用する２，５５９のタンパク質ファミリーについてペプチドの一致およびＴｈｅｒｍｏ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（ｖ２．０．０）による２７０の化合物の一致を見出した。
複数の生化学物質クラスの同時ボトムアップ高分子分析の実現可能性を実証するために、膵臓内部溶解酵素α－アミラーゼ、ＲＮａｓｅ Ａ、およびＤＮＡｓｅ Ｉを使用して、血清アルブミン、グリコーゲン、ＲＮＡ、およびＤＮＡを消化した。１８時間にわたる消化により、トリプシンおよびメタノールの存在下であっても、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、およびオリゴデオキシヌクレオチドに対応する検出可能な生成物が得られた。生物マトリックスでこのアプローチを試験するために、マウス肝臓ホモジネートをＲＮａｓｅ Ａおよびトリプシンで消化し、代謝産物、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、およびトリプシンペプチドの検出を可能にした（図５および６）。酵素がなくても、低分子量の成分は明確に分離され、識別可能および定量化可能である（図４）。同様の結果は、培養ヒト肝臓がん細胞（図７）、ヒト血漿（図８）、ウシ脂肪組織（図９）、およびヒト尿（図１０）でも得られる。
本方法の成分およびステップの各々については、以下でさらに詳細に記載される。一実施形態では、分析を実施するための方法が提供される。一実施形態では、分析を実施するために必要なすべての機器および試薬を含む装置またはデバイスが提供される。一実施形態では、ＬＣ－ＭＳによる分析の準備として入力試料を処理するための流体経路またはマイクロ流体経路が提供される。一実施形態では、個々の試料をカセットまたは同様のデバイスに充填して、多数の試料を順次または、デバイスまたは装置にプログラムされた任意の順序で自動処理することができる。一実施形態では、装置またはデバイスは、試料中に存在する分析物の存在、同一性または量に関するデータを提供するようにプログラムすることができる。一実施形態では、装置またはデバイスは、試料中の様々な分析物の存在または不在または相対量に基づいて、疾患または健康プロファイルの診断を提供するようにプログラムすることができる。一実施形態では、デバイスからの出力は、状態または疾患の治療的介入または予防を導き、次に、状態または疾患の進行および治療的介入の有効性またはその欠如のモニタリングを導く。一実施形態では、装置またはデバイスは、試料中に存在する分析物の個々のまたはグループに関する所定のパラメータのセットに基づいて試料を分類するようにプログラムすることができる。一実施形態では、新しい試料中の健康または疾患を同定するのに使用するために、様々な状態または疾患を有する個体の大集団からの試料からの結果を含むデータベースが作成される。これらの実施形態は、本発明の有用性、その意図された目的のために本発明を利用する装置およびデバイス、方法、またはシステムを制限することを決して意図するものではない。
試料および内部の分析物。一実施形態では、方法は、単一の試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性またはレベルを実質的に同時に決定するために提供される。ＬＣ－ＭＳによる分析のために可溶性抽出物を調製し得る任意の試料を使用することができる。試料は、非限定的な例として、生物試料、水試料、油試料、土壌試料、鉱物学的試料、汚染水試料、農産物試料、肉試料などであり得る。試料は、固体、液体、またはそれらの組み合わせであり得る。試料は、成分が水性媒体に溶解されたガス試料であり得る。生物試料の非限定的な例としては、ヒトもしくは他の動物、または植物からの試料が挙げられる。動物からの試料の非限定的な例としては、全血、血漿、血清、尿、糞便、脳脊髄液、唾液、汗、唾液、精液、生検標本、細胞または組織試料が挙げられる。他の試料は、毛髪、爪、脱落した皮膚、フケなどであり得る。試料は、水溶液、水性懸濁液または水性組織であり得る。試料は、固体または半固体試料からホモジナイズすることができる。他の生物試料には、バイオフィルム、食品および飲料の調製物および誘導体が含まれる。非生物試料には、原材料、工程内試料、工程中間体および製造バッチなどの工業材料が含まれ得るが、これらに限定されない。一実施形態では、この方法は、岩石および鉱物試料、化石化したヒトおよび他の動物を含む化石、ならびに地球外の供給源もしくは場所からのまたはその上の岩石試料などの非生物物質中の生物成分の存在を決定するために使用される。
試料は、複数の分析物を含有し得る。一実施形態では、分析物は化学的に関連している。一実施形態では、分析物は化学的に関連していない。一実施形態では、分析物は生体高分子であり、例えば、多糖類、核酸およびタンパク質などの類似のサブユニットを含む任意の生体分子またはそれらの繰り返し単位である。他の分析物は、代謝産物、電解質、糖、アミノ酸、金属、薬物などの小分子化合物である。他の生物成分には、極性および非極性脂質、揮発性化合物、他の外因性化学物質などが含まれる。本明細書における前述および他の説明は、主に生物源からの、特に人体からの分析物を記載するが、水質汚染物質、工業化学物質および工業製品などの任意の獣医または家畜由来の分析物ならびに非生体の全生物も同様に含まれる。植物からの供給源は本明細書で具体化される。
一実施形態では、試料は、ステップ１の前またはステップ１の最中にホモジナイズされる。試料は、水または水性緩衝液などの水溶液中でホモジナイズすることができる。
ステップ１：変性。試料は、試料中の生体高分子を変性させる変性試薬で処理され、それによって変性試料を形成し、変性試薬は、標準化試薬に加えられたときに標準化試薬の成分を変性させない。
一実施形態では、変性試薬は、１つ以上の溶媒、１つ以上のカオトロピック剤、１つ以上の参照標準、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一実施形態では、溶媒は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、もしくは別の揮発性有機溶媒またはそれらの任意の組み合わせである。一実施形態では、溶媒はメタノールである。一実施形態では、水性試料は、ほぼ等量のメタノール中でホモジナイズされる。一実施形態では、変性試薬は、金属キレート化剤をさらに含む。一実施形態では、金属キレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたはＤＭＳＡである。一実施形態では、金属キレート剤はＥＤＴＡである。一実施形態では、ＥＤＴＡが血液試料の抗凝固剤として使用される場合など、金属キレート剤は試料中に存在する。
一実施形態では、上記のような試料の変性は、次のステップで説明するように、標準化と一緒に行われる。一実施形態では、変性後の試料の成分は、酵素および標準化ステップの他の成分が、変性ステップからの任意の成分の存在下でそれらの所望の機能を実行することができるという点で、標準化ステップと適合性がある。一実施形態では、変性ステップは、約４０～６０％のメタノール含有量を有する溶液をもたらす。
ステップ２：標準化。変性試料は、標準化試薬で処理され、標準化試薬は、変性試料中の複数の分析物を標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種に変換する。一実施形態では、そのように形成された種は、複数モードのクロマトグラフィーによって分離され、質量分析によって個別に同定されることができ、それによって標準化された試料を形成する。
一実施形態では、標準化試薬は、試料中の生体高分子を分析物フラグメント種に解重合する１つ以上の酵素を含む。一実施形態では、標準化試薬は膵臓内部溶解酵素を含む。一実施形態では、標準化試薬は、１つ以上のプロテイナーゼ、１つ以上のヌクレアーゼ、１つ以上のグリコシダーゼ、１つ以上のリパーゼ、１つ以上のキレート剤、１つ以上の緩衝剤、１つ以上の還元剤、１つ以上の誘導体化剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
実施形態では、プロテイナーゼは、トリプシン、キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、ＡｓｐＮ、ＧｌｕＣまたはＡｒｇＣである。一実施形態では、プロテイナーゼはトリプシンである。
一実施形態では、誘導体化剤は、β－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン－ＨＣｌ、またはヨードアセトアミドである。一実施形態では、誘導体化剤はヨードアセトアミドである。
一実施形態では、緩衝剤は、リン酸塩、クエン酸塩、重炭酸塩、スルホン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩またはアンモニアである。一実施形態では、標準化中の試料のｐＨは、試料の標準化を最大限に可能にするために提供される。一実施形態では、ｐＨは約７．８である。
一実施形態では、標準化試薬は、トリプシン、リボヌクレアーゼＡ、ＥＤＴＡ、重炭酸アンモニウム、およびアミラーゼの組み合わせを含む。
一実施形態では、標準化試薬は、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、および１：２０ｍ／ｍのトリプシン：試料タンパク質を含む。
一実施形態では、標準化は、異なる酵素の最適ｐＨが異なる場合など、特定の試薬が適合しない連続ステップを含み、その結果、標準化行程中の条件が変化して、試料を最大限に標準化する。一実施形態では、標準化試薬がＤＮＡｓｅ Ｉを含む場合、ＥＤＴＡは同時に存在しない。
一実施形態では、プロテイナーゼは、変性試料の標準化試薬の他の成分とのインキュベーションと同時にまたはその後に変性試料に加えられる。
一実施形態では、標準化剤で処理することは、約３７℃の温度で約０～２４時間のインキュベーションを含む。
標準化ステップの望ましい結果についてのこれらのガイドラインは、生体高分子を加水分解せずに分析することが困難であり得るＬＣ－ＭＳによって分析されることができるフラグメントに生体高分子を加水分解し、ＬＣ－ＭＳによって同様に分析可能であるように任意の成分を誘導体化することを、制限することを意味するものではない。
ステップ３：抽出。標準化された試料は抽出試薬で処理され、内部に可溶性分析物種および分析物フラグメント種が保持され、それによって抽出された試料を形成する。
有機溶媒の添加は、実質的に同時に試料からタンパク質を除去し、それらの代謝産物を抽出するために、メタボロミクス法において一般的に使用される手順である。混合極性溶媒の組み合わせを利用して、極性分子および非極性分子の両方を抽出しながら試料のクリーンアップを提供する。試料は任意選択的に濃縮することができるが、この比較的粗い調製物の注入により、イソプロパノールまたはエタノールなどの揮発性分析物の検出が可能になる。
本明細書に記載されているように、ＬＣ－ＭＳによって分析することができる試料中の分析物の成分は、変性および標準化ステップによって可溶性にされるものである。これらの可溶性成分は抽出され、次にＬＣ－ＭＳによって分析される。一実施形態では、抽出試薬は、標準化された試料に１：１（ｖ／ｖ）で加えられる。一実施形態では、抽出試薬は、アセトニトリルおよびアセトンを含む。一実施形態では、アセトニトリルおよびアセトンは、１：１（ｖ／ｖ）で存在する。
一実施形態では、抽出ステップ後の試料は、元の試料中の分析物の可溶性成分およびフラグメントを含む。一実施形態では、抽出された試料中の可溶性成分を分離することは、遠心分離または濾過によって達成される。
前述の変性、標準化、および抽出の方法は、別個のステップとして説明されているが、一実施形態では、試薬の添加、混合、インキュベーション、加熱、分離、および他の操作は、ＬＣ－ＭＳ用の試料を調製するために、任意の適切な順序で達成され得る流体経路において連続的に実施されてよい。流体経路が用いられる一実施形態では、試料が導入され、変性試薬が流体に加えられ、組み合わされた溶液が、変性の望ましい結果を最適化するために提供された直径、長さ、および流量の混合チャンバーまたは乱流領域で混合される。次に、標準化試薬は、試料が流体経路を移動するとき、または流体経路に沿って固定化されるときに、試薬に加えられる。同時に適合しない標準化試薬および条件の場合、試料を、例えば、ＥＤＴＡの不在下でヌクレアーゼで処理し、次いでその後に、ＥＤＴＡの存在下で、他の成分の中でもプロテイナーゼおよびグリコシダーゼで希釈および処理してもよい。長さ、直径、流量、滑らかな領域または乱流／混合領域を含む流体経路の設計は、試料処理ステップの効率を最大化するように設計される。標準化後、抽出試薬が流体経路に加えられ、流体の可溶性成分は、インライン濾過、連続もしくはゾーン遠心分離、またはさらなる処理のために可溶性成分を分離するための任意の他の手段によって、不溶性成分から分離される。処理後、抽出された試料はＬＣ－ＭＳに入ることができ、または処理された試料は連続的に保存され、次いで次のプログラムされた試料を分析する準備ができたときにＬＣ－ＭＳに注入されてもよい。前述の条件は、試料処理のための単一の流体経路手段の形態の単なる例示であり、決して限定することを意図するものではない。
いくつかの実施形態では、流体処理は重力に依存する。いくつかの実施形態では、流体処理経路は、例えば、宇宙環境および探査で使用するために、重力に依存しない。
ステップ４ ＬＣ－ＭＳ。抽出された試料を、複数モードのクロマトグラフィー、続いて質量分析に供し、それによって、内部に存在する各標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種についてのＭＳデータが生成される。
一実施形態では、エレクトロスプレーイオン化が使用される。他の実施形態では、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）またはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）が使用される。これらは、使用することができるが、制限することを意図していない大気圧イオン化（ＡＰＩ）法の例である。
検出が不十分な分析物のＬＣ－ＭＳ応答を改善するための化学添加物の使用は十分に確立されている。酢酸アンモニウムなどの揮発性塩は、イオン交換相を溶出し、脂質などの中性化合物のイオン化を改善するために使用される。金属配位剤は、メドロン酸およびＥＤＴＡを使用したリン酸化化合物および金属イオンのクロマトグラフィーおよび感度を改善するために使用されてきた。そのような戦略の組み合わせを本明細書で使用して、逆相、陽イオンおよび陰イオン交換特性を特徴とする市販の三峰性混合モードカラムにより分析物を溶出する。水性開始条件を使用すると、このカラムは、オリゴ糖および糖などの極性中性分子を除いて、ほとんどの化合物を保持するように見える。
複数モードのクロマトグラフィーは、多様な化学種のクロマトグラフィー分離を可能にするが、単一モードのクロマトグラフィーを特徴とするクロマトグラフィーでは、固定相との化学的相互作用に関与しない分析物を分離できない。複数モードの分離は、オフライン分画、もしくはオンライン一次元混合床／相カラム、またはオンラインの連続多次元ＬＣを含む様々な形式の分析物の複雑な混合物を分解するために、一般的に使用される。ここでは、市販のトリモーダルカラムについて説明するが、モードの数を増やすと、イオン移動度、キラリティー、サイズ、および非イオン極性を含む他の化学的特性に基づいて分離が改善される場合がある。
一実施形態では、複数モードのクロマトグラフィーは、逆相分離、陽イオン交換分離、陰イオン交換分離、イオン対分離、順相分離、イオン移動度分離、サイズ排除分離、キラル分離、アフィニティー分離、配位子交換分離、極性非イオン分離、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一実施形態では、クロマトグラフィーで使用される移動相は、アンモニウム、プロトン、ナトリウム、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、メドロネート、尿素、ビウレット、トリウレット、またはそれらの任意の組み合わせなどのこれらに限定されない１つ以上のイオン化付加物をさらに含む。
一実施形態では、質量分析データ取得は、正および負のイオンモードの両方で動的排除を伴う、低または高解像度のＭＳ２データ非依存性またはデータ依存性取得を伴う高解像度フルスキャンを含む。
ステップ５：分析。抽出された試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性またはレベルをＭＳデータから計算的に決定する。
いくつかの実施形態では、ＬＣ－ＭＳデータは、クロマトグラフィー保持時間、イオン移動度衝突断面積、異なる形態の前駆体および生成物イオンの質量対電荷比、イオン付加物の状態および比率、損失、多量体、同位体存在量、電荷状態、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一実施形態では、抽出された試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性またはレベルをＭＳデータから計算的に決定することは、標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種のＭＳデータを、既知量の既知の分析物から生成されたそれらの種のＭＳデータと比較することを含む。
一実施形態では、抽出された試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性またはレベルをＭＳデータから計算的に決定することは、標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種のＭＳデータを、既知量のそれらの種の同位体分子種から生成されたＭＳデータと比較することを含む。
一実施形態では、抽出された試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性またはレベルをＭＳデータから計算的に決定することは、標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種のＭＳデータを、既知または理論上の分析物の計算的にシミュレートされたＭＳデータと比較することを含む。
一実施形態では、生体高分子フラグメントについてのＭＳデータの計算的シミュレーションは、生体高分子フラグメントについてのサブユニットのすべての可能なまたは考えられる組み合わせおよび順列を生成し、理論上の生体高分子フラグメントのサブユニット化学組成に基づいて予想されるＭＳデータを計算することを含む。
一実施形態では、抽出された試料中に存在する複数の分析物の同一性をＭＳデータから計算的に決定することは、前駆体イオンの同位体分布を、既知の生化学的クラスの計算的にシミュレートされた同位体分布と比較することによって、標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種の生化学的クラスを事前に同定し、続いて、標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種のＭＳデータを、一致した生化学的クラスからの既知または理論上の分析物のＭＳデータと比較することを含む。
一実施形態では、抽出された試料中に存在する複数の分析物の存在またはレベルをＭＳデータから計算的に決定することは、試料に加えられたか、または試料中に既に存在した既知量の既知の分析物の強度ピーク面積に比例して、標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種の強度ピーク面積を調製することを含む。
一実施形態では、抽出された試料中に存在する複数の分析物の同一性をＭＳデータから計算的に決定することは、クロマトグラフィー保持時間、予想される同位体質量、またはそれらの前駆体イオン、それらのフラグメントイオン、それらの代替の電荷状態イオン、それらの代替の正もしくは負に帯電したイオン、もしくは既知の分析物について記録もしくはシミュレートされたもののそのような特性に対する、もしくはそれらからの誘導体もしくは類似体などの化学的に関連するイオンの相対存在量に基づいて、標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種を一致させることを含む。
いくつかの実施形態では、ＭＳデータ中の種を同定し、そこから分析物の同一性を同定するためのソフトウェア、アルゴリズムおよび他の方法は、ＫＮＩＭＥ（ｖ３．６．２）ＯｐｅｎＭＳ（ｖ２．４．０）プラグイン、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（ｖ２．２．０）およびＴｈｅｒｍｏ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（ｖ２．０．０）の使用によって達成されるが、これらは単なる例示であり、限定することを意図したものではない。
この方法の一実施例では、以下のステップを実施することができる。
ステップ１．試料を、メタノールを含む等量の変性試薬で処理し、変性剤は試料中の生体高分子を変性させ、それによって変性試料を形成し、変性試薬は、標準化試薬に加えられたときに標準化試薬の成分を変性させない。
ステップ２．変性試料を、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、１：２０ｍ／ｍのトリプシン：試料タンパク質を含む標準化試薬で、ｐＨ７．８、３７℃で４時間処理し、標準化剤は、変性試料中の複数の分析物を、標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種に変換し、これらの種は、複数モードのクロマトグラフィーによって分離され、質量分析によって個別に同定されることができ、それによって標準化された試料を形成する。
ステップ３．標準化された試料を、１：１のアセトニトリル：アセトンを含む等量の抽出試薬で処理し、試料を遠心分離し、内部に可溶性分析物種および分析物フラグメント種を含む上清を保持し、それによって抽出された試料を形成する。
ステップ４．抽出された試料を、複数モードのクロマトグラフィー、続いて質量分析に供し、それによって、内部に存在する各標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種についてのＭＳデータが生成される。
ステップ５．抽出された試料中に存在する複数の分析物の存在、レベル、および／または同一性をＭＳデータから計算的に決定する。
前述の方法、装置、デバイスまたはシステムは、様々な目的のために使用され得る。一実施形態では、生物試料が由来する生体源の状態を決定するための方法は、
ａ．本明細書に記載の方法に従って、生物試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性またはレベルを実質的に同時に決定することと、
ｂ．内部の分析物の存在、同一性またはレベルを、当該状態を伴わない生体源試料からの生物試料のものと比較することであって、状態は、複数の分析物の存在、同一性またはレベルの変化から同定可能である、比較することと、
ｃ．当該生体源の状態を決定することと、を含む。
一実施形態では、状態は病的状態または疾患であり、決定の結果は、治療的介入を導くため、または疾患または状態の治療または進行の有効性のモニタリングのために使用される。一実施形態では、状態は食事または代謝の不均衡であり、決定の結果は、食事またはライフスタイルの変化を導き、変化の効果および進行のモニタリングのために使用される。一実施形態では、この方法を使用して、病的状態などの状態からの保護または発症のリスクと関連する分子または分子のパターンを決定することができる。１つの非限定的な実施例では、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を発症するリスクが評価され得、Ｔ２Ｄの試料が、現時点で糖尿病リスクの増加と関連していない１つ以上の化合物またはバイオマーカーの高レベルまたは低レベルを有し、健康体の試料が、糖尿病に対する保護が現時点で示されていないそのような化合物またはバイオマーカーの低レベルまたは高レベルを有するように、分析物またはパターンまたはＴ２Ｄを有する対象からの試料中の分析物を、健康な個人の試料と比較することによって、新しいバイオマーカーが発見され得る。
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、すべての方法ステップを実施することができる装置またはデバイスによって実施される。一実施形態では、装置は、
ａ．試料中の生体高分子を変性させ、それによって変性試料を形成するための手段であって、変性試薬は、標準化試薬に加えられたときに標準化試薬の成分を変性させない、手段と、
ｂ．試料を標準化するための手段であって、変性試料中の複数の分析物は、標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種に変換され、これらの種は、複数モードのクロマトグラフィーによって分離され、質量分析によって個別に同定されることができる、手段と、
ｃ．標準化された試料を抽出し、内部に可溶性分析物種および分析物フラグメント種を保持するための手段と、
ｄ．抽出された試料を、複数モードのクロマトグラフィー、続いて質量分析に供するための手段であって、それによって、内部に存在する各標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種についてのＭＳデータが生成される、手段と、
ｅ．抽出された試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性またはレベルをＭＳデータから計算的に決定するための手段と、を含む。
一実施形態では、本明細書の上記の方法を実施するシステムが提供される。一実施形態では、システムは、単一の試料中に存在する複数の、化学的に関連する分析物および化学的に関連しない分析物の存在、同一性またはレベルを実質的に同時に決定するために提供され、このシステムは、
ａ．試料中の生体高分子を変性させ、それによって変性試料を形成する変性試薬であって、変性試薬は、標準化試薬に加えられたときに標準化試薬の成分を変性させない、変性試薬と、
ｂ．試料中の複数の分析物を、混合モード液体クロマトグラフィーによって分離され、タンデム質量分析によって個別に同定されることができる、標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種に変換する、標準化試薬と、
ｃ．可溶性分析物種および分析物フラグメント種を抽出する抽出試薬と、
ｄ．内部に可溶性分析物種および分析物フラグメント種を保持し、それによって抽出された試料を形成するための分離行程と、
ｅ．可溶性分析物種および分析物フラグメント種を分解する複数モードのクロマトグラフィーと、
ｆ．個々の種に関するデータを生成する質量分析と、
ｇ．各標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種のデータから、試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性またはレベルを計算的に決定するための１つ以上のアルゴリズムと、を含む。
いくつかの実施形態は、試料から異なるタイプの複数の分析物を同定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）異なるタイプの当該複数の分析物を含有するか、または含有することが疑われる当該試料を、当該複数の分析物またはそれらの誘導体を含む溶液を生成するのに十分な条件に供することと、（ｂ）機器を使用して当該溶液を処理して、当該複数の分析物またはそれらの誘導体を同定し、それによって当該複数の分析物を同定することであって、当該複数の分析物またはそれらの誘導体が、当該機器の単一の実行で同定される、同定することと、を含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、単一の機器の実行で実施される。当業者は、本明細書で使用される「単一の機器の実行」という用語は、一般に、１つの単一の機器を用いる１つの単一の試料の１回の単一のローディングで実施される１つの単一の分析プロセスを指すことを理解するであろう。当業者は、分析物の「誘導体」は、分析物のフラグメント化された、イオン化された、酸化された、還元された、化学的に官能化された、化学的官能性が除去された、異性化された、配位された、重合された、もしくは多量体化された形態、またはそれらの組み合わせであり得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、当該複数の分析物は、タンパク質、核酸、小分子、脂質、炭水化物、電解質、および金属からなる群から選択される分析物のうちの少なくとも３つのタイプを含む。当業者は、「電解質」の非限定的な例としては、Ｎａ＋、Ｃｌ－、Ｋ＋、重炭酸塩、リン酸塩、硫酸塩、臭化物、酢酸塩、ギ酸塩、およびアンモニウムが挙げられることを理解するであろう。当業者はまた、小分子の非限定的な例には、９００ダルトン未満、１５００ダルトン未満、または２０００ダルトン未満の分子量を有する分子が含まれることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、当該複数の分析物は、小分子、脂質、および炭水化物から選択される分析物のうちの少なくとも１つのタイプと、タンパク質、核酸、電解質、および金属から選択される分析物のうちの少なくとも２つのタイプと、を含む。いくつかの実施形態では、当該複数の分析物は、タンパク質、および核酸から選択される分析物のうちの少なくとも１つのタイプと、小分子、脂質、および炭水化物から選択される分析物のうちの少なくとも２つのタイプと、を含む。いくつかの実施形態では、当該複数の分析物は、小分子、脂質、およびタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、当該複数の分析物は、小分子、脂質、炭水化物、およびタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、当該複数の分析物は、小分子、脂質、炭水化物、および電解質を含む。いくつかの実施形態では、当該複数の分析物は、小分子、脂質、炭水化物、電解質、および金属を含む。いくつかの実施形態では、当該複数の分析物は、タンパク質および核酸の一方または両方をさらに含む。いくつかの実施形態では、当該小分子は、内因性小分子、外因性小分子、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、当該複数の分析物は、外因性化学物質を含む。いくつかの実施形態では、当該複数の分析物のうちの少なくとも１つは揮発性化合物である。いくつかの実施形態では、当該溶液の当該複数の分析物またはそれらの誘導体は、当該試料に含有されるか、または含有されることが疑われる当該複数の分析物とは異なる分子サイズまたは質量の分布を有する。いくつかの実施形態では、当該溶液の当該複数の分析物またはそれらの誘導体は、当該試料に含有されるか、もしくは含有されることが疑われる当該複数の分析物とは異なる、荷電分子の量、親水性分子の量、疎水性官能基を有する分子の量、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、当該荷電分子は、負に帯電した分子、正に帯電した分子、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、当該溶液の当該複数の分析物またはそれらの誘導体は、当該試料に含有されるか、または含有されることが疑われる当該複数の分析物とは異なる酸性および塩基性官能基の分子のｐＫａ定数値の分布を有する。いくつかの実施形態では、当該溶液の当該複数の分析物またはそれらの誘導体は、当該試料に含有されるか、または含有されることが疑われる当該複数の分析物とは異なる分子のオクタノール－水分配係数の分布を有する。いくつかの実施形態では、当該溶液の当該複数の分析物またはそれらの誘導体は、当該試料に含有されるか、または含有されることが疑われる当該複数の分析物よりも、所定の範囲に収まる分子の大きな質量パーセントを有する。いくつかの実施形態では、当該溶液の当該複数の分析物またはそれらの誘導体は、当該試料に含有されるか、または含有されることが疑われる当該複数の分析物よりも狭い分子サイズまたは質量の分布を有する。いくつかの実施形態では、当該溶液の当該複数の分析物またはそれらの誘導体は、当該試料に含有されるか、または含有されることが疑われる当該複数の分析物よりも、荷電分子の大きな質量パーセントを有する。いくつかの実施形態では、当該溶液の当該複数の分析物またはそれらの誘導体は、当該試料に含有されるか、または含有されることが疑われる当該複数の分析物よりも、オクタノール－水分配係数で測定した際に、親水性分子の大きな質量パーセントを有する。いくつかの実施形態では、当該溶液の当該複数の分析物またはそれらの誘導体は、当該試料に含有されるか、または含有されることが疑われる当該複数の分析物よりも狭い質量対電荷比（ｍ／ｚ）の分布を有し、その結果、当該溶液の当該複数の分析物またはそれらの誘導体は、当該試料に含有されるか、または含有されることが疑われる当該複数の分析物よりも、質量分析によって検出可能な範囲に収まる分子の大きな質量パーセントを有する。いくつかの実施形態では、質量分析によって検出可能な当該範囲は、１００ダルトン／電子電荷（Ｄａ／ｅ）～２，０００Ｄａ／ｅである。いくつかの実施形態では、当該溶液の当該複数の分析物またはそれらの誘導体は、各々、１５ダルトン／電子電荷（Ｄａ／ｅ）～４，０００Ｄａ／ｅの質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有する。
上記または本明細書の他の箇所に記載の試料から異なるタイプの複数の分析物を同定するための方法のいくつかの実施形態では、（ａ）は、処理された試料を得るために、以下の、（ｉ）当該試料をホモジナイズすることと、（ｉｉ）当該試料を変性剤と接触させ、それによって当該複数の分析物のうちの少なくとも１つのコンフォメーションを変化させることと、（ｉｉｉ）当該試料をキレート剤と接触させ、それによって当該複数の分析物のうちの少なくとも１つとキレート錯体を形成することと、（ｉｖ）当該試料を誘導体化剤と接触させ、それによって当該複数の分析物のうちの少なくとも１つの誘導体を形成することと、（ｖ）当該試料を還元剤と接触させ、それによって当該複数の分析物のうちの少なくとも１つを修飾することと、（ｖｉ）当該試料を酵素と接触させ、それによって当該複数の分析物のうちの少なくとも１つのフラグメントを生成することと、のうちの１つまたは任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、（ｉｉｉ）は１回以上行われる。いくつかの実施形態では、（ｖｉ）は１回以上行われる。いくつかの実施形態では、（ｉ）は、（ｉｉ）の前または実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）は（ｉｉｉ）と実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）は、（ｖｉ）の前または実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｖｉ）は、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）のうちの１つ以上と実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｖｉ）は（ｉｖ）と実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｖｉ）は、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）と実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｉｉｉ）は少なくとも２回、１回は（ｉ）と実質的に同時に、および再度（ｖｉ）と実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｖｉ）は少なくとも２回、１回は（ｉｉ）と実質的に同時に、および再度（ｉｖ）と実質的に同時に行われる。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）と実質的に同時に行われる（ｖｉ）で使用される当該酵素はプロテアーゼである。当業者は、本明細書で使用される「実質的に同時に」という用語は、一般に、関連するステップの各々を、関連する方法の目的を達成するために必要とされるものより長くなく、互いに時間的に近接した範囲内（すなわち、１時間以内、３０分以内、１０分以内、５分以内、または１分以内）で行うことを指すことを理解するであろう。いくつかの実施形態では、（ｉ）は、１：５～５：１の体積比で水およびメタノールの混合物中で実施される。いくつかの実施形態では、（ｉ）は、１：２～２：１の体積比で水およびメタノールの混合物中で実施される。いくつかの実施形態では、当該混合物は、水およびメタノールの体積で１：１の混合物である。いくつかの実施形態では、当該変性剤は、溶媒、カオトロピック剤、および参照標準を含む。いくつかの実施形態では、当該溶媒は、メタノール、エタノール、およびアセトニトリルから選択される。いくつかの実施形態では、当該溶媒はメタノールである。いくつかの実施形態では、当該キレート剤は、（ｉｉｉ）の各存在とは独立して、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、およびジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、当該キレート剤はＥＤＴＡである。いくつかの実施形態では、当該誘導体化剤はペプチドアルキル化剤である。いくつかの実施形態では、当該誘導体化剤はヨードアセトアミドである。いくつかの実施形態では、当該酵素は、（ｖｉ）の各存在とは独立して、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、およびリパーゼからなる群から選択される１つまたは任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、当該グリコシダーゼはアミラーゼである。いくつかの実施形態では、当該プロテアーゼはトリプシンである。いくつかの実施形態では、当該ヌクレアーゼは、ＤＮＡｓｅ ＩおよびリボヌクレアーゼＡの一方または両方を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡｓｅ ＩおよびＥＤＴＡは、（ｖｉ）において同時に存在しない。いくつかの実施形態では、（ｖｉ）は、重炭酸アンモニウム緩衝液中で実施される。いくつかの実施形態では、（ｖｉ）は、約３７℃で約２４時間以下インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）は、当該処理された試料から当該複数の分析物またはそれらの誘導体を抽出試薬で抽出し、それによって当該溶液を得ることをさらに含む。いくつかの実施形態では、当該抽出することは、当該処理された試料に体積で１：１で当該抽出試薬を加えることを含む。いくつかの実施形態では、当該抽出試薬は、体積で１：１のアセトニトリルおよびアセトンを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）は、遠心分離または濾過によって、当該溶液から不溶性不純物を除去することをさらに含む。
上記または本明細書の他の箇所に記載の試料から異なるタイプの複数の分析物を同定するための方法のいくつかの実施形態では、（ｂ）は、当該複数の分析物またはそれらの誘導体を電子ビームに供し、それによって、当該複数の分析物またはその誘導体のうちの少なくとも１つの、少なくとも１つのイオン化形態またはフラグメントを生成することを含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、当該複数の分析物またはそれらの誘導体を、少なくとも３つの直交クロマトグラフィーモードを含む混合モードクロマトグラフィーマトリックスと接触させることをさらに含み、当該少なくとも３つの直交クロマトグラフィーモードの各々は、当該溶液から当該複数の分析物またはそれらの誘導体の所与のタイプを分離するように構成される。いくつかの実施形態では、当該直交クロマトグラフィーモードのうちの少なくとも１つは、当該分析物の少なくとも１つの誘導体を当該溶液から分離する。いくつかの実施形態では、当該混合モードクロマトグラフィーマトリックスは、陽イオン交換特性、陰イオン交換特性、イオン排除特性、配位子交換特性、サイズ排除特性、キラル特性、逆相特性、アフィニティー特性、親水性特性、多座特性、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも３つの特性を含む。当業者は、「陽イオン交換」が、強陽イオン交換（ＳＣＸ）および弱陽イオン交換（ＷＣＸ）を含み得ることを理解するであろう。当業者はまた、「陰イオン交換」が、強陰イオン交換（ＳＡＸ）および弱陰イオン交換（ＷＡＸ）を含み得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、当該複数の分析物およびそれらの誘導体を少なくとも３つの移動相で溶出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、当該複数の分析物およびそれらの誘導体の第１の画分は、第１の移動相によって溶出され、当該第１の移動相は、水および０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）を含み、当該複数の分析物およびそれらの誘導体の第２の画分は、第２の移動相によって溶出され、当該第２の移動相は、アセトニトリルおよび０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）を含み、当該複数の分析物およびそれらの誘導体の第３の画分は、第３の移動相によって溶出され、当該第３の移動相は、１：１（ｖ／ｖ）のメタノール／水、２００ｍＭの酢酸アンモニウム、およびギ酸を含む。いくつかの実施形態では、当該少なくとも３つの移動相のうちの少なくとも１つ、または当該第１の移動相、当該第２の移動相、および当該第３の移動相のうちの少なくとも１つは、アンモニウム、プロトン、ナトリウム、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、メドロネート、尿素、ビウレット、およびトリウレットからなる群から選択される１つ以上のイオン化付加物を含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、当該複数の分析物またはそれらの誘導体の各々の質量を質量分析によって決定することを含む。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、当該複数の分析物またはそれらの誘導体の各々の量を質量分析によって決定することを含む。当業者は、当該複数の分析物または誘導体の各々の当該質量または量が、クロマトグラフィー保持時間、イオン移動度衝突断面積、異なる形態の前駆体および生成物イオンの質量対電荷比、イオン付加物の状態および比率、損失、多量体、同位体存在量、電荷状態、またはそれらの任意の組み合わせを含むＬＣ－ＭＳデータから識別することができることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、当該質量分析は、正および負のイオンモードの両方で動的排除を伴うか、または伴わない、データ非依存性またはデータ依存性取得によって生成される低または高解像度のフルスキャンまたはフラグメントスキャン質量分析である。いくつかの実施形態では、当該質量または当該量を当該決定することは、当該低または高解像度質量分析特性を、１つ以上の参照質量フルまたはスペクトルと比較することを含む。いくつかの実施形態では、当該溶液は水溶液であり、任意選択的に水混和性有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、当該試料は生物試料である。
いくつかの実施形態は、対象における疾患または状態を決定するための方法を提供し、この方法は、（ｉ）当該複数の分析物の各々について同定された量を得るために、当該対象の単一の試料から、個別にまたは一括して、当該疾患または状態と関連することが知られている複数の分析物を同定することであって、当該複数の分析物は他のタイプの分析物を含む、同定することと、（ｉｉ）複数の差の値を得るために、当該複数の分析物の当該各々について、参照量と当該同定された量との間の差を決定することと、（ｉｉｉ）当該複数の差の値に基づいて当該疾患または状態を決定するために、訓練された機械学習アルゴリズムを使用することと、を含む。当業者は、本明細書で使用される「参照量」という用語は、一般に、対象が疾患または状態を有するかどうかを決定することを可能にする量を指すことを理解するであろう。上記または本明細書の他の箇所に記載の対象における疾患または状態を決定するための方法のいくつかの実施形態では、（ｉ）は、（ａ）当該複数の分析物を含有するか、または含有することが疑われる当該単一の試料を、当該複数の分析物またはそれらの誘導体を含む溶液を生成するのに十分な条件に供することと、（ｂ）当該溶液を使用して、当該複数の分析物またはそれらの誘導体を同定し、それによって当該複数の分析物を同定することと、を含み得る。上記または本明細書の他の箇所に記載の対象における疾患または状態を決定するための方法のいくつかの実施形態では、（ｂ）は、単一の機器の実行で実施され得る。訓練されたアルゴリズムは、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、または１７０の、もしくは約（すなわち、±１、±２、または±３）のそれらの訓練試料を含むか、または任意の前述の２つの値の間の範囲の複数の訓練試料を使用して訓練され得る。訓練されたアルゴリズムは、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、もしくは１７０以下の、または約（すなわち、±１、±２、または±３）以下の訓練試料を含む複数の訓練試料を使用して訓練され得る。訓練されたアルゴリズムは、１７０以下の訓練試料を含む複数の訓練試料を使用して訓練され得る。訓練されたアルゴリズムは、３０以下の訓練試料を含む複数の訓練試料を使用して訓練され得る。訓練されたアルゴリズムは、少なくとも、または少なくとも約（すなわち、±１、±２、または±３）、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、もしくは１７０の訓練試料を含む複数の訓練試料を使用して訓練され得る。訓練されたアルゴリズムは、少なくとも３０の訓練試料を含む複数の訓練試料を使用して訓練され得る。訓練されたアルゴリズムは、少なくとも１７０の訓練試料を含む複数の訓練試料を使用して訓練され得る。この方法は、（ｉ）の前に、当該複数の訓練試料の各々から当該複数の分析物を同定することをさらに含み得る。疾患または状態は、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、もしくは０．８の、もしくは約（すなわち、±０．０１、±０．０２、もしくは±０．０３）の精度で、または任意の２つの前述の値の間の範囲で決定され得る。疾患または状態は、少なくとも、または少なくとも約（すなわち、±１％、±２％、±３％、±４％、もしくは±５％）、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の精度で決定され得る。疾患または状態は、少なくとも、または少なくとも約（すなわち、±１％、±２％、±３％、±４％、もしくは±５％）、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の特異性で決定され得る。疾患または状態は、少なくとも、または少なくとも約（すなわち、±１％、±２％、±３％、±４％、もしくは±５％）、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の感度で決定され得る。疾患または状態は、少なくとも、または少なくとも約（すなわち、±１％、±２％、±３％、±４％、もしくは±５％）、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の正確さで決定され得る。疾患または状態は、加齢、心血管疾患、炎症、心不全、および認知症からなる群から選択することができる。複数の分析物は、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）、コルチゾール、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、およびＮ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ＰｒｏＢＮＰ）、およびそれらの誘導体からなる群から選択される１つ以上を含み得る。複数の分析物は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ポリペプチド、および代謝産物からなる群から選択される２つ以上の分析物を含み得る。複数の分析物は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ポリペプチド、および代謝産物からなる群から選択される３つ以上の分析物を含み得る。複数の分析物は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ポリペプチド、および代謝産物からなる群から選択される４つの分析物すべてを含み得る。複数の分析物は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、および代謝産物を含み得る。複数の分析物は、ポリペプチド、および代謝産物を含み得る。複数の分析物は、タンパク質、核酸、小分子、脂質、炭水化物、電解質、および金属からなる群から選択される分析物のうちの少なくとも３つのタイプを含み得る。複数の分析物は、小分子、脂質、および炭水化物から選択される分析物のうちの少なくとも１つのタイプと、タンパク質、核酸、電解質、および金属から選択される分析物のうちの少なくとも２つのタイプと、を含み得る。複数の分析物は、タンパク質、および核酸から選択される分析物のうちの少なくとも１つのタイプと、小分子、脂質、および炭水化物から選択される分析物のうちの少なくとも２つのタイプと、を含み得る。
コンピュータシステム
本開示は、本明細書に開示される方法を実施するようにプログラムされた、または別の方法で構成されたコンピュータシステムを提供する。図１７は、質量分析計からのデータを処理するようにプログラムされた、または他の方法で構成されたコンピュータ制御システム４０１を示す。コンピュータ制御システム４０１は、例えば、バイタルサインデータを分析する方法など、本開示の方法の様々な態様を調節することができる。コンピュータ制御システム４０１は、ユーザの電子デバイスまたは電子デバイスに対して遠隔に配置されたコンピュータシステムに実装することができる。電子デバイスは、モバイル電子デバイスであり得る。
コンピュータシステム４０１は、中央演算処理装置（ＣＰＵ、本明細書における「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」でもある）４０５を含み、これは、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数のプロセッサであり得る。コンピュータ制御システム４０１はまた、メモリまたはメモリロケーション４１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶ユニット４１５（例えば、ハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インターフェース４２０（例えば、ネットワークアダプタ）、ならびにキャッシュ、他のメモリ、データ記憶および／または電子ディスプレイアダプタなどの周辺デバイス４２５を含む。メモリ４１０、記憶ユニット４１５、インターフェース４２０および周辺デバイス４２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ４０５と通信する。記憶ユニット４１５は、データを保存するためのデータ記憶ユニット（またはデータリポジトリ）であり得る。コンピュータ制御システム４０１は、通信インターフェース４２０の補助を用いてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）４３０に動作可能に接続することができる。ネットワーク４３０は、インターネット、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信しているイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであり得る。ネットワーク４３０は、場合によっては、電気通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク４３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にすることができる１つ以上のコンピュータサーバを含むことができる。ネットワーク４３０は、場合によっては、コンピュータシステム４０１を使用して、ピア・ツー・ピア・ネットワークを実装することができ、これにより、コンピュータシステム４０１に接続されたデバイスがクライアントまたはサーバとして動作することが可能になり得る。
ＣＰＵ４０５は、一連の機械可読命令を実行することができ、これは、プログラムまたはソフトウェアで具体化することができる。命令は、メモリ４１０などのメモリロケーションに保存することができる。命令は、ＣＰＵ４０５に向けることができ、これは、その後、本開示の方法を実施するようにＣＰＵ４０５をプログラムするか、または別の方法で構成することができる。ＣＰＵ４０５によって実行される動作の例としては、フェッチ、デコード、実行、およびライトバックを挙げることができる。
ＣＰＵ４０５は、集積回路などの回路の一部であり得る。システム４０１の１つ以上の他のコンポーネントを回路に含めることができる。場合によっては、回路は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
記憶ユニット４１５は、ドライバ、ライブラリおよび保存されたプログラムなどのファイルを保存することができる。記憶ユニット４１５は、ユーザデータ、例えば、ユーザ設定およびユーザプログラムを保存することができる。場合によっては、コンピュータシステム４０１は、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステム４０１と通信するリモートサーバ上に配置されるなど、コンピュータシステム４０１の外部にある１つ以上の追加データ記憶ユニットを含むことができる。
コンピュータシステム４０１は、ネットワーク４３０を介して１つ以上のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム４０１は、ユーザ（例えば、スマートウェアラブル製品を制御するユーザ）のリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例としては、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートもしくはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、または携帯情報端末が挙げられる。ユーザは、ネットワーク４３０を介してコンピュータシステム４０１にアクセスすることができる。
本明細書に記載の方法は、例えば、メモリ４１０または電子記憶ユニット４１５などのコンピュータシステム４０１の電子記憶ロケーションに保存された機械（例えば、コンピュータプロセッサ）実行可能コードにより実施することができる。機械実行可能コードまたは機械可読コードは、ソフトウェアの形式で提供することができる。使用中、コードはプロセッサ４０５によって実行され得る。場合によっては、コードは、記憶ユニット４１５から検索され、プロセッサ４０５による即時アクセスのためにメモリ４１０に保存され得る。状況によっては、電子記憶ユニット４１５を排除することができ、機械実行可能命令がメモリ４１０に保存される。
コードは、コードを実行するように適合されたプロセッサを有する機械で使用するために予めコンパイルおよび構成するか、または実行時にコンパイルすることができる。コードは、コードが予めコンパイル済みまたはコンパイル時の方式で実行することを可能にするように選択され得る、プログラミング言語で供給され得る。
コンピュータシステム４０１など、本明細書で提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングで具体化することができる。技術の様々な態様は、典型的には、機械（またはプロセッサ）実行可能コードおよび／または機械可読媒体のタイプで実行または具現化される関連データの形式の「製品」または「製造品」であると考えることができる。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子記憶ユニットに保存することができる。「記憶」タイプの媒体は、コンピュータ、プロセッサなどの有形のメモリ、または様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどの関連モジュールのいずれかまたはすべてを含むことができ、これらはソフトウエアプログラミングのためにいつでも非一時的な記憶を提供することができる。ソフトウェアの全部または一部は、インターネットまたは他の様々な電気通信ネットワークを介して通信される場合がある。そのような通信は、例えば、あるコンピュータまたはプロセッサから別のコンピュータまたはプロセッサへ、例えば、管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのロードを可能にすることができる。したがって、ソフトウェア要素を保持する可能性のある別のタイプの媒体には、ローカルデバイス間の物理的インターフェースを介して、有線および光地上回線ネットワークを介して、ならびに様々なエアリンクを介して使用されるような、光、電気、および電磁波が含まれる。有線または無線リンク、光リンクなどのような波を搬送する物理的要素も、ソフトウェアを保持した媒体とみなすことができる。本明細書で使用する場合、非一時的な有形の「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータまたは機械の「可読媒体」などの用語は、一般に、実行のためにプロセッサに命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。
したがって、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体または物理的伝送媒体を含むがこれらに限定されない多くの形態をとることができる。非揮発性記憶媒体としては、例えば、図面に示すデータベースなどを実装するために使用され得るような、任意のコンピュータなどにおける記憶デバイスのいずれかのような、光または磁気ディスクが挙げられる。揮発性記憶媒体には、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどの動的メモリが含まれる。有形の伝送媒体には、同軸ケーブル、コンピュータシステム内のバスを構成するワイヤを含む銅線および光ファイバーが含まれる。搬送波伝送媒体は、電気信号もしくは電磁信号、または無線周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるような音響波もしくは光波の形態をとることができる。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態としては、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード穿孔テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、データまたは命令を搬送する搬送波、そのような搬送波を搬送するケーブルもしくリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／またはデータを読み取ることができる任意の他の媒体が挙げられる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを、実行のためにプロセッサに搬送することに関与し得る。
コンピュータシステム４０１は、例えば、スラリーを生成するための、および／またはスラリーを基板に適用するための、パラメータを提供するためのユーザインターフェース（ＵＩ）４４０を備える電子ディスプレイ４３５を含むか、またはそれと通信することができる。ＵＩの例としては、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブベースのユーザインターフェースが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の方法およびシステムは、１つ以上のアルゴリズムによって実施することができる。アルゴリズムは、中央演算処理装置４０５による実行時にソフトウェアによって実施することができる。このアルゴリズムは、例えば、スマートウェアラブル製品からデータを収集し、定義された期間にわたるデータの変化についてデータを分析することができる。
材料および方法
試料調製
化学的参照標準を、抽出溶液中に１μＭの濃度で調製し、ＬＣ－ＭＳで分析して保持時間および特徴的なイオン質量を確認した。
約１００ｍｇの試料を２０μＬの水性添加剤および１００μＬのメタノール中でホモジナイズして、混合物を５０ｍＭの重炭酸アンモニウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、トリプシン（１：２０ｍ／ｍのトリプシン：タンパク質）、および約１０％の乾燥試料質量の最終濃度にする。試料消化混合物を回転させながら３７℃で４時間インキュベートする。消化後、試料を１００μＬのアセトニトリルおよび１００μＬのアセトンで処理し、４℃で１５分間平衡状態にする。試料を１５０００ｘｇで５分間遠心分離にかけ、上清を新しいバイアルに移し、ＬＣ－ＭＳ分析まで４℃で保存する。
液体クロマトグラフィー
分析物は、プレカラムフィルタおよびガードカラムを装備したＤｉｏｎｅｘ Ｔｒｉｎｉｔｙ Ｐ１ ２．１ｍｍ×１５０ｍｍという、陽イオン交換および陰イオン交換ならびに逆相特性を特徴とする混合モードクロマトグラフィーを用いて分離される。溶媒プログラミングは、以下の移動相である、移動相Ａ－９５：５の水：０．１％ギ酸および５ｍＭ酢酸アンモニウムを含むアセトニトリル、移動相Ｂ－９５：５のアセトニトリル：０．１％ギ酸および５ｍＭ酢酸アンモニウムを含む水、ならびに移動相Ｃ－５０：５０の水：２００ｍＭギ酸および２００ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノールからなる２つの線形勾配で構成される。すべての移動相に５μＭのメドロン酸を加えて、リン酸化化合物のクロマトグラフィーおよび検出を改善する。線形勾配プログラミングは、２００μＬ／分および３０℃で順方向では１００％Ａから１００％Ｂから１００％Ｃへ、逆方向では０、２０、４０、４５、５０、および６０分でそれぞれ進行する。勾配プログラミングの前方部分を長くすることにより実行を延長する。分析に使用する機器に応じて、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＲＳ ＵＨＰＬＣまたはＴｈｅｒｍｏ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ＨＰＬＣオートサンプラーおよびＬＣスタックのいずれかを使用する。
質量分析検出
溶離液は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＰｌｕｓまたはＴｈｅｒｍｏ ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬのいずれかのエレクトロスプレーイオン化源によってＭＳに導入される。分析の前に、標準的な正および負のＥＳＩ較正溶液を用いて外部較正を実施した。質量分析計は、正および負のイオンモードの両方においてＭＲＦＡペプチドに対する感度を最大化するように最適化された質量分析計パラメータを使用して、正および負のイオンモードの両方において動的排除を伴う低または高解像度のＭＳ２データ依存性取得を伴う高解像度フルスキャンを取得するように設定される。
酵素消化
酵素およびトリプシン原液を、供給元の指示に従って１０ｍｇ／ｍＬで調製する。酵素溶液（１０μＬ）およびトリプシン溶液（１０ｕＬ）を基質溶液（１００μＬ）に加え、回転させながら３７℃で１８時間インキュベートする。必要に応じて、基質または酵素を含まない同等の溶液を陰性対照として代用する。反応を、有機溶媒（２００μＬの１：１のアセトニトリル：アセトン）を加えることにより停止させる。
データ分析
化学的多様性および認識された生物医学的重要性に基づいて選択された、選択された化合物を定量化するために使用されるＴｈｅｒｍｏ Ｑｕａｌブラウザを使用して定性的データ分析を実施した。ピーク面積をフルスキャンで測定し、追加された内部標準（注入量を調整するため）および一定の汚染イオン（イオン化効率を調整するため）によって正規化した。
生のＬＣ－ＭＳデータを、ＯｐｅｎＭＳで処理するためにｐｒｏｔｅｏｗｉｚａｒｄを使用してｍｚＭＬ形式に変換した。ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションスペクトルを、！Ｔａｎｄｅｍペプチドマッピングアルゴリズムを使用して、ヒト、逆デコイ、およびｃＲＡＰタンパク質から生成されたトリプシンペプチド配列に一致させた。フラグメンテーションスペクトルもＳｉｒｉｕｓアダプタを使用して代謝産物と一致させた。特徴は、質量追跡アプローチを使用して同定し、２０％を上回る試料で検出された場合に保持した。特徴は、Ｒソフトウェア環境で分析するためにタブ区切りテキストにエクスポートした。強度をｌｏｇ１０変換し、データを、ペプチド、脂質、および代謝産物の強度中央値について線形調整することによって、総量、消化および抽出効率、ならびに注入された総量および機器の感度について正規化した。
前述の方法を使用して、ヒト血漿で検出されたものとして提示された選択された分析物を図２に示す。時間および強度のピーク面積を、それぞれ横軸および縦軸に示す。選択された分析物は、ナトリウム、コレステロール、フェニルアラニン、クレアチニン、フルクトサミン（および異性体）、トリグリセリド異性体（５２：２）、トリプシンアルブミンペプチド、ならびにビリルビンである。図３は、５回の繰り返しで５つの異なる血漿試料にわたる選択された分析物の箱ひげ図を示す。各分析物の名称を各ドットプロットの上に記載し、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓのｐ値は、試料の中央値間の差のいずれかが統計的に有意であるかどうかを示す。試料番号およびｌｏｇ１０スケールの強度のピーク面積を、それぞれ横軸および縦軸に示す。点は各試料の５回の測定値を示し、水平線はすべての繰り返しの４分位を示す。
図４は、酵素なしで消化し、記載された手順に従って分析したマウス肝臓ホモジネートから得られたスペクトルを示す。時間および質量電荷比を横軸および縦軸に示し、色の輝度の増加はより高いイオン強度を表す。選択した分析物クラスのおおよその位置は、以前の観察に従って標識されている。
図５は、ＲＮａｓｅ Ａで消化し、記載された手順に従って分析したマウス肝臓ホモジネートから得られたスペクトルを示す。時間および質量電荷比を横軸および縦軸に示し、色の輝度の増加はより高いイオン強度を表す。選択した分析物クラスのおおよその位置は、以前の観察に従って標識されている。
図６は、ＲＮａｓｅ Ａおよびトリプシンで消化し、記載された手順に従って分析したマウス肝臓ホモジネートから得られたスペクトルを示す。時間および質量電荷比を横軸および縦軸に示し、色の輝度の増加はより高いイオン強度を表す。選択した分析物クラスのおおよその位置は、以前の観察に従って標識されている。
図７は、トリプシンで消化し、記載された手順に従って分析した培養ヒト肝臓がん細胞から得られたスペクトルを示す。時間および質量電荷比を横軸および縦軸に示し、色の輝度の増加はより高いイオン強度を表す。選択した分析物クラスのおおよその位置は、以前の観察に従って標識されている。
図８は、トリプシンで消化し、記載された手順に従って分析したヒト血漿から得られたスペクトルを示す。時間および質量電荷比を横軸および縦軸に示し、色の輝度の増加はより高いイオン強度を表す。選択した分析物クラスのおおよその位置は、以前の観察に従って標識されている。
図９は、トリプシンで消化し、ｏｍｎｉ－ＭＳの手順に従って分析したウシ脂肪から得られたスペクトルを示す。時間および質量電荷比を横軸および縦軸に示し、色の輝度の増加はより高いイオン強度を表す。選択した分析物クラスのおおよその位置は、以前の観察に従って標識されている。
図１０は、トリプシンで消化し、ｏｍｎｉ－ＭＳの手順に従って分析した、得られたヒト尿のスペクトルを示す。時間および質量電荷比を横軸および縦軸に示し、色の輝度の増加はより高いイオン強度を表す。選択した分析物クラスのおおよその位置は、以前の観察に従って標識されている。
図１１、左パネル、代表的な血漿試料および繰り返しにわたるイオンビンの代表的なペアワイズ散布図。横軸および縦軸は、イオンビン内で見られるｌｏｇ１０の強度計数に対応する。右パネル：血漿試料および繰り返しの相関関係に基づく階層的クラスタリング。縦軸はプロファイル間の相関関係における距離であり、試料はおおよそ相関関係による最短距離に従って順序付けられる。
マルチオミックデータからの既知の臨床的適応の同定
マルチオミックデータは、上記または本明細書の他の箇所に記載のマルチオミック法を使用して、バイオバンク化された臨床血漿または血清試料から得られた。得られたマルチオミックデータ（すなわち、図１２Ｂ、１３Ｂ、１４Ｂ、１５Ｂ、および１６Ｂのスペクトログラム）は、検出された分析物の質量対電荷比および保持時間に基づいて、各々が検出された分析物を表すピクセル「ビン」にまとめられた。得られたマルチオミックデータを、その後、偽発見率（ＦＤＲ）を有するマンハッタンプロットなどのバイオインフォマティクスを使用して分析し、少なくとも１つの臨床指標との統計的関連を同定した。選択された臨床指標は、年齢または加齢（図１２Ａ～１２Ｂ）、心血管疾患リスク（図１３Ａ～１３Ｂ）、心不全（図１４Ａ～１４Ｂ）、炎症（図１５Ａ～１５Ｂ）、または認知症（図１６Ａ～１６Ｂ）などの疾患または状態と関連することが知られていた。特に、マンハッタンプロット（すなわち、図１２Ａ、１３Ａ、１４Ａ、１５Ａ、および１６Ａ）を使用して、統計的に有意な分析物を示した。
図１２Ａ、１３Ａ、１４Ａ、１５Ａ、および１６Ａはそれぞれ、単一の試料からの様々なマルチオミックに検出された分析物と、年齢、心血管疾患、心不全、炎症、および認知症と関連する臨床変数との間の統計的関連を示すマンハッタンプロットを示す。統計的関連の結果を、偽発見率（ＦＤＲ）閾値：＜０．２（赤色の三角形）、０．２（含める）～０．５（緑色の四角）、および≧０．５（灰色の円）でフィルタリングした。
図１２Ｂ、１３Ｂ、１４Ｂ、１５Ｂ、および１６Ｂはそれぞれ、対応するマンハッタンプロットで分析された血液試料のマルチオミックスペクトログラムを示す。０．３偽発見率（ＦＤＲ）閾値に収まる分析物を四角でマークした。
マルチオミックデータを使用したモデルの訓練および検証
予測モデルである交差検証を用いたエラスティックネット回帰モデル（参照によりその全体が組み込まれるＺｏｕ ａｎｄ Ｈａｓｔｉｅ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）６７．２（２００５）：３０１－３２０）に記載されているものなど）を使用して、上記または本明細書の他の箇所に記載のマルチオミック方法を使用して得られたマルチオミックデータが、予測モデルを訓練するために使用することができることを実証した。当業者は、他の機械学習アルゴリズム（線形回帰（例えば、ＬａｓｓｏまたはＲｉｄｇｅ）またはサポートベクターマシンなど）が、上記または本明細書の他の箇所に記載のマルチオミック方法を使用して得られたマルチオミックデータによって訓練することができることを理解するであろう。交差検証法（１０分割交差検証など）では、ｌｅａｖｅ ｏｎｅ ｏｕｔ戦略を実行した。当業者は、１つの１０分割交差検証アプローチにおいて、得られたマルチオミックデータがランダムに１０のサブセットに分割され得、そのうちの９つが訓練に使用され、１つがすべての順列にわたって試験に使用されることを理解するであろう。モデルの訓練にはさらに、交差検証試験セット誤差を最小にするためにハイパーパラメータ設定を調整することが含まれた。次に、訓練された予測モデルを残りのサブセットで試験して、マルチオミックデータから臨床標識（指標）を予測した。前述の予測モデルおよび訓練戦略を使用して、一度に１つの指標を予測した。
図１２Ｃは、機械学習モデルの自由度を変化させながら、ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ交差検証を使用した年齢に関する一連の予測の平均絶対誤差（ＭＡＥ）を示す。図１２Ｃの下軸は、モデルがアクセスできる自由度を制御するエラスティックネット回帰モデルの単位のないパラメータ設定を示す。図１２Ｃの上軸は、予測を行うために使用されたデータから選択された変数の数を示す。図１２Ｃの左縦軸は、上述した１０分割交差検証で測定年齢と比較した、予測年齢（歳）の平均絶対誤差を示す。
図１３Ｃは、機械学習モデルの自由度を変化させながら、ＡｐｏＢのｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ交差検証に関する一連の予測の平均絶対誤差（ＭＡＥ）を示す。図１３Ｃの下軸は、モデルがアクセスできる自由度を制御するエラスティックネット回帰モデルの単位のないパラメータ設定を示す。図１３Ｃの上軸は、予測を行うために使用されたデータから選択された変数の数を示す。図１３Ｃの左縦軸は、上述した１０分割交差検証で測定値と比較した、予測されたＡｐｏＢレベル（ｍｇ／ｄＬ）の平均絶対誤差を示す。
図１４Ｃは、機械学習モデルの自由度を変化させながら、ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ交差検証を使用したＮ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ＰｒｏＢＮＰ）に関する一連の予測の平均絶対誤差（ＭＡＥ）を示す。図１４Ｃの下軸は、モデルがアクセスできる自由度を制御するエラスティックネット回帰モデルの単位のないパラメータ設定を示す。図１４Ｃの上軸は、予測を行うために使用されたデータから選択された変数の数を示す。図１４Ｃの左縦軸は、上述した１０分割交差検証で測定値と比較した、予測されたＮＴ－ＰｒｏＢＮＰレベル（ｐｇ／ｍＬ）の平均絶対誤差を示す。
図１５Ｃは、機械学習モデルの自由度を変化させながら、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ交差検証に関する一連の予測の平均絶対誤差（ＭＡＥ）を示す。図１５Ｃの下軸は、モデルがアクセスできる自由度を制御するエラスティックネット回帰モデルの単位のないパラメータ設定を示す。図１５Ｃの上軸は、予測を行うために使用されたデータから選択された変数の数を示す。図１５Ｃの左縦軸は、上述した１０分割交差検証で測定値と比較した、予測されたＣＲＰレベル（ｍｇ／Ｌ）の平均絶対誤差を示す。
図１６Ｃは、機械学習モデルの自由度を変化させながら、ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｏｕｔ交差検証を使用した臨床認知症対対照の分類に関する一連の予測の平均絶対誤差（ＭＡＥ）を示す。図１６Ｃの下軸は、モデルがアクセスできる自由度を制御するエラスティックネット回帰モデルの単位のないパラメータ設定を示す。図１６Ｃの上軸は、予測を行うために使用されたデータから選択された変数の数を示す。図１６Ｃの左縦軸は、１０分割交差検証（上述したもの）で測定した認知症と比較した、予測された認知症の平均絶対誤差（二項、誤分類誤差）を示す。
図１２Ｄ、１３Ｄ、１４Ｄ、１５Ｄ、および１６Ｄはそれぞれ、予測された臨床バイオマーカー（本明細書に記載の方法を使用）と実際の臨床バイオマーカーとを比較することによる予測精度を示す。相関係数（ｒ）をプロットの上に示し、サンプルサイズ（ｎ）をプロットの下に示す。
本明細書では本発明の特定の特徴が図示され、説明されてきたが、多くの修正、置換、変更、および同等物がここで、当業者に思いつくであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨に収まるように、すべてのそのような修正および変更を網羅することを意図することを理解されたい。
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本発明が、本明細書内で提供される特定の実施例によって限定されることを意図するものではない。本発明は前述の明細書を参照して説明されてきたが、本明細書の実施形態の説明および図解は、限定的な意味で解釈されることを意図するものではない。多数の変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく、ここで、当業者に思いつくであろう。さらに、本発明のすべての態様は、様々な条件および変数に依存する、本明細書に記載の特定の描写、構成または相対的な比率に限定されないことを理解されたい。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替案が、本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。したがって、本発明は、いずれのそのような代替案、修正、変形または同等物も網羅するものと考えられる。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物は、それによって網羅されることが意図される。

Claims (100)

  1. 単一の試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性または量を実質的に同時に決定するための方法であって、
    ａ．前記試料中の生体高分子を変性させる変性試薬または処理で前記試料を処理し、それによって変性試料を形成することであって、前記変性試薬または処理が、標準化試薬に加えられたときに標準化試薬の成分を変性させない、形成することと、
    ｂ．前記変性試料を前記標準化試薬で処理することであって、標準化剤が、前記変性試料中の前記複数の分析物を、標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種に変換し、前記種が、複数モードのクロマトグラフィーによって分離され、質量分析によって個別に同定されることができ、それによって標準化された試料を形成する、処理することと、
    ｃ．前記標準化された試料を抽出試薬で処理し、内部に可溶性分析物種および分析物フラグメント種を保持し、それによって抽出された試料を形成することと、
    ｄ．前記抽出された試料を、複数モードのクロマトグラフィー、続いて質量分析（ＭＳ）に供し、それによって、内部に存在する各標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種についてのそこからのデータが生成されることと、
    ｅ．前記抽出された試料中に存在する前記複数の分析物の前記存在、同一性または量を前記データから計算的に決定することと、を含む、方法。
  2. 前記分析物が、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、電解質、金属、小分子、揮発性化合物、外因性化学物質、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記試料が生物試料である、請求項１または２に記載の方法。
  4. ステップ（ａ）の前または最中に、前記試料がホモジナイズされる、請求項１に記載の方法。
  5. 前記変性試薬または処理が、１つ以上の溶媒、１つ以上のカオトロピック剤、熱、圧力、照射、１つ以上の参照標準、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記変性試薬または処理が、金属キレート化剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  7. 変性ステップおよび前記変性試料を前記標準化試薬で処理することが、実質的に同時に行われる、請求項１に記載の方法。
  8. 前記標準化試薬が膵臓内部溶解酵素（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｎｄｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記標準化試薬が、１つ以上のプロテイナーゼ、１つ以上のヌクレアーゼ、１つ以上のグリコシダーゼ、１つ以上のリパーゼ、１つ以上のキレート剤、１つ以上の緩衝剤、１つ以上の還元剤、１つ以上の誘導体化剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記標準化試薬が、トリプシン、リボヌクレアーゼＡ、ＥＤＴＡ、重炭酸アンモニウムまたはアミラーゼを含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記標準化試薬がＤＮＡｓｅ Ｉを含む場合、ＥＤＴＡが同時に存在しない、請求項９に記載の方法。
  12. 前記複数モードのクロマトグラフィーが、逆相分離、陽イオン交換分離、陰イオン交換分離、イオン対分離、順相分離、イオン移動度分離、サイズ排除分離、キラル分離、アフィニティー分離、配位子交換分離、極性非イオン分離、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
  13. 前記クロマトグラフィーで使用される移動相が、アンモニウム、プロトン、ナトリウム、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、メドロネート、尿素、ビウレット、トリウレット、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上のイオン化付加物をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 質量分析データ取得が、正および負のイオンモードの両方で動的排除を伴う、低または高解像度のＭＳ２データ非依存性またはデータ依存性取得を伴う高解像度フルスキャンを含む、請求項１に記載の方法。
  15. 前記抽出された試料中に存在する前記複数の分析物の前記存在、同一性または量を前記データから前記計算的に決定することが、前記標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種の前記データを、既知量の既知の分析物から生成されたそれらの種の前記質量分析と比較することを含む、請求項１に記載の方法。
  16. 生物試料が由来する生体源の病的状態を決定するための方法であって、
    ａ．請求項１に従って、前記生物試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性または量を実質的に同時に決定することと、
    ｂ．内部の前記分析物の前記存在、同一性または量を、病状を伴わない生体源試料からの生物試料のものと比較することであって、前記病的状態が、複数の分析物の前記存在、同一性または量の変化から同定可能である、比較することと、
    ｃ．前記生体源の前記病的状態を決定することと、を含む、方法。
  17. 単一の試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性または量を実質的に同時に決定するための装置であって、
    ａ．前記試料中の生体高分子を変性させ、それによって変性試料を形成するための手段であって、前記変性させることが、標準化試薬に加えられたときに標準化試薬の成分を変性させない、手段と、
    ｂ．前記試料を標準化するための手段であって、前記変性試料中の複数の分析物が、標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種に変換され、前記種が、複数モードのクロマトグラフィーによって分離され、質量分析によって個別に同定されることができる、手段と、
    ｃ．前記標準化された試料を抽出し、内部に可溶性分析物種および分析物フラグメント種を保持するための手段と、
    ｄ．前記抽出された試料を、複数モードのクロマトグラフィー、続いて質量分析に供するための手段であって、それによって、内部に存在する各標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種についてのそこからのデータが生成される、手段と、
    ｅ．前記抽出された試料中に存在する前記複数の分析物の前記存在、同一性または量を前記データから計算的に決定するための手段と、を含む、装置。
  18. 前記分析物が、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、電解質、金属、小分子、揮発性化合物、外因性化学物質、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１７に記載の装置。
  19. 前記試料が生物試料である、請求項１７または１８に記載の装置。
  20. 前記試料をホモジナイズするための手段が、ステップ（ａ）の前または最中に提供される、請求項１７に記載の装置。
  21. 前記試料中の生体高分子を変性させるための手段が、１つ以上の溶媒、１つ以上のカオトロピック剤、熱、圧力、照射、１つ以上の参照標準、もしくはそれらの任意の組み合わせを含む、変性試薬または処理の使用を含む、請求項１７に記載の装置。
  22. 前記変性させることが、金属キレート化をさらに含む、請求項１７に記載の装置。
  23. 前記変性させることおよび標準化することが、実質的に同時に行われる、請求項１７に記載の装置。
  24. 前記標準化試薬が膵臓内部溶解酵素を含む、請求項１７に記載の装置。
  25. 前記標準化試薬が、１つ以上のプロテイナーゼ、１つ以上のヌクレアーゼ、１つ以上のグリコシダーゼ、１つ以上のリパーゼ、１つ以上のキレート剤、１つ以上の緩衝剤、１つ以上の還元剤、１つ以上の誘導体化剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１７に記載の装置。
  26. 前記標準化試薬が、トリプシン、リボヌクレアーゼＡ、ＥＤＴＡ、重炭酸アンモニウムまたはアミラーゼを含む、請求項２５に記載の装置。
  27. 前記標準化試薬がＤＮＡｓｅ Ｉを含む場合、ＥＤＴＡが同時に存在しない、請求項２５に記載の装置。
  28. 前記プロテイナーゼが、前記変性試料の前記標準化試薬の他の成分とのインキュベーションと同時にまたはその後に前記変性試料に加えられる、請求項２５に記載の装置。
  29. 複数モードのクロマトグラフィーのための前記手段が、逆相分離、陽イオン交換分離、陰イオン交換分離、イオン対分離、順相分離、イオン移動度分離、サイズ排除分離、キラル分離、アフィニティー分離、配位子交換分離、極性非イオン分離、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１７に記載の装置。
  30. 前記クロマトグラフィーで使用される移動相が、アンモニウム、プロトン、ナトリウム、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、メドロネート、尿素、ビウレット、トリウレット、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上のイオン化付加物をさらに含む、請求項２９に記載の装置。
  31. 質量分析データ取得が、正および負のイオンモードの両方で動的排除を伴う、低または高解像度のＭＳ２データ非依存性またはデータ依存性取得を伴う高解像度フルスキャンを含む、請求項１７に記載の装置。
  32. 前記抽出された試料中に存在する前記複数の分析物の前記存在、同一性または量を前記データから計算的に決定するための前記手段が、前記標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種の前記データを、既知量の既知の分析物から生成されたそれらの種の前記質量分析と比較することを含む、請求項１７に記載の装置。
  33. 生物試料が由来する生体源の状態を決定するための方法であって、
    ａ．請求項１７に記載の装置を利用して、前記生物試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性または量を実質的に同時に決定することと、
    ｂ．内部の前記分析物の前記存在、同一性または量を、病状を伴わない生体源試料からの生物試料のものと比較することであって、病的状態が、複数の分析物の前記存在、同一性または量の変化から同定可能である、比較することと、
    ｃ．前記生体源の前記病的状態を決定することと、を含む、方法。
  34. 単一の試料中に存在する複数の、化学的に関連する分析物および化学的に関連しない分析物の存在、同一性または量を実質的に同時に決定するためのシステムであって、
    ａ．前記試料中の生体高分子を変性させ、それによって変性試料を形成する変性試薬または処理であって、前記変性試薬または処理が、標準化試薬に加えられたときに標準化試薬の成分を変性させない、変性試薬または処理と、
    ｂ．前記試料中の前記複数の分析物を、混合モード液体クロマトグラフィーによって分離され、タンデム質量分析によって個別に同定されることができる、標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種に変換する、標準化試薬と、
    ｃ．前記可溶性分析物種および分析物フラグメント種を抽出する抽出試薬と、
    ｄ．内部に前記可溶性分析物種および分析物フラグメント種を保持し、それによって抽出された試料を形成するための分離行程と、
    ｅ．可溶性分析物種および分析物フラグメント種を分解する複数モードのクロマトグラフィーと、
    ｆ．個々の種に関するデータを生成する質量分析と、
    ｇ．各標準化された分析物種および標準化された分析物フラグメント種の前記データから、前記試料中に存在する前記複数の分析物の前記存在、同一性または量を計算的に決定するための１つ以上のアルゴリズムと、を含む、システム。
  35. 前記分析物が、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、電解質、金属、小分子、揮発性化合物、外因性化学物質、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３４に記載のシステム。
  36. 前記試料が生物試料である、請求項３４または３５に記載のシステム。
  37. ステップ（ａ）の前または最中に、前記試料がホモジナイズされる、請求項３４に記載のシステム。
  38. 前記変性試薬または処理が、１つ以上の溶媒、１つ以上のカオトロピック剤、熱、圧力、照射、１つ以上の参照標準、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３４に記載のシステム。
  39. 前記変性試薬または処理が、金属キレート化剤をさらに含む、請求項３４に記載のシステム。
  40. 前記変性ステップおよび前記変性試料を前記標準化試薬で処理することが、実質的に同時に行われる、請求項３４に記載のシステム。
  41. 前記標準化試薬が膵臓内部溶解酵素を含む、請求項３４に記載のシステム。
  42. 前記標準化試薬が、１つ以上のプロテイナーゼ、１つ以上のヌクレアーゼ、１つ以上のグリコシダーゼ、１つ以上のリパーゼ、１つ以上のキレート剤、１つ以上の緩衝剤、１つ以上の還元剤、１つ以上の誘導体化剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３４に記載のシステム。
  43. 前記標準化試薬が、トリプシン、リボヌクレアーゼＡ、ＥＤＴＡ、重炭酸アンモニウムまたはアミラーゼを含む、請求項４２に記載のシステム。
  44. 前記標準化試薬がＤＮＡｓｅ Ｉを含む場合、ＥＤＴＡが同時に存在しない、請求項４２に記載のシステム。
  45. 前記プロテイナーゼが、前記変性試料の前記標準化試薬の他の成分とのインキュベーションと同時にまたはその後に前記変性試料に加えられる、請求項４２に記載のシステム。
  46. 複数モードのクロマトグラフィーが、逆相分離、陽イオン交換分離、陰イオン交換分離、イオン対分離、順相分離、イオン移動度分離、サイズ排除分離、キラル分離、アフィニティー分離、配位子交換分離、極性非イオン分離、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３４に記載のシステム。
  47. 前記クロマトグラフィーで使用される移動相が、アンモニウム、プロトン、ナトリウム、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、メドロネート、尿素、ビウレット、トリウレット、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上のイオン化付加物をさらに含む、請求項４６に記載のシステム。
  48. 質量分析データ取得が、正および負のイオンモードの両方で動的排除を伴う、低または高解像度のＭＳ２データ非依存性またはデータ依存性取得を伴う高解像度フルスキャンを含む、請求項３４に記載のシステム。
  49. 前記抽出された試料中に存在する前記複数の分析物の前記存在、同一性または量を前記データから前記計算的に決定することが、前記標準化された分析物種または標準化された分析物フラグメント種の前記データを、既知量の既知の分析物から生成されたそれらの種の前記質量分析と比較することを含む、請求項３４に記載のシステム。
  50. 生物試料が由来する生体源の病的状態を決定するための方法であって、
    ａ．請求項３４に記載のシステムを利用して、前記生物試料中に存在する複数の分析物の存在、同一性または量を実質的に同時に決定することと、
    ｂ．内部の前記分析物の前記存在、同一性または量を、病状を伴わない生体源試料からの生物試料のものと比較することであって、前記病的状態が、複数の分析物の前記存在、同一性または量の変化から同定可能である、比較することと、
    ｃ．前記生体源の前記病的状態を決定することと、を含む、方法。
  51. 試料から異なるタイプの複数の分析物を同定するための方法であって、
    （ａ）異なるタイプの前記複数の分析物を含有するか、または含有することが疑われる前記試料を、前記複数の分析物またはそれらの誘導体を含む溶液を生成するのに十分な条件に供することと、
    （ｂ）機器を使用して前記溶液を処理して、前記複数の分析物またはそれらの誘導体を同定し、それによって前記複数の分析物を同定することであって、前記複数の分析物またはそれらの誘導体が、前記機器の単一の実行で同定される、同定することと、を含む、方法。
  52. 前記複数の分析物が、タンパク質、核酸、小分子、脂質、炭水化物、電解質、および金属からなる群から選択される分析物のうちの少なくとも３つのタイプを含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記複数の分析物が、
    小分子、脂質、および炭水化物から選択される分析物のうちの少なくとも１つのタイプと、
    タンパク質、核酸、電解質、および金属から選択される分析物のうちの少なくとも２つのタイプと、を含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記複数の分析物が、
    タンパク質、および核酸から選択される分析物のうちの少なくとも１つのタイプと、
    小分子、脂質、および炭水化物から選択される分析物のうちの少なくとも２つのタイプと、を含む、請求項５２に記載の方法。
  55. 前記溶液中の前記複数の分析物またはそれらの誘導体が、前記試料に含有されるか、または含有されることが疑われる前記複数の分析物とは異なる分子サイズまたは質量の分布を有する、請求項５１に記載の方法。
  56. 前記溶液中の前記複数の分析物またはそれらの誘導体が、前記試料に含有されるか、もしくは含有されることが疑われる前記複数の分析物とは異なる、荷電分子の量、親水性分子の量、疎水性官能基を有する分子の量、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５１に記載の方法。
  57. 前記溶液中の前記複数の分析物またはそれらの誘導体が、前記試料に含有されるか、または含有されることが疑われる前記複数の分析物よりも、所定の範囲に収まる分子の大きな質量パーセントを有する、請求項５１に記載の方法。
  58. 前記溶液中の前記複数の分析物またはそれらの誘導体が、前記試料に含有されるか、または含有されることが疑われる前記複数の分析物よりも狭い分子サイズまたは質量の分布を有する、請求項５１に記載の方法。
  59. 前記溶液中の前記複数の分析物またはそれらの誘導体が、前記試料に含有されるか、または含有されることが疑われる前記複数の分析物よりも、荷電分子の大きな質量パーセントを有する、請求項５１に記載の方法。
  60. 前記溶液中の前記複数の分析物またはそれらの誘導体が、前記試料に含有されるか、または含有されることが疑われる前記複数の分析物よりも、オクタノール－水分配係数で測定した際に、親水性分子の大きな質量パーセントを有する、請求項５１に記載の方法。
  61. 前記溶液中の前記複数の分析物またはそれらの誘導体が、前記試料に含有されるか、または含有されることが疑われる前記複数の分析物よりも狭い質量対電荷比（ｍ／ｚ）の分布を有し、その結果、前記溶液中の前記複数の分析物またはそれらの誘導体が、前記試料に含有されるか、または含有されることが疑われる前記複数の分析物よりも、質量分析によって検出可能な範囲に収まる分子の大きな質量パーセントを有する、請求項５１に記載の方法。
  62. 質量分析によって検出可能な前記範囲が、１００ダルトン／電子電荷（Ｄａ／ｅ）～２，０００Ｄａ／ｅである、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記溶液中の前記複数の分析物またはそれらの誘導体が、各々、１５ダルトン／電子電荷（Ｄａ／ｅ）～４，０００Ｄａ／ｅの質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有する、請求項６１に記載の方法。
  64. （ａ）が、処理された試料を得るために、以下の
    （ｉ）前記試料をホモジナイズすることと、
    （ｉｉ）前記試料を変性剤と接触させ、それによって前記複数の分析物のうちの少なくとも１つのコンフォメーションを変化させることと、
    （ｉｉｉ）前記試料をキレート剤と接触させ、それによって前記複数の分析物のうちの少なくとも１つとキレート錯体を形成することと、
    （ｉｖ）前記試料を誘導体化剤と接触させ、それによって前記複数の分析物のうちの少なくとも１つの誘導体を形成することと、
    （ｖ）前記試料を還元剤と接触させ、それによって前記複数の分析物のうちの少なくとも１つを修飾することと、
    （ｖｉ）前記試料を酵素と接触させ、それによって前記複数の分析物のうちの少なくとも１つのフラグメントを生成することと、のうちの１つまたは任意の組み合わせを含む、請求項５１に記載の方法。
  65. （ｉｉｉ）が１回以上行われる、請求項６４に記載の方法。
  66. （ｖｉ）が１回以上行われる、請求項６４に記載の方法。
  67. （ｉ）が、（ｉｉ）の前または実質的に同時に行われる、請求項６４に記載の方法。
  68. （ｉｉ）が（ｉｉｉ）と実質的に同時に行われる、請求項６４に記載の方法。
  69. （ｉｉ）が、（ｖｉ）の前または実質的に同時に行われる、請求項６４に記載の方法。
  70. （ｖｉ）が、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）のうちの１つ以上と実質的に同時に行われる、請求項６４に記載の方法。
  71. （ｖｉ）が（ｉｖ）と実質的に同時に行われる、請求項７０に記載の方法。
  72. （ｖｉ）が、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）と実質的に同時に行われる、請求項７１に記載の方法。
  73. （ｉｉｉ）が少なくとも２回、１回は（ｉ）と実質的に同時に、および再度（ｖｉ）と実質的に同時に行われる、請求項６４に記載の方法。
  74. （ｖｉ）が少なくとも２回、１回は（ｉｉ）と実質的に同時に、および再度（ｉｖ）と実質的に同時に行われる、請求項６４に記載の方法。
  75. （ｉ）が、１：５～５：１の体積比で水およびメタノールの混合物中で実施される、請求項６４に記載の方法。
  76. 前記変性剤が、溶媒、カオトロピック剤、および参照標準を含む、請求項６４に記載の方法。
  77. 前記誘導体化剤がペプチドアルキル化剤である、請求項６４に記載の方法。
  78. 前記誘導体化剤がヨードアセトアミドである、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記酵素が、（ｖｉ）の各存在とは独立して、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、およびリパーゼからなる群から選択される１つまたは任意の組み合わせを含む、請求項６４に記載の方法。
  80. 前記ヌクレアーゼが、ＤＮＡｓｅ ＩおよびリボヌクレアーゼＡの一方または両方を含む、請求項７９に記載の方法。
  81. ＤＮＡｓｅ ＩおよびＥＤＴＡが、（ｖｉ）において同時に存在しない、請求項８０に記載の方法。
  82. （ａ）が、前記処理された試料から前記複数の分析物またはそれらの誘導体を抽出試薬で抽出し、それによって前記溶液を得ることをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
  83. （ｂ）が、前記複数の分析物またはそれらの誘導体を電子ビームに供し、それによって、前記複数の分析物またはその誘導体のうちの少なくとも１つの、少なくとも１つのイオン化形態またはフラグメントを生成することを含む、請求項５１に記載の方法。
  84. （ｂ）が、前記複数の分析物またはそれらの誘導体を、少なくとも３つの直交クロマトグラフィーモードを含む混合モードクロマトグラフィーマトリックスと接触させることをさらに含み、前記少なくとも３つの直交クロマトグラフィーモードの各々が、前記溶液から前記複数の分析物またはそれらの誘導体の所与のタイプを分離するように構成されている、請求項５１に記載の方法。
  85. 前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスが、陽イオン交換特性、陰イオン交換特性、イオン排除特性、配位子交換特性、サイズ排除特性、キラル特性、逆相特性、アフィニティー特性、親水性特性、多座特性、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも３つの特性を含む、請求項８４に記載の方法。
  86. （ｂ）が、前記複数の分析物およびそれらの誘導体を少なくとも３つの移動相で溶出することをさらに含む、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記少なくとも３つの移動相のうちの少なくとも１つ、または前記第１の移動相、前記第２の移動相、および前記第３の移動相のうちの少なくとも１つが、アンモニウム、プロトン、ナトリウム、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、メドロネート、尿素、ビウレット、およびトリウレットからなる群から選択される１つ以上のイオン化付加物を含む、請求項８６に記載の方法。
  88. （ｂ）が、前記複数の分析物またはそれらの誘導体の各々の質量を質量分析によって決定することを含む、請求項５１に記載の方法。
  89. （ｂ）が、前記複数の分析物またはそれらの誘導体の各々の量を質量分析によって決定することを含む、請求項５１に記載の方法。
  90. 前記質量分析が、正および負のイオンモードの両方で動的排除を伴うか、または伴わない、データ非依存性またはデータ依存性取得によって生成される低または高解像度のフルスキャンまたはフラグメントスキャン質量分析である、請求項８８または８９に記載の方法。
  91. 前記質量または前記量を前記決定することが、前記低または高解像度質量分析特性を、１つ以上の参照質量フルまたはスペクトルと比較することを含む、請求項９０に記載の方法。
  92. 対象における疾患または状態を決定するための方法であって、
    （ｉ）複数の分析物の各々について同定された量を得るために、前記対象の単一の試料から、個別にまたは一括して、前記疾患または状態と関連することが知られている複数の分析物を同定することであって、前記複数の分析物が異なるタイプの分析物を含む、同定することと、
    （ｉｉ）複数の差の値を得るために、前記複数の分析物の前記各々について、参照量と前記同定された量との間の差を決定することと、
    （ｉｉｉ）前記複数の差の値に基づいて前記疾患または状態を決定するために、訓練された機械学習アルゴリズムを使用することと、を含む、方法。
  93. （ｉ）が、
    （ａ）前記複数の分析物を含有するか、または含有することが疑われる前記単一の試料を、前記複数の分析物またはそれらの誘導体を含む溶液を生成するのに十分な条件に供することと、
    （ｂ）前記溶液を使用して、前記複数の分析物またはそれらの誘導体を同定し、それによって前記複数の分析物を同定することと、を含む、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記訓練された機械学習アルゴリズムが、１７０以下の訓練試料を含む複数の訓練試料を使用して訓練される、請求項９２に記載の方法。
  95. 前記訓練されたアルゴリズムが、３０以下の訓練試料を含む複数の訓練試料を使用して訓練される、請求項９２に記載の方法。
  96. （ｉ）の前に、前記複数の訓練試料の各々から前記複数の分析物を同定することをさらに含む、請求項９２に記載の方法。
  97. 前記疾患または状態が、少なくとも８０％の精度で決定される、請求項９２に記載の方法。
  98. 前記疾患または状態が、加齢、心血管疾患、炎症、心不全、および認知症からなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。
  99. 前記複数の分析物が、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）、コルチゾール、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、およびＮ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ＰｒｏＢＮＰ）、およびそれらの誘導体からなる群から選択される１つ以上の分析物を含む、請求項９２に記載の方法。
  100. 前記複数の分析物が、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ポリペプチド、および代謝産物からなる群から選択される２つ以上の分析物を含む、請求項９２に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114935623A (zh) * 2022-05-18 2022-08-23 华谱科仪(大连)科技有限公司 一种检测食品中核苷酸的方法
CN117491549B (zh) * 2023-12-29 2024-04-05 中国矿业大学(北京) 一种磷脂酰胆碱异构体的定性定量方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6680203B2 (en) 2000-07-10 2004-01-20 Esperion Therapeutics, Inc. Fourier transform mass spectrometry of complex biological samples
WO2004023143A2 (de) 2002-09-03 2004-03-18 Zeptosens Ag Analytische plattform und nachweisverfahren
US7680609B2 (en) * 2002-09-05 2010-03-16 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology Biopolymer automatic identifying method
US7271912B2 (en) * 2003-04-15 2007-09-18 Optiscan Biomedical Corporation Method of determining analyte concentration in a sample using infrared transmission data
US7684934B2 (en) 2003-06-06 2010-03-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Pattern recognition of whole cell mass spectra
US20080112853A1 (en) * 2006-08-15 2008-05-15 Hall W Dale Method and apparatus for analyte measurements in the presence of interferents
AU2005337803B2 (en) * 2005-10-29 2013-04-18 Bayer Intellectual Property Gmbh Process for determining one or more analytes in samples of biological origin having complex composition, and use thereof
EP2157432A1 (en) * 2008-08-15 2010-02-24 Qiagen GmbH Method for analysing a complex sample by mass spectrometry
UA112515C2 (uk) * 2009-06-03 2016-09-26 Дау Аґросаєнсиз Елелсі Спосіб виявлення присутності двох або більше білків, що становлять інтерес, в зразках рослинного походження
KR101144237B1 (ko) * 2009-12-29 2012-05-11 한국기초과학지원연구원 고분해능 질량분석법과 약리활성검사를 이용한 천연물의 약리 활성물질 발굴 방법
US10865440B2 (en) * 2011-10-21 2020-12-15 IntegenX, Inc. Sample preparation, processing and analysis systems
CN107655985B (zh) * 2017-08-25 2020-05-26 南京农业大学 一种基于lc-ms-ms技术的体内蛋白质营养的评价方法

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