KR20210146931A - 다중 분석물의 동시 분석 - Google Patents

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오스틴 콰치
킴 프랜시스 폴
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더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

변성, 표준화, 추출, 혼합 모드 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법을 포함하는 단계를 수행하여, 단일 샘플 중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준을 결정함으로써, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준을 동시에 결정할 수 있는 방법, 장비 및 시스템이 기재되어 있다.

Description

다중 분석물의 동시 분석
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2019년 3월 28일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/825,610호의 이익을 주장하며, 상기 출원은 전적으로 모든 목적을 위해 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
분석 화학의 일반적인 통념은 생체분자 내에서 발견되는 방대한 화학적 다양성이 단일 방법을 사용하여 연구하기에 너무 크다고 말한다. 결과적으로, 주로 생체분자의 균질한 하위집합을 분석하는 데 노력을 기울여왔다. 이러한 방법 중에서, 질량 분석법과 결합된 액체 크로마토그래피(LC-MS)는 이러한 많은 분석에서 필수적인 분석 플랫폼으로 부상하였으며, 수많은 소분자 및 거대분자의 특성화에 사용되었다. 이러한 다양성에도 불구하고, LC-MS는 여전히 일반적으로 단일 부류의 생화학물질 분석에 사용된다. 다중-오믹스(multi-omics) 연구에서 다양한 생체정보 층을 결합함에 있어 관심이 커지고 있다. 다중-오믹스는 다양한 분석, 예컨대, 유전체학, 후성유전체학, 전사체학, 단백질체학, 당단백질체학, 당질체학, 지질체학, 대사체학, 흐름체학, 이온체학, 미생물군체학, 표현체학, 금속체학, 및 엑스포솜체학을 하나의 플랫폼으로 통합할 수 있는 기회를 제공한다. 그러나, 이들 방법은 컴퓨터를 이용하는 방법을 사용하여 별도의 데이터세트를 통합하는 것을 목표로 하며; 데이터 획득 전에 이러한 상이한 부류의 분석물을 결합할 가능성은 아직 밝혀지지 않은 상태이다.
본 발명이 지향하는 것은 단일 기기의 실행으로 다양한 생체분자의 결합된 분석을 수행하는 능력에 관한 것이다.
일 양태에서, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은
a. 샘플을 샘플 중 생체고분자를 변성시키는 변성 시약으로 처리하여 변성된 샘플을 형성하는 단계로서, 변성 시약 또는 처리는 첨가될 때 표준화 시약의 성분을 변성시키지 않는, 변성된 샘플을 형성하는 단계;
b. 변성된 샘플을 표준화 시약으로 처리하는 단계로서, 표준화 시약은 변성된 샘플 중 다중 분석물을 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종으로 전환시키고, 종은 다중 모드의 크로마토그래피에 의해 분리되고 질량 분석법에 의해 개별적으로 식별 가능함으로써, 표준화된 샘플을 형성하는, 처리하는 단계;
c. 표준화된 샘플을 추출 시약으로 처리하고 내부에 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 보유하여 추출된 샘플을 형성하는 단계;
d. 추출된 샘플에 다중 모드의 크로마토그래피를 적용한 다음 질량 분석법(MS)을 적용하여, 내부에 존재하는 각각의 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종에 대한 데이터를 생성하는 단계; 및
e. 데이터로부터 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준을 컴퓨터로 결정하는 단계
를 포함한다.
단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, 다중 분석물은 화학적으로 관련된 분석물 및 화학적으로 관련되지 않은 분석물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분석물은 단백질, 탄수화물, 핵산, 지질, 전해질, 금속, 대사물질, 휘발성 화합물, 외인성 화학물질, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분석물은 단백질, 탄수화물, 핵산, 지질, 전해질, 금속, 소분자, 휘발성 화합물, 외인성 화학물질, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 뇌척수액, 타액, 땀, 타액, 세포 또는 조직 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 수용액, 수성 현탁액 또는 수성 조직을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 단계 (a) 전에 또는 동안에 균질화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변성 시약 또는 처리는 하나 이상의 용매, 하나 이상의 카오트로픽제, 열, 압력, 방사선조사, 하나 이상의 참조 표준물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용매는 메탄올, 에탄올 또는 아세토나이트릴일 수 있다. 일부 실시형태에서, 용매는 메탄올이다. 일부 실시형태에서, 수성 샘플은 거의 동일한 양의 메탄올에서 균질화된다. 일부 실시형태에서, 변성 시약 또는 처리는 금속-킬레이트제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 금속-킬레이트제는 EDTA, EGTA 또는 DMSA이다. 일부 실시형태에서, 금속-킬레이트제는 EDTA이다. 일부 실시형태에서, 변성 단계 및 변성된 샘플을 표준화 시약으로 처리하는 것은 실질적으로 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약은 샘플에서 생체고분자를 해중합하는 하나 이상의 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약은 췌장 내용해 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약은 하나 이상의 프로테이나제, 하나 이상의 뉴클레아제, 하나 이상의 글리코시다제, 하나 이상의 리파제, 하나 이상의 킬레이트제, 하나 이상의 완충제, 하나 이상의 환원제, 하나 이상의 유도체화제, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유도체화제는 요오도아세트아마이드이다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약은 트립신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약은 트립신, 리보뉴클레아제 A, EDTA, 암모늄 바이카보네이트 또는 아밀라제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약이 DNase I을 포함하는 경우, EDTA는 동시에 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 프로테이나제는 변성된 샘플에 동시에 또는 변성된 샘플을 표준화 시약의 다른 성분과 인큐베이션한 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 표준화제로 처리하는 것은 약 37℃의 온도에서 0 내지 약 24시간 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 추출 시약은 표준화된 샘플에 1:1(v/v)로 첨가된다. 일부 실시형태에서, 추출 시약은 아세토나이트릴 및 아세톤을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아세토나이트릴 및 아세톤은 1:1(v/v)로 존재한다. 일부 실시형태에서, 내부에 가용성 종을 보유하는 것은 원심분리 또는 여과에 의해 달성된다. 일부 실시형태에서, 다중 모드의 크로마토그래피는 역상 분리, 양이온 교환 분리, 음이온 교환 분리, 이온쌍 분리, 정상 분리, 이온 이동성 분리, 크기-배제 분리, 키랄 분리, 친화성 분리, 리간드 교환 분리, 극성 비이온성 분리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이동상은 하나 이상의 이온화 부가물을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이온화 부가물은 암모늄, 양성자, 나트륨, 아세테이트, 폼에이트, 프로피오네이트, 포스페이트, 메드로네이트, 우레아, 뷰렛, 트라이유렛, 또는 이들의 임의의 조합물로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 질량 분석법 데이터 획득은 양이온 및 음이온 모드 둘 다에서 동적 배제가 있는 저해상도 또는 고해상도 MS2 데이터-독립적 또는 데이터-종속적 획득이 있는 고해상도 전체 스캔을 포함한다. 일부 실시형태에서, LC-MS 데이터로부터 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 컴퓨터로 결정하는 것은 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편 종의 LC-MS 데이터를 기지의 분석물의 기지량으로부터 생성된 종의 질량 분석과 비교하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 방법은 단일 생물학적 샘플에 존재하는 화학적으로 관련된 다중 분석물 및 화학적으로 관련되지 않은 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법이 제공되며, 상기 샘플은 수성 샘플이고, 상기 방법은,
a. 샘플을 메탄올을 포함하는 동일한 부피의 변성 시약으로 처리하는 단계로서, 변성 시약은 샘플 중 생체고분자를 변성시켜 변성된 샘플을 형성하고, 변성 시약 또는 처리는 첨가될 때 표준화 시약의 성분을 변성시키지 않는, 처리하는 단계;
b. 변성된 샘플을 50mM 암모늄 바이카보네이트, 5mM EDTA, 1:20 m/m 트립신:샘플 단백질(pH 7.8)을 포함하는 표준화 시약으로 37℃에서 4시간 동안 처리하되, 표준화 시약은 변성된 샘플 중 다중 분석물을 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종으로 전환시키고, 종은 다중 모드의 크로마토그래피에 의해 분리되고 질량 분석법에 의해 개별적으로 식별 가능함으로써, 표준화된 샘플을 형성하는 단계;
c. 표준화된 샘플을 아세토나이트릴:아세톤을 1:1로 포함하는 동일한 부피의 추출 시약으로 처리하고, 샘플을 원심분리하여 내부에 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 포함하는 상청액을 보유하여 추출된 샘플을 형성하는 단계;
d. 추출된 샘플에 다중 모드의 크로마토그래피를 적용한 다음 질량 분석법(MS)을 적용하여, 내부에 존재하는 각각의 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종에 대한 데이터를 생성하는 단계; 및
e. 데이터로부터 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 양 또는 정체성을 컴퓨터로 결정하는 단계
를 포함한다.
일 양태에서, 생물학적 샘플이 유래된 살아있는 공급원의 병리학적 병태를 결정하기 위한 방법으로서,
a. 상기 기재된 방법에 따라서 생물학적 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하는 단계;
b. 내부 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 상기 병리가 없는 살아있는 공급원 샘플 유래의 생물학적 샘플과 비교하는 단계로서, 병리학적 병태는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준의 변화로부터 식별 가능한 것인, 비교하는 단계; 및
c. 상기 살아있는 공급원의 병리학적 병태를 결정하는 단계
를 포함한다.
살아있는 공급원의 병리학적 병태를 결정하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, 병리학적 병태를 결정하는 단계로부터의 결과는 살아있는 공급원에서 개입을 선택하거나 모니터링하는 데 사용된다.
일 양태에서, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비가 제공되며, 상기 장비는
a. 샘플 중 생체고분자를 변성시켜 변성된 샘플을 형성하기 위한 수단으로서, 변성은 첨가될 때 표준화 시약의 성분을 변성시키지 않는, 수단;
b. 샘플을 표준화시키기 위한 수단으로서, 변성된 샘플 중 다중 분석물은 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종으로 전환되고, 종은 다중 모드의 크로마토그래피에 의해 분리되고 질량 분석법에 의해 개별적으로 식별 가능한, 수단;
c. 표준화된 샘플을 추출하고 내부에 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 보유하기 위한 수단;
d. 추출된 샘플에 다중 모드의 크로마토그래피를 적용한 다음 질량 분석법(MS)을 적용하여, 내부에 존재하는 각각의 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종에 대한 데이터를 생성하기 위한 수단; 및
e. 데이터로부터 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 컴퓨터로 결정하기 위한 수단
을 포함한다.
장비의 일부 실시형태에서, 다중 분석물은 화학적으로 관련된 분석물 및 화학적으로 관련되지 않은 분석물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분석물은 단백질, 탄수화물, 핵산, 지질, 전해질, 금속, 소분자, 휘발성 화합물, 외인성 화학물질, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 뇌척수액, 타액, 땀, 타액, 세포 또는 조직 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 수용액, 수성 현탁액 또는 수성 조직을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플을 균질화하기 위한 수단이 단계 (a) 전에 또는 동안에 제공된다. 일부 실시형태에서, 샘플 중 생체고분자를 변성시키기 위한 수단은 하나 이상의 용매, 하나 이상의 카오트로픽제, 열, 압력, 방사선조사, 하나 이상의 참조 표준물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 변성 시약 또는 처리를 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용매는 메탄올, 에탄올 또는 아세토나이트릴이다. 일부 실시형태에서, 용매는 메탄올이다. 일부 실시형태에서, 수성 샘플은 거의 동일한 양의 메탄올에서 균질화된다. 일부 실시형태에서, 변성은 금속 킬레이트화를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 금속 킬레이트화는 EDTA, EGTA 또는 DMSA에 의해 제공된다. 일부 실시형태에서, 금속 킬레이트화는 EDTA에 의해 제공된다. 일부 실시형태에서, 변성 및 표준화는 실질적으로 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, 표준화는 샘플에서 생체고분자를 해중합하는 하나 이상의 효소를 포함하는 표준화 시약을 사용하여 달성된다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약은 췌장 내용해 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약은 하나 이상의 프로테이나제, 하나 이상의 뉴클레아제, 하나 이상의 글리코시다제, 하나 이상의 리파제, 하나 이상의 킬레이트제, 하나 이상의 완충제, 하나 이상의 환원제, 하나 이상의 유도체화제, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유도체화제는 요오도아세트아마이드이다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약은 트립신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약은 트립신, 리보뉴클레아제 A, EDTA, 암모늄 바이카보네이트 또는 아밀라제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약이 DNase I을 포함하는 경우, EDTA는 동시에 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 프로테이나제는 변성된 샘플에 동시에 또는 변성된 샘플을 표준화 시약의 다른 성분과 인큐베이션한 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 표준화 수단은 약 37℃의 온도에서 0 내지 약 24시간 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 추출하기 위한 수단은 표준화된 샘플에 1:1(v/v)로 첨가되는 추출 시약을 사용하여 달성된다. 일부 실시형태에서, 추출 시약은 아세토나이트릴 및 아세톤을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아세토나이트릴 및 아세톤은 1:1(v/v)로 존재한다. 일부 실시형태에서, 내부에 가용성 종을 보유하기 위한 수단은 원심분리 또는 여과에 의해 달성된다. 일부 실시형태에서, 다중 모드의 크로마토그래피를 위한 수단은 역상 분리, 양이온 교환 분리, 음이온 교환 분리, 이온쌍 분리, 정상 분리, 이온 이동성 분리, 크기-배제 분리, 키랄 분리, 친화성 분리, 리간드 교환 분리, 극성 비이온성 분리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 크로마토그래피에 사용되는 이동상은 하나 이상의 이온화 부가물을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이온화 부가물은 암모늄, 양성자, 나트륨, 아세테이트, 폼에이트, 프로피오네이트, 포스페이트, 메드로네이트, 우레아, 뷰렛, 트라이유렛, 또는 이들의 임의의 조합물로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 질량 분석법 데이터 획득은 양이온 및 음이온 모드 둘 다에서 동적 배제가 있는 저해상도 또는 고해상도 MS2 데이터-독립적 또는 데이터-종속적 획득이 있는 고해상도 전체 스캔을 포함한다. 일부 실시형태에서, LC-MS 데이터로부터 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 컴퓨터로 결정하기 위한 수단은 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편 종의 LC-MS 데이터를 기지의 분석물의 기지량으로부터 생성된 종의 질량 분석과 비교하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 생물학적 샘플이 유래된 살아있는 공급원의 병태를 결정하기 위한 방법으로서,
a. 상기 기재된 장비의 사용에 의해 생물학적 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하는 단계;
b. 내부 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 상기 병리가 없는 살아있는 공급원 샘플 유래의 생물학적 샘플과 비교하는 단계로서, 병리학적 병태는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양의 변화로부터 식별 가능한 것인, 비교하는 단계; 및
c. 상기 살아있는 공급원의 병리학적 병태를 결정하는 단계
를 포함한다.
바로 앞의 단락의 방법의 일부 실시형태에서, 병태를 결정하는 것은 살아있는 공급원에서 개입을 선택하거나 모니터링하는 데 사용된다.
일 양태에서, 단일 샘플에 존재하는 화학적으로 관련된 다중 분석물 및 화학적으로 관련되지 않은 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 시스템이 제공되며, 상기 시스템은,
a. 샘플 중 생체고분자를 변성시켜 변성된 샘플을 형성하는 변성 시약 또는 처리로서, 첨가될 때 표준화 시약의 성분을 변성시키지 않는, 변성 시약 또는 처리;
b. 샘플 중 다중 분석물을 혼합 모드 액체 크로마토그래피에 의해 분리되고 직렬 질량 분석법에 의해 개별적으로 식별 가능한 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편 종으로 전환시키는 표준화 시약;
c. 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 추출하는 추출 시약;
d. 내부에 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 보유하여 추출된 샘플을 형성하는 분리 공정;
e. 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 분석하는 다중 모드의 크로마토그래피;
f. 개별 종에 대한 데이터를 생성하는 질량 분석; 및
g. 각각의 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종의 데이터로부터 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준을 컴퓨터로 결정하기 위한 하나 이상의 알고리즘
을 포함한다.
시스템의 일부 실시형태에서, 다중 분석물은 화학적으로 관련된 분석물 및 화학적으로 관련되지 않은 분석물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분석물은 단백질, 탄수화물, 핵산, 지질, 전해질, 금속, 소분자, 휘발성 화합물, 외인성 화학물질, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 뇌척수액, 타액, 땀, 타액, 세포 또는 조직 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 수용액, 수성 현탁액 또는 수성 조직을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (a) 전에 또는 동안에 샘플이 균질화된다. 일부 실시형태에서, 변성 시약 또는 처리는 하나 이상의 용매, 하나 이상의 카오트로픽제, 열, 압력, 방사선조사, 하나 이상의 참조 표준물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용매는 메탄올, 에탄올 또는 아세토나이트릴이다. 일부 실시형태에서, 용매는 메탄올이다. 일부 실시형태에서, 수성 샘플은 거의 동일한 양의 메탄올에서 균질화된다. 일부 실시형태에서, 변성 시약 또는 처리는 금속-킬레이트제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 금속-킬레이트제는 EDTA, EGTA 또는 DMSA이다. 일부 실시형태에서, 금속-킬레이트제는 EDTA이다. 일부 실시형태에서, 변성 단계 및 변성된 샘플을 표준화 시약으로 처리하는 것은 실질적으로 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약은 샘플에서 생체고분자를 해중합하는 하나 이상의 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약은 췌장 내용해 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약은 하나 이상의 프로테이나제, 하나 이상의 뉴클레아제, 하나 이상의 글리코시다제, 하나 이상의 리파제, 하나 이상의 킬레이트제, 하나 이상의 완충제, 하나 이상의 환원제, 하나 이상의 유도체화제, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유도체화제는 요오도아세트아마이드이다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약은 트립신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약은 트립신, 리보뉴클레아제 A, EDTA, 암모늄 바이카보네이트 또는 아밀라제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약이 DNase I을 포함하는 경우, EDTA는 동시에 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 프로테이나제는 변성된 샘플에 동시에 또는 변성된 샘플을 표준화 시약의 다른 성분과 인큐베이션한 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 표준화 시약으로 처리하는 것은 약 37℃의 온도에서 0 내지 약 24시간 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 추출 시약은 표준화된 샘플에 1:1(v/v)로 첨가된다. 일부 실시형태에서, 추출 시약은 아세토나이트릴 및 아세톤을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아세토나이트릴 및 아세톤은 1:1(v/v)로 존재한다. 일부 실시형태에서, 내부에 가용성 종을 보유하는 것은 원심분리 또는 여과에 의해 달성된다. 일부 실시형태에서, 다중 모드의 크로마토그래피는 역상 분리, 양이온 교환 분리, 음이온 교환 분리, 이온쌍 분리, 정상 분리, 이온 이동성 분리, 크기-배제 분리, 키랄 분리, 친화성 분리, 리간드 교환 분리, 극성 비이온성 분리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 크로마토그래피에 사용되는 이동상은 하나 이상의 이온화 부가물을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이온화 부가물은 암모늄, 양성자, 나트륨, 아세테이트, 폼에이트, 프로피오네이트, 포스페이트, 메드로네이트, 우레아, 뷰렛, 트라이유렛, 또는 이들의 임의의 조합물로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 질량 분석법 데이터 획득은 양이온 및 음이온 모드 둘 다에서 동적 배제가 있는 저해상도 또는 고해상도 MS2 데이터-독립적 또는 데이터-종속적 획득이 있는 고해상도 전체 스캔을 포함한다. 일부 실시형태에서, LC-MS 데이터로부터 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 컴퓨터로 결정하는 것은 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편 종의 LC-MS 데이터를 기지의 분석물의 기지량으로부터 생성된 종의 질량 분석과 비교하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 생물학적 샘플이 유래된 살아있는 공급원의 병리학적 병태를 결정하기 위한 방법으로서,
a. 상기 기재된 시스템에 따라서 생물학적 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하는 단계;
b. 내부 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 상기 병리가 없는 살아있는 공급원 샘플 유래의 생물학적 샘플과 비교하는 단계로서, 병리학적 병태는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양의 변화로부터 식별 가능한 것인, 비교하는 단계; 및
c. 상기 살아있는 공급원의 병리학적 병태를 결정하는 단계
를 포함한다.
바로 앞의 단락의 방법의 일부 실시형태에서, 병리학적 병태는 살아있는 공급원에서 치료적 개입을 선택하거나 모니터링하는 데 사용된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법을 제공하며,
(a) 상이한 유형의 복수의 분석물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 샘플에 복수의 분석물 또는 이의 유도체를 포함하는 용액을 산출하기에 충분한 조건을 적용하는 단계; 및
(b) 기기를 사용하여 용액을 처리하여 복수의 분석물 또는 이의 유도체를 식별하여 복수의 분석물을 식별하고, 복수의 분석물 또는 이의 유도체가 기기의 단일 실행에서 식별되는 단계
를 포함한다.
상기 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은 단백질, 핵산, 소분자, 지질, 탄수화물, 전해질, 및 금속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분석물 중 적어도 3가지 유형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은, 소분자, 지질, 및 탄수화물로부터 선택되는 분석물 중 적어도 하나의 유형; 및 단백질, 핵산, 전해질, 및 금속으로부터 선택되는 분석물 중 적어도 2가지 유형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은, 단백질, 및 핵산으로부터 선택되는 분석물 중 적어도 하나의 유형; 및 소분자, 지질, 및 탄수화물로부터 선택되는 분석물 중 적어도 2가지 유형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은 소분자, 지질, 및 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은 소분자, 지질, 탄수화물, 및 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은 소분자, 지질, 탄수화물, 및 전해질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은 소분자, 지질, 탄수화물, 전해질, 및 금속을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은 단백질 및 핵산 중 하나 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 내인성 소분자, 외인성 소분자, 또는 이들의 조합물이다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은 외인성 화학물질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물 중 적어도 하나는 휘발성 화합물이다.
상기 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, 용액 중 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 복수의 분석물과 상이한 분자 크기 또는 질량 분포를 가진다. 일부 실시형태에서, 용액 중 복수의 분석물 또는 유도체는 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 복수의 분석물과 상이한 하전된 분자의 양, 친수성 분자의 양, 소수성 작용기를 갖는 분자의 양, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용액 중 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 미리 결정된 범위 내에 속하는 분자의 질량 백분율이 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 복수의 분석물보다 더 크다. 일부 실시형태에서, 용액 중 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 복수의 분석물보다 더 좁은 분자 크기 또는 질량을 가진다. 일부 실시형태에서, 용액 중 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 하전된 분자의 질량 백분율이 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 복수의 분석물보다 더 크다. 일부 실시형태에서, 용액 중 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 옥탄올-물 분배 계수에 의해 측정된 친수성 분자의 질량 백분율이 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 복수의 분석물보다 더 크다. 일부 실시형태에서, 용액 중 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 복수의 분석물보다 더 좁은 질량-대-전하 비(m/z)의 분포를 가져서, 용액 중 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 질량 분석법에 의해 검출 가능한 범위 내에 속하는 분자의 질량 백분율이 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 복수의 분석물보다 더 크다. 일부 실시형태에서, 질량 분석법에 의해 검출 가능한 범위는 전자 전하 당 100 달톤(Da/e) 내지 2,000 Da/e이다. 일부 실시형태에서, 용액 중 복수의 분석물 또는 이의 유도체 각각은 질량-대-전하 비(m/z)가 전자 전하 당 15 달톤(Da/e) 내지 4,000 Da/e이다.
상기 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, (a)는 처리된 샘플을 얻기 위해 다음 중 하나 또는 임의의 조합을 포함한다: (i) 샘플을 균질화하는 것; (ii) 샘플을 변성제와 접촉시켜 복수의 분석물 중 적어도 하나의 형태를 변화시키는 것; (iii) 샘플을 킬레이트제와 접촉시켜 복수의 분석물 중 적어도 하나와 킬레이트 착물을 형성하는 것; (iv) 샘플을 유도체화제와 접촉시켜 복수의 분석물 중 적어도 하나의 유도체를 형성하는 것; (v) 샘플을 환원제와 접촉시켜 복수의 분석물 중 적어도 하나를 변형시키는 것; 및 (vi) 샘플을 효소와 접촉시켜 복수의 분석물 중 적어도 하나의 단편을 생성하는 것. 일부 실시형태에서, (iii)은 1회 이상 수행된다. 일부 실시형태에서, (vi)은 1회 이상 수행된다. 일부 실시형태에서, (i)은 (ii) 전에 또는 이와 실질적으로 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, (ii)는 (iii)과 실질적으로 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, (ii)는 (vi) 전에 또는 이와 실질적으로 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, (vi)은 (iii), (iv), 및 (v) 중 하나 이상과 실질적으로 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, (vi)은 (iv)와 실질적으로 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, (vi)은 (iii) 및 (iv)와 실질적으로 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, (iii)은 (i)과 실질적으로 동시에 1회, 그리고 (vi)과 실질적으로 동시에 다시, 적어도 2회 수행된다. 일부 실시형태에서, (vi)은 (ii)와 실질적으로 동시에 1회, 그리고 (iv)와 실질적으로 동시에 다시, 적어도 2회 수행된다. 일부 실시형태에서, (ii)와 실질적으로 동시에 수행되는 (vi)에서 사용되는 효소는 프로테아제이다. 일부 실시형태에서, (i)은 1:5 내지 5:1의 부피비인 물과 메탄올의 혼합물에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 변성제는 용매, 카오트로픽제, 및 참조 표준물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용매는 메탄올, 에탄올, 및 아세토나이트릴로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 용매는 메탄올이다. 일부 실시형태에서, 킬레이트제는 (iii)의 각각의 경우에 독립적으로, 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌 글라이콜-비스(β-아미노에틸 에터)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 및 다이머캅토석신산(DMSA)으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 킬레이트제는 EDTA이다. 일부 실시형태에서, 유도체화제는 펩타이드 알킬화제이다. 일부 실시형태에서, 유도체화제는 요오도아세트아마이드이다. 일부 실시형태에서, 효소는 (vi)의 각각의 경우에 독립적으로, 뉴클레아제, 프로테아제, 글리코시다제, 및 리파제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 임의의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 글리코시다제는 아밀라제이다. 일부 실시형태에서, 프로테아제는 트립신이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제는 DNase I 및 리보뉴클레아제 A 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNase I 및 EDTA는 (vi)에 동시에 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, (vi)은 암모늄 바이카보네이트 완충제에서 수행된다. 일부 실시형태에서, (vi)은 약 37℃에서 약 24시간 이하 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다.
상기 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, (a)는 처리된 샘플로부터 복수의 분석물 또는 이의 유도체를 추출 시약으로 추출하여 용액을 얻는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 추출은 추출 시약을 처리된 샘플에 부피 기준으로 1:1로 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 추출 시약은 아세토나이트릴 및 아세톤을 부피 기준으로 1:1로 포함한다. 일부 실시형태에서, (a)는 원심분리 또는 여과에 의해 용액으로부터 불용성 불순물을 제거하는 것을 추가로 포함한다.
상기 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, (b)는 복수의 분석물 또는 이의 유도체에 전자빔을 적용하여 복수의 분석물 또는 이의 유도체 중 적어도 하나의, 적어도 하나의 이온화된 형태 또는 단편을 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, (b)는 복수의 분석물 또는 이의 유도체를, 적어도 3개의 직교 크로마토그래피 모드를 포함하는 혼합 모드 크로마토그래피 매트릭스와 접촉시키는 것을 추가로 포함하며, 여기서 적어도 3개의 직교 크로마토그래피 모드 각각은 용액으로부터 복수의 분석물 또는 이의 유도체의 주어진 유형을 분리하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 직교 크로마토그래피 모드 중 적어도 하나는 용액으로부터 분석물의 적어도 하나의 유도체를 분리한다. 일부 실시형태에서, 혼합 모드 크로마토그래피 매트릭스는 양이온 교환 특성, 음이온 교환 특성, 이온 배제 특성, 리간드 교환 특성, 크기 배제 특성, 키랄 특성, 역상 특성, 친화성 특성, 친수성 특성, 다배위자(polydentate) 특성, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3가지 특성을 포함한다. 일부 실시형태에서, (b)는 복수의 분석물 및 이의 유도체를 적어도 3가지 이동상으로 용리시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물 및 이의 유도체 중 제1 분획은 제1 이동상에 의해 용리되고, 제1 이동상은 물 및 0.1% 폼산(v/v)을 포함하며; 복수의 분석물 및 이의 유도체의 제2 분획은 제2 이동상에 의해 용리되고, 제2 이동상은 아세토나이트릴 및 0.1% 폼산(v/v)을 포함하며; 복수의 분석물 및 이의 유도체의 제3 분획은 제3 이동상에 의해 용리되고, 제3 이동상은 1:1(v/v)의 메탄올/물, 200mM 암모늄 아세테이트, 및 폼산을 포함한다.
상기 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, 적어도 3가지 이동상 중 적어도 하나, 또는 제1 이동상, 제2 이동상, 및 제3 이동상 중 적어도 하나는 암모늄, 양성자, 나트륨, 아세테이트, 폼에이트, 프로피오네이트, 포스페이트, 메드로네이트, 우레아, 뷰렛 및 트라이유렛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이온화 부가물을 포함한다. 일부 실시형태에서, (b)는 복수의 분석물 또는 이의 유도체 각각의 질량을 질량 분석법으로 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, (b)는 복수의 분석물 또는 이의 유도체 각각의 양을 질량 분석법으로 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 질량 분석법은 양이온 및 음이온 모드 둘 다에서 동적 배제 유무에 관계없이 데이터-독립적 또는 데이터-종속적 획득에 의해 생성되는 저해상도 또는 고해상도 전체 또는 단편화 스캔 질량 분석법이다. 일부 실시형태에서, 질량 또는 양을 결정하는 것은 저해상도 또는 고해상도 질량 분석 특징을 하나 이상의 참조 질량 전체 또는 스펙트럼과 비교하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용액은 선택적으로 수혼화성 유기 용매를 포함하는 수용액이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법을 제공하며, (i) 단일 샘플로부터 질환 또는 병태와 연관된 것으로 알려진 복수의 분석물을 개별적으로 또는 종합적으로 식별하여 복수의 분석물 각각에 대한 식별된 양을 얻으며, 복수의 분석물은 상이한 유형의 분석물을 포함하는 단계; (ii) 복수의 분석물 각각에 대한 참조량과 식별된 양 사이의 차이를 결정하여 복수의 상이한 값을 얻는 단계; 및 (iii) 훈련된 기계 학습 알고리즘을 사용하여 복수의 차이값을 기반으로 하여 질환 또는 병태를 결정하는 단계를 포함한다.
상기 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 대상체에서 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, (i)은 (a) 복수의 분석물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 단일 샘플에 복수의 분석물 또는 이의 유도체를 포함하는 용액을 산출하기에 충분한 조건을 적용하는 것; 및 (b) 복수의 분석물 또는 이의 유도체를 식별하는 데 용액을 사용하여 복수의 분석물을 식별하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 훈련된 기계 학습 알고리즘은 170개 이하의 훈련용 샘플을 포함하는 복수의 훈련용 샘플을 사용하여 훈련된다. 일부 실시형태에서, 훈련된 알고리즘은 30개 이하의 훈련용 샘플을 포함하는 복수의 훈련용 샘플을 사용하여 훈련된다. 일부 실시형태에서, 훈련된 알고리즘은 적어도 30개의 훈련용 샘플을 포함하는 복수의 훈련용 샘플을 사용하여 훈련된다. 일부 실시형태에서, 훈련된 기계 학습 알고리즘은 적어도 170개의 훈련용 샘플을 포함하는 복수의 훈련용 샘플을 사용하여 훈련된다. 일부 실시형태에서, 대상체에서 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법은 (i) 전에, 복수의 훈련용 샘플 각각으로부터 복수의 분석물을 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병태는 적어도 80%의 정확도로 결정된다. 일부 실시형태에서, 정확도는 적어도 90%이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 병태는 노화, 심혈관 질환, 염증, 심부전, 및 치매로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은 아포지질단백질 B(apoB), 코티솔, C-반응성 단백질(CRP), 및 N-말단 프로 b-형 나트륨이뇨 펩타이드(N-terminal pro b-type natriuretic peptide; NT-ProBNP), 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분석물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 분석물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 3종 이상의 분석물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 및 대사물질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은 폴리펩타이드 및 대사물질을 포함한다.
본 발명의 이러한 양태 및 다른 양태는 후속하는 도면의 설명 및 본 발명의 상세한 설명으로부터 이해될 것이다.
본 발명으로 간주되는 주제는 명세서의 결론 부분에서 특히 지적되고 명백하게 청구되어 있다. 그러나, 본 발명은 목적, 특성, 및 이들의 장점과 함께 구조 및 작동 방법에 관하여 첨부되는 도면과 함게 읽을 때 하기 상세한 설명을 참조하여 가장 잘 이해될 수 있다:
도 1은 본 발명의 전반적인 개념을 도시한다.
도 2는 인간 혈장에서 검출된 것으로 제시된 선택된 분석물을 도시한다. 시간 및 강도 피크 면적은 각각 가로축 및 세로축에 표시되어 있다. 선택된 분석물은 나트륨, 콜레스테롤, 페닐알라닌, 크레아티닌, 프럭토사민(및 이성질체), 트라이글리세라이드 이성질체(52:2), 트립신에 의한 알부민 펩타이드, 및 빌리루빈이다.
도 3은 5개의 복제물에서 5가지의 상이한 혈장 샘플에 걸친 선택된 분석물의 상자 도표를 나타낸다. 각각의 분석물의 명칭은 샘플 중앙값 간의 임의의 차이가 통계적으로 유의한지 여부를 나타내는 크루스칼 왈리스(Kruskal-Wallis) p-값과 함께 각각의 점 도표 위에 열거되어 있다. 샘플 번호 및 log10-스케일 강도 피크 면적은 각각 가로축 및 세로축에 표시되어 있다. 점은 각각의 샘플의 5중 측정값을 나타내고 수평선은 모든 복제물의 4분위수를 표시한다. 선택된 분석물은 크레아틴, 타우린, 요산, 헤모글로빈의 트립신에 의한 펩타이드, 혈청 알부민의 트립신에 의한 펩타이드, 콜레스테롤, 포스파티딜콜린 이성질체(34:2), 및 트라이글리세라이드 이성질체(52:2)이다.
도 4는 효소 없이 분해되고 기재된 절차에 따라 분석된 마우스 간 호모제네이트로부터 얻은 스펙트럼을 나타낸다. 시간 및 질량-대-전하는 가로축 및 세로축에 표시되어 있으며, 색상의 밝기가 증가할수록 이온 강도가 더 높음을 표시한다. 선택된 분석물 부류의 대략적인 위치는 이전 관찰에 따라 표지되어 있다.
도 5는 RNase A로 분해되고 기재된 절차에 따라 분석된 마우스 간 호모제네이트로부터 얻은 스펙트럼을 나타낸다. 시간 및 질량-대-전하는 가로축 및 세로축에 표시되어 있으며, 색상의 밝기가 증가할수록 이온 강도가 더 높음을 표시한다. 선택된 분석물 부류의 대략적인 위치는 이전 관찰에 따라 표지되어 있다.
도 6은 RNase A 및 트립신으로 분해되고 기재된 절차에 따라 분석된 마우스 간 호모제네이트로부터 얻은 스펙트럼을 나타낸다. 시간 및 질량-대-전하는 가로축 및 세로축에 표시되어 있으며, 색상의 밝기가 증가할수록 이온 강도가 더 높음을 표시한다. 선택된 분석물 부류의 대략적인 위치는 이전 관찰에 따라 표지되어 있다.
도 7은 트립신으로 분해되고 기재된 절차에 따라 분석된 배양된 인간 간암 세포로부터 얻은 스펙트럼을 나타낸다. 시간 및 질량-대-전하는 가로축 및 세로축에 표시되어 있으며, 색상의 밝기가 증가할수록 이온 강도가 더 높음을 표시한다. 선택된 분석물 부류의 대략적인 위치는 이전 관찰에 따라 표지되어 있다.
도 8은 트립신으로 분해되고 기재된 절차에 따라 분석된 인간 혈장으로부터 얻은 스펙트럼을 나타낸다. 시간 및 질량-대-전하는 가로축 및 세로축에 표시되어 있으며, 색상의 밝기가 증가할수록 이온 강도가 더 높음을 표시한다. 선택된 분석물 부류의 대략적인 위치는 이전 관찰에 따라 표지되어 있다.
도 9는 트립신으로 분해되고 옴니(omni)-MS 절차에 따라 분석된 소 지방으로부터 얻은 스펙트럼을 나타낸다. 시간 및 질량-대-전하는 가로축 및 세로축에 표시되어 있으며, 색상의 밝기가 증가할수록 이온 강도가 더 높음을 표시한다. 선택된 분석물 부류의 대략적인 위치는 이전 관찰에 따라 표지되어 있다.
도 10은 트립신으로 분해되고 옴니-MS 절차에 따라 분석된 인간 소변으로부터 얻은 스펙트럼을 나타낸다. 시간 및 질량-대-전하는 가로축 및 세로축에 표시되어 있으며, 색상의 밝기가 증가할수록 이온 강도가 더 높음을 표시한다. 선택된 분석물 부류의 대략적인 위치는 이전 관찰에 따라 표지되어 있다.
도 11의 좌측 패널은 대표적인 혈장 샘플 및 복제물에 걸친 이온 빈(bin)의 대표적인 쌍별 산점도. 가로축 및 세로축은 이온 빈에서 발견되는 log10 강도 카운트에 해당한다. 우측 패널: 혈장 샘플 및 복제물의 상관관계를 기반으로 하는 계층적 클러스터링. 세로축은 프로파일 간의 상관관계 거리이며, 샘플은 대략적으로 상관관계에 따라 가장 가까운 이웃에 따라 정렬된다.
도 12a는 단일 혈액 샘플 및 연령(또는 노화)과 연관된 임상 변수로부터 각각 체류 시간에 질량-대-전하 비율로 측정된, 다중-오믹으로 검출된 다양한 분석물 간의 통계적 연관성을 나타내는 맨해튼 플롯을 예시한다. 통계적 연관 결과를 거짓 발견 비율(FDR) 임계값에서 필터링하였다: < 0.2(빨강색 삼각형), 0.2(포함함) 내지 0.5(녹색 사각형), 및 ≥ 0.5(회색 원).
도 12b는 도 12a의 맨해튼 플롯에서 분석된 혈액 샘플의 다중-오믹 스펙트로그램을 예시한다. 0.3 거짓 발견 비율(FDR) 임계값에 속하는 분석물은 사각형으로 표시되었다.
도 12c는 기계 학습 모델의 자유도를 변화시키면서 리브-원-아웃-교차 검증(leave-one-out-cross validation)을 사용하여 연령에 대한 예측 세트의 평균 절대 오차(MAE)를 예시한다.
도 12d는 예측된 연령(본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 사용함) 및 실제 연령을 비교함으로써 예측 정확도를 예시한다. 상관 계수(r)는 도표 위에 도시되어 있으며; 샘플 크기(n)는 도표 아래에 도시되어 있다.
도 13a는 단일 혈액 샘플 및 심혈관 질환(ApoB)과 연관된 임상 변수로부터 각각 체류 시간에 질량-대 전하 비율에서 측정된, 다중-오믹으로 검출된 분석물 간의 통계적 연관성을 나타내는 맨해튼 플롯을 예시한다. 통계적 연관 결과를 거짓 발견 비율(FDR) 임계값에서 필터링하였다: < 0.2(빨강색 삼각형), 0.2(포함함) 내지 0.5(녹색 사각형), 및 ≥ 0.5(회색 원).
도 13b는 도 13a의 맨해튼 플롯에서 분석된 혈액 샘플의 다중-오믹스 스펙트로그램을 예시한다. 0.3 거짓 발견 비율(FDR) 임계값에 속하는 분석물은 사각형으로 표시되었다.
도 13c는 기계 학습 모델의 자유도를 변화시키면서 ApoB 리브-원-아웃-교차 검증에 대한 예측 세트의 평균 절대 오차(MAE)를 예시한다.
도 13d는 예측된 ApoB(본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 사용함) 및 실제 ApoB를 비교함으로써 예측 정확도를 예시한다. 상관 계수(r)는 도표 위에 도시되어 있으며; 샘플 크기(n)는 도표 아래에 도시되어 있다.
도 14a는 단일 혈액 샘플 및 심부전(NT-ProBNP)과 연관된 임상 변수로부터 각각 체류 시간에 질량-대-전하 비율로 측정된, 다중-오믹으로 검출된 다양한 분석물 간의 통계적 연관성을 나타내는 맨해튼 플롯을 예시한다. 통계적 연관 결과를 거짓 발견 비율(FDR) 임계값에서 필터링하였다: < 0.2(빨강색 삼각형), 0.2(포함함) 내지 0.5(녹색 사각형), 및 ≥ 0.5(회색 원).
도 14b는 도 14a의 맨해튼 플롯에서 분석된 혈액 샘플의 다중-오믹스 스펙트로그램을 예시한다. 0.3 거짓 발견 비율(FDR) 임계값에 속하는 분석물은 사각형으로 표시되었다.
도 14c는 기계 학습 모델의 자유도를 변화시키면서 리브-원-아웃-교차 검증을 사용하여 N-말단 프로 b-형 나트륨이뇨 펩타이드(NT-ProBNP)에 대한 예측 세트의 평균 절대 오차(MAE)를 예시한다.
도 14d는 예측된 NT-ProBNP(본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 사용함) 및 실제 NT-ProBNP를 비교함으로써 예측 정확도를 예시한다. 상관 계수(r)는 도표 위에 도시되어 있으며; 샘플 크기(n)는 도표 아래에 도시되어 있다.
도 15a는 단일 혈액 샘플 및 염증(CRP)과 연관된 임상 변수로부터 각각 체류 시간에 질량-대-전하 비율로 측정된, 다중-오믹으로 검출된 다양한 분석물 간의 통계적 연관성을 나타내는 맨해튼 플롯을 예시한다. 통계적 연관 결과를 거짓 발견 비율(FDR) 임계값에서 필터링하였다: < 0.2(빨강색 삼각형), 0.2(포함함) 내지 0.5(녹색 사각형), 및 ≥ 0.5(회색 원).
도 15b는 도 15a의 맨해튼 플롯에서 분석된 혈액 샘플의 다중-오믹 스펙트로그램을 예시한다. 0.3 거짓 발견 비율(FDR) 임계값에 속하는 분석물은 사각형으로 표시되었다.
도 15c는 기계 학습 모델의 자유도를 변화시키면서 리브-원-아웃-교차 검증을 사용하여 C-반응성 단백질(CRP)에 대한 예측 세트의 평균 절대 오차(MAE)를 예시한다.
도 15d는 예측된 CRP(본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 사용함) 및 실제 CRP를 비교함으로써 예측 정확도를 예시한다. 상관 계수(r)는 도표 위에 도시되어 있으며; 샘플 크기(n)는 도표 아래에 도시되어 있다.
도 16a는 단일 혈액 샘플 및 치매와 연관된 임상 변수로부터 각각 체류 시간에 질량-대-전하 비율로 측정된, 다중-오믹으로 검출된 다양한 분석물 간의 통계적 연관성을 나타내는 맨해튼 플롯을 예시한다. 통계적 연관 결과를 거짓 발견 비율(FDR) 임계값에서 필터링하였다: < 0.2(빨강색 삼각형), 0.2(포함함) 내지 0.5(녹색 사각형), 및 ≥ 0.5(회색 원).
도 16b는 도 16a의 맨해튼 플롯에서 분석된 혈액 샘플의 다중-오믹 스펙트로그램을 예시한다. 0.3 거짓 발견 비율(FDR) 임계값에 속하는 분석물은 사각형으로 표시되었다.
도 16c는 기계 학습 모델의 자유도를 변화시키면서 리브-원-아웃-교차 검증을 사용하여 치매와 연관된 임상 바이오마커에 대한 예측 세트의 평균 절대 오차(MAE)를 예시한다.
도 16d는 예측된 치매와 연관된 임상 바이오마커(본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 사용함) 및 실제 치매와 연관된 임상 바이오마커를 비교함으로써 예측 정확도를 예시한다. 상관 계수(r)는 도표 위에 도시되어 있으며; 샘플 크기(n)는 도표 아래에 도시되어 있다.
도 17은 일부 실시형태에 따른 컴퓨터 시스템의 개략도.
본 주제는 본 개시내용의 일부를 형성하는 하기 상세한 설명을 참조하여 보다 용이하게 이해될 수 있다. 본 발명은 본 명세서에 기재되고/거나 나타낸 특정 제품, 방법, 조건 또는 매개변수로 제한되지 않으며, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 예로서 특정 실시형태를 기재하기 위한 목적으로 사용되는 것이고 청구된 발명을 제한하려는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련되어 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함할 것이다.
상기 및 개시내용 전체에 걸쳐 이용되는 바와 같이, 하기 용어 및 약어는 달리 지시되지 않는 한 하기 의미를 가지는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시내용에서, 단수 형태("a", "an", 및 "the")는 복수 대상을 포함하고, 특정 수치에 대한 언급은 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 적어도 해당 특정 값을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "화합물"에 대한 언급은 이와 같은 화합물 및 당업자에게 알려진 이의 등가물 중 하나 이상에 대한 언급 등등이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "복수"는 하나 초과를 의미한다. 값의 범위가 표현될 때, 또 다른 실시형태는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다.
유사하게, 값이 근사치로서 표현될 때, 선행사 "약"을 사용함으로써, 특정 값이 다른 실시형태를 형성하는 것으로 이해된다. 모든 범위는 포괄적이고 결합 가능하다. 본 개시내용의 맥락에서, 특정 양의 "약"은 해당 양이 명시된 양의 ± 20% 이내, 또는 바람직하게는 명시된 양의 ± 10% 이내, 또는 더 바람직하게는 명시된 양의 ± 5% 이내에 있음을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료", 또는 "요법"(및 이들의 상이한 형태)은 예방적 또는 방지적 조치를 포함하는 치료적 처리를 지칭하며, 여기서 목적은 질환 또는 병태와 연관된 원하지 않는 생리학적 변화를 방지하거나 늦추는(줄이는) 것이다. 유익하거나 원하는 임상 결과는 검출 가능하든 검출 가능하지 않든 상관없이, 증상의 완화, 질환 또는 병태 정도의 감소, 질환 또는 병태의 안정화(즉, 질환 또는 병태가 악화되지 않는 경우), 질환 또는 병태 진행의 지연 또는 둔화, 질환 또는 병태의 개선 또는 경감, 및 질환 또는 병태의 완화(부분적이든 전체적이든)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 치료를 필요로 하는 사람은 이미 질환 또는 병태를 가지고 있는 사람뿐만 아니라 질환 또는 병태에 걸리기 쉬운 사람 또는 질환 또는 병태가 예방되어야 하는 사람을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "성분", "조성물", "제형", "화합물의 조성물", "화합물", "약물", "약리학적 활성제", "활성제", "치료제", "요법", "치료", 또는 "약제"는, 대상체(인간 또는 동물)에게 투여될 때 국소 및/또는 전신 작용에 의한 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 화합물 또는 화합물들 또는 물질의 조성물을 지칭하기 위해, 문맥이 지시하는 바와 같이 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다. 개인화된 조성물 또는 방법은 대상체에서 확인되거나 고려되는 특정 요구를 충족하도록 맞춤화되거나 개별화된 요법에서의 제품 또는 제품의 사용을 지칭한다.
용어 "대상체", "개체", 및 "환자"는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 제형으로 치료가 제공되는 동물, 예를 들어 인간을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "살아있는 공급원"은 인간 및 비인간 동물을 지칭한다. 용어 "비인간 동물" 및 "비인간 포유동물"은 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되며 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물, 예컨대, 비인간 영장류(특히 고등 영장류), 양, 개, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 기니피그, 염소, 돼지, 고양이, 토끼, 소, 말 및 비포유동물, 예컨대, 파충류, 양서류, 닭, 및 칠면조를 포함한다. 특정 실시형태에서, "살아있는 공급원"은 비동물의 살아있는 유기체, 예컨대, 미생물, 진균, 선류 태류, 및 곡물, 과일, 채소 및 이들로 제조된 식료품을 포함하는 다른 인간 및 동물 식품을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 식물을 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물은 영장류, 예컨대, 원숭이 및 인간, 말, 소, 고양이, 개, 토끼, 및 설치류, 예컨대, 래트 및 마우스를 포함하는 임의의 적합한 포유동물을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 치료될 포유동물은 인간이다. 인간은 임의의 연령의 임의의 인간일 수 있다. 일 실시형태에서, 인간은 성인이다. 또 다른 실시형태에서, 인간은 어린이이다. 인간은 남성, 여성, 임산부, 중년, 청소년, 또는 노인일 수 있다. 본 발명의 임의의 방법에 따라서 일 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 비인간 영장류이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는, 일 실시형태에서는 마우스이고, 또 다른 실시형태에서는 래트인 뮤린이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 개, 고양이, 소, 말, 염소 또는 돼지이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다.
특정 약물, 화합물, 조성물, 제형(또는 이들의 조합물)이 본 명세서에서 "지시된" 것으로 언급된 대상체의 병태 및 장애는 해당 약물 또는 화합물 또는 조성물 또는 제형이 규제 당국에 의해 명시적으로 승인된 병태 및 장애로 제한되지 않지만, 또한 해당 약물 또는 화합물 또는 조성물 또는 제형 또는 이들의 조합으로 치료할 수 있는 것으로 알려져 있거나 의사 또는 다른 건강 또는 영양 전문가가 합리적으로 믿는 다른 병태 및 장애를 포함한다.
생물학적 시스템에 존재하는 방대한 양의 분자 정보를 해독하는 데 엄청난 관심이 있다. 심지어 단순한 생물학적 샘플에서 발견되는 압도적인 화학적 다양성으로 인해, 자연에서 발견되는 다양한 분석물의 하위집합을 검출하고 측정하는 데 고도로 전문화된 분석 방법이 필요하였다. 본 발명자들은 다양한 생물학적 시편에서의 단일 분석 실행으로 다양한 범위의 분자 종을 정량화하기 위해 LC-MS를 사용하는 방법을 기재한다. 이러한 분석은 복잡한 생화학적 시스템을 분석하기 위한 간단한 접근법을 제공하여, 생의학 연구에서 고유한 기회를 제공한다. 이러한 프레임워크는 샘플을 질량 분석기에 도입하기 전에 화학적 표준화 및 포함을 목표로 하는 직교 혼합 모드(또는 다중 모드의) 크로마토그래피를 다양한 단계 및 시약과 조합함으로써 다양한 생체분자의 분석을 단일 기기 실행으로 병합한다. 이러한 접근법을 사용하여, 수천 가지의 단백질, 지질, 소분자, 전해질, 및 심지어 올리고당 및 올리고뉴클레오타이드의 동시 정량화가 제공된다(도 1).
일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 먼저 메탄올성 용액에서 균질화되고 변성된다. 그 다음 분석물을 화학적으로 표준화하여 LC-MS 순응성을 개선시키고, 예를 들어 거대분자는 효소에 의해 작은 분자와 같은 단편으로 가수분해되고, 중성 지질 및 전해질과 같이 잘 검출되지 않는 분자는 이온화 부가물과 쌍을 이룬다. LC-MS-비호환성 잔해물은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전되어, 원심분리 정화 후 포함된 혼합-극성 추출물을 산출한다. 분석물은 질량 분석 데이터 획득 전에 직교 혼합 모드(또는 다중 모드의) 크로마토그래피를 사용하여 분리된다. 전체 MS 스캔 및 MS/MS 단편화 스캔은 양성 및 음성 이온화 분자 둘 다를 포획하기 위해 극성 전환이 있는 다중-오믹 제제에 대해 획득된다. 샘플 처리 방법의 보다 상세한 설명은 하기 및 실시예에서 추가로 찾을 수 있다.
하기 실시예에 나타낼 바와 같이, 본 방법이 화학적으로 다양한 분자의 분리 및 정량화를 가능하게 한다는 것을 입증하기 위해, 단백질, 지질, 대사물질 및 전해질을 포함하는 대표적인 분석물 세트가 분석을 위해 선택되었다. 극성 중성 화합물, 예컨대, 당 및 올리고당을 제외하고 대부분의 화합물은 크로마토그래피에 의해 유지되었다. 이러한 분석물은 인간 혈장 제제에서 내인성 수준으로 검출 가능하였다(도 2).
정량화 방법의 재현성을 입증하기 위해, 5개의 공복 혈장 샘플 제제를 5중으로 분석하였다. 소량의 대표적인 분석물 세트를 검사할 때, 측정값은 샘플을 구별하기에 충분히 정확하였다(도 3). KNIME(v3.6.2) OpenMS(v2.4.0) 플러그인을 사용하는 이러한 데이터의 라벨이 없는 특성 정량화는 총 98,797개의 동위원소가 제거된 특성을 산출하였고, 이 특성 중 12,150개는 샘플내 변동 계수(CV)가 20% 미만이고 평균 샘플내 CV가 샘플간 CV보다 더 작았다. 풀링된 혈장의 반-포괄적 BoxCar-유사 데이터-종속 획득 단편화 스캔 분석에서 10회의 60분 실행에 걸쳐 좁은 전구체 스캔 창을 사용함으로써, Thermo Proteome Discoverer(v2.2.0)를 사용하여 2,559개 단백질 패밀리에 대해 펩타이드 일치가 발견되었고, Thermo Compound Discoverer(v2.0.0)를 이용하여 270개 화합물 일치를 발견하였다.
다중 생화학적 부류의 동시 상향식 거대분자 분석의 실현 가능성을 입증하기 위해, 췌장 내용해 효소 알파-아밀라제, RNase A, 및 DNase I을 사용하여 혈청 알부민, 글리코겐, RNA, 및 DNA를 분해하였다. 18시간에 걸친 분해는 심지어 트립신 및 메탄올의 존재하에서도 올리고당, 올리고뉴클레오타이드, 및 올리고데옥시뉴클레오타이드에 해당하는 검출 가능한 생성물을 산출하였다. 생물학적 매트릭스에서 이러한 접근법을 테스트하기 위해, 마우스 간 호모제네이트를 RNase A 및 트립신으로 분해하여, 대사물질, 올리고당, 올리고뉴클레오타이드, 및 트립신에 의한 펩타이드의 검출을 허용하였다(도 5 및 6). 심지어 효소가 없어도, 저분자량 성분은 명확하게 분리되고, 식별 가능하며 정량화 가능하다(도 4). 배양된 인간 간암 세포(도 7), 인간 혈장(도 8), 소 지방 조직(도 9) 및 인간 소변(도 10)에서 유사한 결과가 얻어진다.
방법의 각각의 구성요소 및 단계는 하기에 보다 상세히 기재되어 있다. 일 실시형태에서, 분석을 수행하기 위한 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 분석을 수행하기 위해 필요한 모든 기기 및 시약을 포함하는 장비 또는 장치가 제공된다. 일 실시형태에서, LC-MS에 의한 분석을 위한 준비로 입력 샘플을 처리하기 위한 유체 또는 미세유체 경로가 제공된다. 일 실시형태에서, 개별 샘플은 다수의 샘플을 순차적으로 또는 장치 또는 장비에 프로그래밍된 임의의 순서로 자동 처리하기 위한 카세트 또는 유사한 장치에 로딩될 수 있다. 일 실시형태에서, 장비 또는 장치는 샘플에 존재하는 분석물의 존재, 정체성 또는 양에 대한 데이터를 제공하도록 프로그래밍될 수 있다. 일 실시형태에서, 장비 또는 장치는 샘플 중 다양한 분석물의 존재 또는 부재 또는 상대적 양을 기반으로 하여, 질환 또는 웰니스 프로파일의 진단을 제공하도록 프로그래밍될 수 있다. 일 실시형태에서, 장치로부터의 출력은 병태 또는 질환의 치료적 개입 또는 예방을 안내하고, 이어서 병태 또는 질환의 진행 및 치료적 개입의 유효성 또는 이의 결여를 모니터링한다. 일 실시형태에서, 장비 또는 장치는 샘플에 존재하는 분석물의 개별 또는 그룹에 관한 미리 정의된 매개변수 세트를 기반으로 하여 샘플을 분류하도록 프로그래밍될 수 있다. 일 실시형태에서, 새로운 샘플에서 건강 또는 질환을 식별하는 데 사용하기 위해, 다양한 병태 또는 질환이 있는 개체의 대규모 집단 유래의 샘플로부터의 결과를 포함하는 데이터베이스가 생성된다. 이러한 실시형태는 의도된 목적을 위해 본 발명을 이용하는 장비 및 장치, 방법, 또는 시스템을 본 발명의 유용성에 대해 어떠한 방식으로든 제한하려는 것으로 의도되지 않는다.
내부 샘플 및 분석물. 일 실시형태에서, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법이 제공된다. 가용성 추출물이 LC-MS에 의한 분석용으로 준비될 수 있는 임의의 샘플이 사용될 수 있다. 샘플은 비제한적인 예로서 생물학적 샘플, 물 샘플, 오일 샘플, 토양 샘플, 광물학적 샘플, 오염수 샘플, 생성물 샘플, 육류 샘플 등일 수 있다. 샘플은 고체, 액체, 또는 이들의 조합일 수 있다. 샘플은 성분이 수성 배지에 용해되어 있는 기체 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플의 비제한적인 예는 인간 또는 다른 동물, 또는 식물 유래의 샘플을 포함한다. 동물 유래의 샘플의 비제한적인 예는 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 뇌척수액, 타액, 땀, 타액, 정액, 생검 시편, 세포 또는 조직 샘플을 포함한다. 다른 샘플은 모발, 손톱, 벗겨진 피부, 비듬 등일 수 있다. 샘플은 수용액, 수성 현탁액 또는 수성 조직일 수 있다. 샘플은 고체 또는 반고체 샘플로부터 균질화될 수 있다. 다른 생물학적 샘플은 바이오필름, 식품 및 음료 제조물 및 파생물을 포함한다. 비생물학적 샘플은 산업용 재료, 예컨대, 원료, 공정중 샘플, 공정 중간체 및 제조 배치(이들로 제한되지 않음)를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 방법은 비생물학적 재료, 예컨대, 암석 및 광물 샘플, 화석화된 인간 및 다른 동물을 포함하는 화석, 및 외계 공급원 또는 위치 유래 또는 그 상의 암석 샘플에서 생물학적 성분의 존재를 결정하는 데 사용된다.
샘플은 다중 분석물을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 분석물은 화학적으로 관련되어 있다. 일 실시형태에서, 분석물은 화학적으로 관련되지 않는다. 일 실시형태에서, 분석물은 생체고분자, 예컨대, 임의의 생체분자 포함 또는 반복 단위의 유사한 서브유닛, 예컨대, 다당류, 핵산 및 단백질이다. 다른 분석물은 소분자 화합물, 예컨대, 대사물질, 전해질, 당, 아미노산, 금속, 약물 등이다. 다른 생물학적 성분은 극성 및 비극성 지질, 휘발성 화합물, 다른 외인성 화학물질 등을 포함한다. 본 명세서의 상기 및 기타 설명은 주로 생물학적 공급원 유래 분석물, 구체적으로 인체 유래, 임의의 수의과 또는 가축 유래 분석물을 기재할 뿐만 아니라 무생물 전체 유기체, 예컨대, 수질 오염물질, 산업 화학물질 및 산업 생성물도 또한 포함된다. 식물 유래의 공급원도 본 명세서에서 포함된다.
일 실시형태에서, 샘플은 단계 1 또는 단계 1 동안에 균질화된다. 샘플은 수용액, 예컨대, 물 또는 수성 완충제에서 균질화될 수 있다.
단계 1: 변성. 샘플 중 생체고분자를 변성시키는 변성 시약으로 샘플을 처리하여 변성된 샘플을 형성하며, 여기서 변성 시약은 첨가될 때 표준화 시약의 성분을 변성시키지 않는다.
일 실시형태에서, 변성 시약은 하나 이상의 용매, 하나 이상의 카오트로픽제, 하나 이상의 참조 표준물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일 실시형태에서, 용매는 메탄올, 에탄올, 아세토나이트릴, 또는 다른 휘발성 유기 용매 또는 이들의 임의의 조합이다. 일 실시형태에서, 용매는 메탄올이다. 일 실시형태에서, 수성 샘플은 거의 동일한 양의 메탄올에서 균질화된다. 일 실시형태에서, 변성 시약은 금속-킬레이트제를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 금속-킬레이트제는 EDTA, EGTA 또는 DMSA이다. 일 실시형태에서, 금속-킬레이트제는 EDTA이다. 일 실시형태에서, 예컨대, EDTA가 혈액 샘플에 대한 항응고제로 사용될 때, 금속-킬레이트제는 샘플에 존재한다.
일 실시형태에서, 상기 기재된 바와 같은 샘플의 변성은 다음 단계에 기재된 바와 같이 표준화와 함께 수행된다. 일 실시형태에서, 변성 후 샘플의 성분은 표준화 단계의 효소 및 다른 성분이 변성 단계로부터의 임의의 성분의 존재 하에 원하는 기능을 수행할 수 있다는 점에서 표준화 단계와 양립 가능하다. 일 실시형태에서, 변성 단계는 약 40 내지 60% 메탄올 함량을 가지는 용액을 생성한다.
단계 2: 표준화. 변성된 샘플은 표준화 시약으로 처리되며, 여기서 표준화 작용제는 변성된 샘플 중 다중 분석물을 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종으로 전환시킨다. 일 실시형태에서, 이렇게 형성된 종은 다중 모드의 크로마토그래피에 의해 분리되고 질량 분석에 의해 개별적으로 식별되어 표준화된 샘플을 형성할 수 있다.
일 실시형태에서, 표준화 시약은 샘플에서 생체고분자를 분석물 단편 종으로 해중합하는 하나 이상의 효소를 포함한다. 일 실시형태에서, 표준화 시약은 췌장 내용해 효소를 포함한다. 일 실시형태에서, 표준화 시약은 하나 이상의 프로테이나제, 하나 이상의 뉴클레아제, 하나 이상의 글리코시다제, 하나 이상의 리파제, 하나 이상의 킬레이트제, 하나 이상의 완충제, 하나 이상의 환원제, 하나 이상의 유도체화제, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
일 실시형태에서, 프로테이나제는 트립신, 키모트립신, 프로테이나제 K, LysC, LysN, AspN, GluC 또는 ArgC이다. 일 실시형태에서, 프로테이나제는 트립신이다.
일 실시형태에서, 유도체화제는 β-머캅토에탄올, 다이싸이오트레이톨, 트리스 (2-카복시에틸) 포스핀-HCl, 또는 요오도아세트아마이드이다. 일 실시형태에서, 유도체화제는 요오도아세트아마이드이다.
일 실시형태에서, 완충제는 포스페이트, 시트레이트, 바이카보네이트, 설포네이트, 폼에이트, 아세테이트 또는 암모니아이다. 일 실시형태에서, 표준화 동안 샘플의 pH는 샘플의 표준화를 최대로 가능하게 하도록 제공된다. 일 실시형태에서, pH는 약 7.8이다.
일 실시형태에서, 표준화 시약은 트립신, 리보뉴클레아제 A, EDTA, 암모늄 바이카보네이트, 및 아밀라제의 조합물을 포함한다.
일 실시형태에서, 표준화 시약은 50mM 암모늄 바이카보네이트, 5mM EDTA, 및 1:20 m/m 트립신:샘플 단백질을 포함한다.
일 실시형태에서, 표준화는 상이한 효소의 최적 pH가 상이할 때와 같이 특정 시약이 양립할 수 없는 연속적인 단계를 포함하여, 표준화 과정 동안의 조건은 샘플을 최대로 표준화하도록 변화된다. 일 실시형태에서, 표준화 시약이 DNase I을 포함할 때, EDTA는 동시에 존재하지 않는다.
일 실시형태에서, 프로테아나제는 변성된 샘플에 동시에 또는 표준화 시약의 다른 성분과 변성된 샘플을 인큐베이션한 후에 첨가된다.
일 실시형태에서, 표준화 시약으로 처리하는 것은 약 37℃의 온도에서 약 0 내지 24시간 동안의 인큐베이션을 포함한다.
생체고분자가 가수분해없이 분석하기 어려울 수 있는 LC-MS에 의해 분석될 수 있고 마찬가지로 LC-MS에 의해 분석 가능한 임의의 성분을 유도체화할 수 있는 단편으로 생체고분자를 가수분해하는, 표준화 단계의 원하는 결과를 위한 이러한 가이드라인은 제한을 의미하지 않는다.
단계 3: 추출. 표준화된 샘플은 추출 시약으로 처리되고 내부의 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종은 유지되어, 추출된 샘플을 형성한다.
유기 용매의 첨가는 실질적으로 동시에 샘플에서 단백질을 제거하고 이의 대사물질을 추출하는 대사체학 방법에서 일반적으로 사용되는 절차이다. 극성 및 비극성 분자를 둘 다 추출하는 동안 혼합 극성 용매 조합물을 이용하여 샘플 정화 작업을 제공한다. 샘플을 선택적으로 농축시킬 수 있지만, 이러한 상대적으로 미정제인 제제를 주입하면 아이소프로판올 또는 에탄올과 같은 휘발성 분석물의 검출이 가능하게 된다.
본 명세서에서 언급된 바와 같이, LC-MS에 의해 분석될 수 있는 샘플 중 분석물의 성분은 변성 및 표준화 단계에 의해 가용성이 되는 성분이다. 이러한 가용성 성분은 추출된 다음 LC-MS에 의해 분석된다. 일 실시형태에서, 추출 시약은 표준화 샘플에 1:1(v/v)로 첨가된다. 일 실시형태에서, 추출 시약은 아세토나이트릴 및 아세톤을 포함한다. 일 실시형태에서, 아세토나이트릴 및 아세톤은 1:1(v/v)로 존재한다.
일 실시형태에서, 추출 단계 후 샘플은 원래 샘플 중 가용성 성분 및 분석물의 단편을 포함한다. 일 실시형태에서, 추출된 샘플에서 가용성 성분을 분리하는 것은 원심분리 또는 여과에 의해 달성된다.
변성, 표준화 및 추출의 상기 방법은 별개의 단계로 기재되어 있지만, 일 실시형태에서 시약 첨가, 혼합, 인큐베이션, 가열, 분리, 및 다른 조작이 임의의 적절한 순서로 달성되어 LC-MS용 샘플을 준비할 수 있는 유체 경로로 연속적으로 수행될 수 있다. 유체 경로가 이용되는 일 실시형태에서, 샘플이 도입되고, 변성 시약이 유체에 첨가된 다음 조합된 용액이 혼합 챔버 또는 난류 영역에서 혼합되며; 직경, 길이 및 유속이 원하는 변성 결과를 최적화하기 위해 제공된다. 그 다음 샘플이 유체 경로를 통해 이동하거나 유체 경로를 따라 고정화될 때 표준화 시약이 샘플에 첨가된다. 동시에 양립할 수 없는 표준화 시약 및 조건의 경우, 샘플은, 예를 들어 EDTA의 부재 하에 뉴클레아제로 처리된 다음, 후속적으로 EDTA의 존재 하에 희석되고 다른 성분 중에서 프로테이나제 및 글리코시다제로 처리될 수 있다. 길이, 직경, 유속, 잔잔한 또는 난류/혼합 영역을 포함한 유체 경로 설계는 샘플 처리 단계의 효율성을 최대화하도록 설계될 것이다. 표준화 후, 추출 시약은 유체 경로에 첨가되고, 유체의 가용성 성분은 인라인 여과, 연속식 원심분리 또는 띠원심분리, 또는 추가 처리를 위해 가용성 성분을 분리하는 임의의 다른 수단에 의해 불용성 성분으로부터 분리된다. 처리 후, 추출된 샘플은 LC-MS 로 들어갈 수 있거나, 처리된 샘플은 연속적으로 저장되고, 그 후 다음 프로그래밍된 샘플이 분석될 준비가 될 때 LC-MS로 주입될 수 있다. 상기 조건은 단지 샘플 처리를 위한 단일 유체 경로 수단의 형태의 예시일 뿐이며 어떠한 방식으로든 제한하려는 것으로 의도되지 않는다.
일부 실시형태에서, 유체 처리는 중력 의존적이다. 일부 실시형태에서, 유체 처리 경로는, 예를 들어 우주 환경 및 탐사에서의 사용을 위해 중력 독립적이다.
단계 4 LC-MS. 추출된 샘플에 다중 모드의 크로마토그래피, 그 다음 질량 분석법을 적용하여, 내부에 존재하는 각각의 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종에 대한 MS 데이터가 생성된다.
일 실시형태에서, 전자분무 이온화가 사용된다. 다른 실시형태에서, 주변 압력 화학 이온화(ambient pressure chemical ionization; APCI), 주변 압력 광-이온화(ambient pressure photo-ionization; APPI) 또는 전자분무 이온화(electrospray ionization; ESI)가 사용된다. 이들은 이용될 수 있지만 제한적인 것으로 의도되지 않는 주변 압력 이온화(ambient pressure ionization; API) 방법의 예이다.
불량하게 검출된 분석물의 LC-MS 반응을 개선시키기 위한 화학적 첨가제의 사용은 잘 확립되어 있다. 휘발성 염, 예컨대, 암모늄 아세테이트가 이온 교환 상을 용리시키는 데 그리고 지질과 같은 중성 화합물의 이온화를 개선시키는 데 사용된다. 메드론산 및 EDTA를 사용하여 인산화 화합물 및 금속 이온의 크로마토그래피 및 감도를 개선시키는 데 금속-배위제가 사용되었다. 이와 같은 전략의 조합은 본 명세서에서 역상, 양이온- 및 음이온-교환 특성을 특징으로 하는 상업적으로 입수 가능한 삼중 모드 혼합형 모드 칼럼으로부터 분석물을 용리시키는 데 사용된다. 수성 출발 조건을 사용하여, 이 칼럼은 올리고당 및 당과 같은 극성 중성 분자를 제외하고 대부분의 화합물을 보유하는 것으로 보인다.
다중 모드의 크로마토그래피는 다양한 화학적 종의 크로마토그래피 분리를 가능하게 하는 반면, 단일 모드의 크로마토그래피를 특징으로 하는 크로마토그래피는 정지상과 화학적 상호작용에 참여하지 않는 분석물을 분리하지 못한다. 다중 분리 모드는 오프라인 분별, 또는 온라인 1차원 혼합층/상 칼럼, 또는 온라인 연속적 다차원 LC을 포함하여, 다양한 형식의 복잡한 분석물 혼합물을 분석하는 데 일반적으로 사용된다. 본 명세서에서 본 발명자들은 상업적으로 입수 가능한 삼중 모드 칼럼을 기재하지만, 모드 수의 증가는 이온 이동성, 키랄성, 크기, 및 비이온성 극성을 포함한 다른 화학적 특성을 기반으로 하여 분리를 개선시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 다중 모드의 크로마토그래피는 역상 분리, 양이온 교환 분리, 음이온 교환 분리, 이온쌍 분리, 정상 분리, 이온 이동성 분리, 크기-배제 분리, 키랄 분리, 친화성 분리, 리간드 교환 분리, 극성 비이온성 분리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일 실시형태에서, 크로마토그래피에 사용되는 이동상은 하나 이상의 이온화 부가물, 예컨대, 암모늄, 양성자, 나트륨, 아세테이트, 폼에이트, 프로피오네이트, 포스페이트, 메드로네이트, 우레아, 뷰렛, 트라이유렛, 또는 이들의 임의의 조합물(이들로 제한되지 않음)을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 질량 분석법 데이터 획득은 양이온 및 음이온 모드 둘 다에서 동적 배제가 있는 저해상도 또는 고해상도 MS2 데이터-독립적 또는 데이터-종속적 획득이 있는 고해상도 전체 스캔을 포함한다.
단계 5: 분석. MS 데이터로부터 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준을 컴퓨터로 결정하는 것.
일부 실시형태에서, LC-MS 데이터는 크로마토그래피 체류 시간, 이온 이동성 충돌 교차부, 상이한 형태에 대한 전구체 및 생성물 이온 질량-대-전하 비율, 이온 부가물의 상태 및 비율, 손실, 다량체, 동위원소 존재도, 전하 상태, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일 실시형태에서, MS 데이터로부터 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준을 컴퓨터로 결정하는 것은 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편 종의 MS 데이터를 기지의 분석물의 기지량으로부터 생성된 종의 MS 데이터와 비교하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, MS 데이터로부터 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준을 컴퓨터로 결정하는 것은 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편 종의 MS 데이터를 해당 종의 동위원소의 알려진 양으로부터 생성된 MSs 데이터와 비교하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, MS 데이터로부터 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준을 컴퓨터로 결정하는 것은 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편 종의 MS 데이터를 알려진 또는 이론적 분석물의 컴퓨터로 시뮬레이션한 MS 데이터와 비교하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 생체고분자 단편에 대한 MS 데이터의 컴퓨터를 이용한 시뮬레이션은 생체고분자 단편에 대한 서브유닛의 모든 가능하거나 고려되는 조합 및 순율을 생성하는 것 및 이론적 생체고분자 단편의 서브유닛 화학적 조성을 기반으로 하여 예상 MS 데이터를 계산하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, MS 데이터로부터 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 정체성을 컴퓨터로 결정하는 것은 전구체 이온의 동위원소 분포를 알려진 생화학적 부류의 컴퓨터로 시뮬레이션된 동위원소 분포와 비교하고, 후속적으로 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편 종의 MS 데이터를 일치된 생화학적 부류로부터의 알려진 또는 이론적 분석물의 MS 데이터와 비교함으로써 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편 종의 생화학적 부류를 사전 식별하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, MS 데이터로부터 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재 또는 수준을 컴퓨터로 결정하는 것은 샘플에 첨가되었거나 이미 샘플에 존재한 기지의 분석물의 기지량의 강도 피크 면적에 비례하여 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편의 강도 피크 면적을 조정하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, MS 데이터로부터 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 정체성을 컴퓨터로 결정하는 것은 크로마토그래피 체류 시간, 예상되는 동위원소 질량, 또는 이들의 전구체 이온, 단편 이온, 대체적인 전하-상태 이온, 대체적인 양으로 하전되거나 또는 음으로 하전된 이온의 상대적 존재도, 또는 화학적으로 관련된 이온, 예컨대, 알려진 분석물에 대해 기록되거나 시뮬레이션된 것의 또는 이로부터의 이와 같은 특징에 대한 유도체 또는 유사체를 기반으로 하여 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편 종을 일치시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, MS 데이터에서 종을 식별하고 이로부터 분석물의 정체성을 식별하기 위한 소프트웨어, 알고리즘 및 다른 방법은 KNIME(v3.6.2) OpenMS(v2.4.0) plugin, Thermo Proteome Discoverer(v2.2.0) 및 Thermo Compound Discoverer(v2.0.0)의 사용에 의해 달성되지만, 이들은 단지 예시적일 뿐 제한하려는 것으로 의도되지 않는다.
방법의 일례에서, 다음 단계가 수행될 수 있다.
단계 1. 샘플을 메탄올을 포함하는 동일한 부피의 변성 시약으로 처리하는 단계로서, 변성제는 샘플 중 생체고분자를 변성시켜 변성된 샘플을 형성하고, 변성 시약은 첨가될 때 표준화 시약의 성분을 변성시키지 않는, 변성 시약으로 처리하는 단계;
단계 2. 변성된 샘플을 50mM 암모늄 바이카보네이트, 5mM EDTA, 1:20 m/m 트립신:샘플 단백질(pH 7.8)을 포함하는 표준화 시약으로 37℃에서 4시간 동안 처리하는 단계로서, 표준화 시약은 변성된 샘플 중 다중 분석물을 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종으로 전환시키고, 종은 다중 모드의 크로마토그래피에 의해 분리되고 질량 분석법에 의해 개별적으로 식별 가능함으로써, 표준화된 샘플을 형성하는, 표준화 시약으로 처리하는 단계;
단계 3. 표준화된 샘플을 아세토나이트릴:아세톤을 1:1로 포함하는 동일한 부피의 추출 시약으로 처리하고, 샘플을 원심분리하여 내부에 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 포함하는 상청액을 보유하여 추출된 샘플을 형성하는 단계;
단계 4. 추출된 샘플에 다중 모드의 크로마토그래피를 적용한 다음 질량 분석법을 적용하여, 내부에 존재하는 각각의 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종에 대한 MS 데이터를 생성하는 단계; 및
단계 5. MS 데이터로부터 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재 또는 수준, 및/또는 정체성을 컴퓨터로 결정하는 단계.
상기 방법, 장비, 장치 또는 시스템은 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 생물학적 샘플이 유래된 살아있는 공급원의 병태를 결정하기 위한 방법으로서,
a. 본 명세서에 기재된 방법에 따라서 생물학적 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준을 실질적으로 동시에 결정하는 단계;
b. 내부 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 상기 병태가 없는 살아있는 공급원 샘플 유래의 생물학적 샘플과 비교하는 단계로서, 상기 병태는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준의 변화로부터 식별 가능한 것인, 비교하는 단계; 및
c. 상기 살아있는 공급원의 병태를 결정하는 단계
를 포함한다.
일 실시형태에서, 병태는 병리학적 병태 또는 질환이고, 결정의 결과는 치료적 개입을 안내하거나 질환 또는 병태의 치료의 유효성 또는 진행을 모니터링하는 데 사용된다. 일 실시형태에서, 병태는 식이 또는 대사 불균형이고 결정의 결과는 식이 또는 생활양식의 변화를 안내하고, 변화의 효과 및 진행을 모니터링하는 데 사용된다. 일 실시형태에서, 방법은 병리학적 병태와 같은 병태로부터의 보호, 또는 상기 상태의 발병 위험과 연관된 분자 또는 분자의 패턴을 결정하는 데 사용될 수 있다. 비제한적인 일례에서, 제II형 당뇨병(T2D) 발병 위험이 평가될 수 있고, T2D가 있는 대상체 유래의 샘플 대 건강한 개체의 샘플에서 분석물 또는 패턴 또는 분석물을 비교함으로써 새로운 바이오마커가 발견될 수 있으므로, T2D 샘플은 당뇨병 위험 증가와 현재 연관되지 않은 하나 이상의 화합물 또는 바이오마커의 수준이 높거나 낮고, 건강한 샘플은 현재 당뇨병에 대한 보호를 나타내지 않는 이와 같은 화합물 또는 바이오마커의 수준이 낮거나 높다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 모든 방법 단계를 수행할 수 있는 장비 또는 장치에 의해 수행된다. 일 실시형태에서, 장비는
a. 샘플 중 생체고분자를 변성시켜 변성된 샘플을 형성하기 위한 수단으로서, 변성 시약은 첨가될 때 표준화 시약의 성분을 변성시키지 않는, 수단;
b. 샘플을 표준화시키기 위한 수단으로서, 변성된 샘플 중 다중 분석물은 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종으로 전환되고, 종은 다중 모드의 크로마토그래피에 의해 분리되고 질량 분석법에 의해 개별적으로 식별 가능한, 수단;
c. 표준화된 샘플을 추출하고 내부에 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 보유하기 위한 수단;
d. 추출된 샘플에 다중 모드의 크로마토그래피를 적용한 다음 질량 분석법을 적용하여, 내부에 존재하는 각각의 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종에 대한 MS 데이터를 생성하기 위한 수단; 및
e. MS 데이터로부터 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준을 컴퓨터로 결정하기 위한 수단
을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 본 명세서에 기재된 방법을 수행하는 시스템이 제공된다. 일 실시형태에서, 단일 샘플에 존재하는 화학적으로 관련된 다중 분석물 및 화학적으로 관련되지 않은 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 시스템이 제공되며, 상기 시스템은
a. 샘플 중 생체고분자를 변성시켜 변성된 샘플을 형성하는 변성 시약으로서, 첨가될 때 표준화 시약의 성분을 변성시키지 않는, 변성 시약;
b. 샘플 중 다중 분석물을 혼합 모드 액체 크로마토그래피에 의해 분리되고 직렬 질량 분석법에 의해 개별적으로 식별 가능한 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편 종으로 전환시키는 표준화 시약;
c. 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 추출하는 추출 시약;
d. 내부에 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 보유하여 추출된 샘플을 형성하는 분리 공정;
e. 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 분석하는 다중 모드의 크로마토그래피;
f. 개별 종에 대한 데이터를 생성하는 질량 분석; 및
g. 각각의 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종의 데이터로부터 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준을 컴퓨터로 결정하기 위한 하나 이상의 알고리즘
을 포함한다.
일부 실시형태는 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법을 제공하며, (a) 상기 상이한 유형의 복수의 분석물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 상기 샘플에 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체를 포함하는 용액을 산출하기에 충분한 조건을 적용하는 단계; 및 (b) 기기를 사용하여 상기 용액을 처리하여 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체를 식별하여 상기 복수의 분석물을 식별하는 단계로서, 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 상기 기기의 단일 실행으로 식별되는, 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, (b)는 단일 기기 실행에서 수행된다. 당업자는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "단일 기기 실행"이 일반적으로 하나의 단일 샘플을 한 번 로딩할 때 하나의 단일 기기로 수행되는 하나의 단일 분석 과정을 지칭함을 이해할 것이다. 당업자는 분석물의 "유도체"가 분석물의 단편화, 이온화, 산화, 환원, 화학적 작용화, 화학적으로 작용기 제거, 이성질체화, 배위결합, 중합화, 또는 다량체화된 형태, 또는 이들의 조합일 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 복수의 분석물은 단백질, 핵산, 소분자, 지질, 탄수화물, 전해질, 및 금속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3가지 유형의 분석물을 포함한다. 당업자는 "전해질"의 비제한적인 예가 Na+, Cl-, K+, 바이카보네이트, 포스페이트, 설페이트, 브로마이드, 아세테이트, 폼에이트, 및 암모늄을 포함함을 이해할 것이다. 당업자는 또한 소분자의 비제한적인 예가 분자량이 900 달톤 미만, 1500 달톤 미만, 또는 2000 달톤 미만인 분자를 포함함을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 복수의 분석물은 소분자, 지질, 및 탄수화물로부터 선택되는 적어도 1가지 유형의 분석물; 및 단백질, 핵산, 전해질, 및 금속으로부터 선택되는 적어도 2가지 유형의 분석물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 분석물은 단백질, 및 핵산으로부터 선택되는 적어도 1가지 유형의 분석물; 및 소분자, 지질, 및 탄수화물로부터 선택되는 적어도 2가지 유형의 분석물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 복수의 분석물은 소분자, 지질, 및 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 복수의 분석물은 소분자, 지질, 탄수화물, 및 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 복수의 분석물은 소분자, 지질, 탄수화물, 및 전해질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 복수의 분석물은 소분자, 지질, 탄수화물, 전해질, 및 금속을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 복수의 분석물은 단백질 및 핵산 중 하나 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 내인성 소분자, 외인성 소분자, 또는 이들의 조합물이다. 일부 실시형태에서, 상기 복수의 분석물은 외인성 화학물질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 복수의 분석물 중 적어도 하나는 휘발성 화합물이다. 일부 실시형태에서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 상기 복수의 분석물과 상이한 분자 크기 또는 질량 분포를 가진다. 일부 실시형태에서, 상기 용액 중 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 복수의 분석물과 상이한 하전된 분자의 양, 친수성 분자의 양, 소수성 작용기를 갖는 분자의 양, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 하전된 분자는 음으로 하전된 분자, 양으로 하전된 분자, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 복수의 분석물과 상이한 산성 및 염기성 작용기에 대한 분자의 pKa 상수값의 분포를 가진다. 일부 실시형태에서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 복수의 분석물과 상이한 분자의 옥탄올-물 분배 계수의 분포를 가진다. 일부 실시형태에서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 미리 결정된 범위 내에 속하는 분자의 질량 백분율이 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 상기 복수의 분석물보다 더 크다. 일부 실시형태에서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 상기 복수의 분석물보다 더 좁은 분자 크기 또는 질량 분포를 가진다. 일부 실시형태에서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 하전된 분자의 질량 백분율이 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 상기 복수의 분석물보다 더 크다. 일부 실시형태에서, 상기 용액 중 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 옥탄올-물 분배 계수에 의해 측정된 친수성 분자의 질량 백분율이 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 상기 복수의 분석물보다 더 크다. 일부 실시형태에서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 상기 복수의 분석물보다 더 좁은 질량-대-전하 비(m/z)의 분포를 가져서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 질량 분석법에 의해 검출 가능한 범위 내에 속하는 분자의 질량 백분율이 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 상기 복수의 분석물보다 더 크다. 일부 실시형태에서, 질량 분석법에 의해 검출 가능한 상기 범위는 전자 전하 당 100 달톤(Da/e) 내지 2,000 Da/e이다. 일부 실시형태에서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체 각각은 질량-대-전하 비(m/z)가 전자 전하 당 15 달톤(Da/e) 내지 4,000 Da/e이다.
상기 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, (a)는 처리된 샘플을 얻기 위해 다음 중 하나 또는 임의의 조합을 포함한다: (i) 샘플을 균질화하는 것; (ii) 상기 샘플을 변성제와 접촉시켜 상기 복수의 분석물 중 적어도 하나의 형태를 변화시키는 것; (iii) 상기 샘플을 킬레이트제와 접촉시켜 상기 복수의 분석물 중 적어도 하나와 킬레이트 착물을 형성하는 것; (iv) 상기 샘플을 유도체화제와 접촉시켜 상기 복수의 분석물 중 적어도 하나의 유도체를 형성하는 것; (v) 상기 샘플을 환원제와 접촉시켜 상기 복수의 분석물 중 적어도 하나를 변형시키는 것; 및 (vi) 상기 샘플을 효소와 접촉시켜 상기 복수의 분석물 중 적어도 하나의 단편을 생성하는 것. 일부 실시형태에서, (iii)은 1회 이상 수행된다. 일부 실시형태에서, (vi)은 1회 이상 수행된다. 일부 실시형태에서, (i)은 (ii) 전에 또는 이와 실질적으로 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, (ii)는 (iii)과 실질적으로 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, (ii)는 (vi) 전에 또는 이와 실질적으로 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, (vi)은 (iii), (iv), 및 (v) 중 하나 이상과 실질적으로 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, (vi)은 (iv)와 실질적으로 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, (vi)은 (iii) 및 (iv)와 실질적으로 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, (iii)은 (i)과 실질적으로 동시에 1회, 그리고 (vi)과 실질적으로 동시에 다시, 적어도 2회 수행된다. 일부 실시형태에서, (vi)은 (ii)와 실질적으로 동시에 1회, 그리고 (iv)와 실질적으로 동시에 다시, 적어도 2회 수행된다. 일부 실시형태에서, (ii)와 실질적으로 동시에 수행되는 (vi)에서 사용되는 상기 효소는 프로테아제이다. 당업자는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "실질적으로 동시에"가 일반적으로 관련 방법의 목적을 이행하는 데 필요한 것보다 서로 더 길지 않은 시간적 접근성 내에서(즉, 1시간 이내, 30분 이내, 10분 이내, 5분 이내, 또는 1분 이내) 관련 단계 각각을 수행하는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, (i)은 1:5 내지 5:1의 부피비인 물과 메탄올의 혼합물에서 수행된다. 일부 실시형태에서, (i)은 1:2 내지 2:1의 부피비인 물과 메탄올의 혼합물에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 상기 혼합물은 물과 메탄올의 부피 기준으로 1:1 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 상기 변성제는 용매, 카오트로픽제, 및 참조 표준물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 용매는 메탄올, 에탄올, 및 아세토나이트릴로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 용매는 메탄올이다. 일부 실시형태에서, 상기 킬레이트제는 (iii)의 각각의 경우에 독립적으로, 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌 글라이콜-비스(β-아미노에틸 에터)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 및 다이머캅토석신산(DMSA)으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 킬레이트제는 EDTA이다. 일부 실시형태에서, 상기 유도체화제는 펩타이드-알킬화제이다. 일부 실시형태에서, 상기 유도체화제는 요오도아세트아마이드이다. 일부 실시형태에서, 상기 효소는 (vi)의 각각의 경우에 독립적으로, 뉴클레아제, 프로테아제, 글리코시다제, 및 리파제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 임의의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 글리코시다제는 아밀라제이다. 일부 실시형태에서, 상기 프로테아제는 트립신이다. 일부 실시형태에서, 상기 뉴클레아제는 DNase I 및 리보뉴클레아제 A 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNase I 및 EDTA는 (vi)에 동시에 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, (vi)은 암모늄 바이카보네이트 완충제에서 수행된다. 일부 실시형태에서, (vi)은 약 37℃에서 약 24시간 이하 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, (a)는 상기 처리된 샘플로부터 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체를 추출 시약으로 추출하여 상기 용액을 얻는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 추출은 상기 추출 시약을 상기 처리된 샘플에 부피 기준으로 1:1로 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 추출 시약은 아세토나이트릴 및 아세톤을 부피 기준으로 1:1로 포함한다. 일부 실시형태에서, (a)는 원심분리 또는 여과에 의해 상기 용액으로부터 불용성 불순물을 제거하는 것을 추가로 포함한다.
상기 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, (b)는 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체에 전자빔을 적용하여 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체 중 적어도 하나의 적어도 하나의 이온화된 형태 또는 단편을 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, (b)는 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체를, 적어도 3개의 직교 크로마토그래피 모드를 포함하는 혼합 모드 크로마토그래피 매트릭스와 접촉시키는 것을 추가로 포함하며, 여기서 적어도 3개의 직교 크로마토그래피 모드 각각은 상기 용액으로부터 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체의 주어진 유형을 분리하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 상기 직교 크로마토그래피 모드 중 적어도 하나는 상기 용액으로부터 상기 분석물의 적어도 하나의 유도체를 분리한다. 일부 실시형태에서, 상기 혼합 모드 크로마토그래피 매트릭스는 양이온 교환 특성, 음이온 교환 특성, 이온 배제 특성, 리간드 교환 특성, 크기 배제 특성, 키랄 특성, 역상 특성, 친화성 특성, 친수성 특성, 다배위자 특성, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3가지 특성을 포함한다. 당업자는 "양이온 교환"이 강한 양이온-교환(SCX) 및 약한 양이온-교환(WCX)을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 또한 "음이온 교환"이 강한 음이온-교환(SAX) 및 약한 음이온-교환(WAX)을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, (b)는 상기 복수의 분석물 및 이의 유도체를 적어도 3가지 이동상으로 용리시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 복수의 분석물 및 이의 유도체 중 제1 분획은 제1 이동상에 의해 용리되고, 상기 제1 이동상은 물 및 0.1% 폼산(v/v)을 포함하며; 상기 복수의 분석물 및 이의 유도체의 제2 분획은 제2 이동상에 의해 용리되고, 상기 제2 이동상은 아세토나이트릴 및 0.1% 폼산(v/v)을 포함하며; 상기 복수의 분석물 및 이의 유도체의 제3 분획은 제3 이동상에 의해 용리되고, 상기 제3 이동상은 1:1(v/v)의 메탄올/물, 200mM 암모늄 아세테이트, 및 폼산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 적어도 3가지 이동상 중 적어도 하나, 또는 상기 제1 이동상, 상기 제2 이동상, 및 상기 제3 이동상 중 적어도 하나는 암모늄, 양성자, 나트륨, 아세테이트, 폼에이트, 프로피오네이트, 포스페이트, 메드로네이트, 우레아, 뷰렛 및 트라이유렛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이온화 부가물을 포함한다. 일부 실시형태에서, (b)는 복수의 분석물 또는 이의 유도체 각각의 질량을 질량 분석법으로 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, (b)는 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체 각각의 양을 질량 분석법으로 결정하는 것을 포함한다. 당업자는 상기 복수의 분석물 또는 유도체 각각의 상기 질량 또는 양이 크로마토그래피 체류 시간, 이온 이동성 충돌 교차부, 상이한 형태에 대한 전구체 및 생성물 이온 질량-대-전하 비율, 이온 부가물의 상태 및 비율, 손실, 다량체, 동위원소 존재도, 전하 상태, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 LC-MS 데이터로부터 식별될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 질량 분석법은 양이온 및 음이온 모드 둘 다에서 동적 배제 유무에 관계없이 데이터-독립적 또는 데이터-종속적 획득에 의해 생성되는 저해상도 또는 고해상도 전체 또는 단편화 스캔 질량 분석법이다. 일부 실시형태에서, 상기 질량 또는 상기 양을 결정하는 것은 상기 저해상도 또는 고해상도 질량 분석 특징을 하나 이상의 참조 질량 전체 또는 스펙트럼과 비교하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 용액은 선택적으로 수혼화성 유기 용매를 포함하는 수용액이다. 일부 실시형태에서, 상기 샘플은 생물학적 샘플이다.
일부 실시형태는 대상체에서 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법을 제공하며, (i) 상기 대상체의 단일 샘플로부터 상기 질환 또는 병태와 연관된 것으로 알려진 복수의 분석물을 개별적으로 또는 종합적으로 식별하여 상기 복수의 분석물 각각에 대한 식별된 양을 얻되, 상기 복수의 분석물은 상이한 유형의 분석물을 포함하는 단계; (ii) 상기 복수의 분석물의 상기 각각에 대한 참조량과 상기 식별된 양 사이의 차이를 결정하여 복수의 상이한 값을 얻는 단계; 및 (iii) 훈련된 기계 학습 알고리즘을 사용하여 상기 복수의 차이값을 기반으로 하여 상기 질환 또는 병태를 결정하는 단계를 포함한다. 당업자는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "참조량"이 일반적으로 대상체가 질환 또는 병태를 가지고 있는지 여부를 결정하는 것을 가능하게 하는 양을 지칭한다. 상기 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 대상체에서 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, (i)은 (a) 상기 복수의 분석물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 상기 단일 샘플에 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체를 포함하는 용액을 산출하기에 충분한 조건을 적용하는 단계; 및 (b) 상기 용액을 사용하여 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체를 식별하여 상기 복수의 분석물을 식별하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 대상체에서 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, (b)는 단일 기기 실행으로 수행될 수 있다. 훈련된 알고리즘은 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 또는 170개의 훈련용 샘플, 또는 임의의 2개 상기 값 사이의 범위를 포함하거나, 약(즉, ±1, ±2, 또는 ±3) 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 또는 170개의 훈련용 샘플, 또는 임의의 2개 상기 값 사이의 범위를 포함하는 복수의 훈련용 샘플을 사용하여 훈련될 수 있다. 훈련된 알고리즘은 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 또는 170개 이하의 훈련용 샘플, 또는 약(즉, ±1, ±2, 또는 ±3) 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 또는 170개 이하의 훈련용 샘플을 포함하는 복수의 훈련용 샘플을 사용하여 훈련될 수 있다. 훈련된 알고리즘은 170개 이하의 훈련용 샘플을 포함하는 복수의 훈련용 샘플을 사용하여 훈련될 수 있다. 훈련된 알고리즘은 30개 이하의 훈련용 샘플을 포함하는 복수의 훈련용 샘플을 사용하여 훈련될 수 있다. 훈련된 알고리즘은 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 또는 170개의 훈련용 샘플, 또는 적어도 약(즉, ±1, ±2, 또는 ±3) 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 또는 170개의 훈련용 샘플을 포함하는 복수의 훈련용 샘플을 사용하여 훈련될 수 있다. 훈련된 알고리즘은 적어도 30개의 훈련용 샘플을 포함하는 복수의 훈련용 샘플을 사용하여 훈련될 수 있다. 훈련된 알고리즘은 적어도 170개의 훈련용 샘플을 포함하는 복수의 훈련용 샘플을 사용하여 훈련될 수 있다. 방법은 (i) 전에, 상기 복수의 훈련용 샘플 각각으로부터 상기 복수의 분석물을 식별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 질환 또는 병태는 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 또는 0.8, 또는 약(즉, ±0.01, ±0.02, 또는 ±0.03), 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 또는 0.8, 또는 임의의 2개 상기 값 사이의 범위의 정확도로 결정될 수 있다. 질환 또는 병태는 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 적어도 약(즉, ±1%, ±2%, ±3%, ±4% 또는 ±5%) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%의 정확도로 결정될 수 있다. 질환 또는 병태는 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 적어도 약(즉, ±1%, ±2%, ±3%, ±4% 또는 ±5%) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%의 특이성으로 결정될 수 있다. 질환 또는 병태는 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 적어도 약(즉, ±1%, ±2%, ±3%, ±4% 또는 ±5%) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%의 감도로 결정될 수 있다. 질환 또는 병태는 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 적어도 약(즉, ±1%, ±2%, ±3%, ±4% 또는 ±5%) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%의 정밀도로 결정될 수 있다. 질환 또는 병태는 노화, 심혈관 질환, 염증, 심부전, 및 치매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 복수의 분석물은 아포지질단백질 B(apoB), 코티솔, C-반응성 단백질(CRP), N-말단 프로 b-형 나트륨이뇨 펩타이드(NT-ProBNP), 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 복수의 분석물은 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 분석물을 포함할 수 있다. 복수의 분석물은 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 3종 이상의 분석물을 포함할 수 있다. 복수의 분석물은 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 4종 모두의 분석물을 포함할 수 있다. 복수의 분석물은 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 및 대사물질을 포함할 수 있다. 복수의 분석물은 폴리펩타이드 및 대사물질을 포함할 수 있다. 복수의 분석물은 단백질, 핵산, 소분자, 지질, 탄수화물, 전해질, 및 금속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3가지 유형의 분석물을 포함할 수 있다. 복수의 분석물은 소분자, 지질, 및 탄수화물로부터 선택되는 적어도 1가지 유형의 분석물; 및 단백질, 핵산, 전해질, 및 금속으로부터 선택되는 적어도 2가지 유형의 분석물을 포함할 수 있다. 복수의 분석물은 단백질, 및 핵산으로부터 선택되는 적어도 1가지 유형의 분석물; 및 소분자, 지질, 및 탄수화물로부터 선택되는 적어도 2가지 유형의 분석물을 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템
본 개시내용은 본 명세서에 개시된 방법을 구현하도록 프로그래밍되거나 달리 구성된 컴퓨터 시스템을 제공한다. 도 17은 질량 분석기로부터의 데이터를 처리하도록 프로그래밍되거나 달리 구성된 컴퓨터 제어 시스템(401)을 나타낸다. 컴퓨터 제어 시스템(401)은, 예를 들어 활력 징후 데이터를 분석하는 방법과 같이, 본 개시내용의 방법의 다양한 양태를 조절할 수 있다. 컴퓨터 제어 시스템(401)은 사용자의 전자 장치 또는 전자 장치와 관련하여 원격으로 위치한 컴퓨터 시스템 상에서 구현될 수 있다. 전자 장치는 모바일 전자 장치일 수 있다.
컴퓨터 시스템(401)은 단일 코어 또는 멀티 코어 프로세서, 또는 병렬 처리를 위한 복수의 프로세서일 수 있는 중앙 처리 장치(CPU, 또한 본 명세서에서 "프로세서" 및 "컴퓨터 프로세서")(405)를 포함한다. 컴퓨터 제어 시스템(401)은 또한 메모리 또는 메모리 위치(410)(예를 들어, 임의 접근 기억 장치, 읽기 전용 기억 장치, 플래시 메모리), 전자 저장 장치(415)(예를 들어, 하드 디스크), 하나 이상의 다른 시스템과 통신하기 위한 통신 인터페이스(420)(예를 들어, 네트워크 어댑터), 및 주변 장치(425), 예컨대, 캐시, 다른 메모리, 데이터 저장 및/또는 전자 디스플레이 어댑터를 포함한다. 메모리(410), 저장 장치(415), 인터페이스(420) 및 주변 장치(425)는 마더보드와 같은 통신 버스(실선)를 통해 CPU(405)와 통신한다. 저장 장치(415)는 데이터를 저장하기 위한 데이터 저장 장치(또는 데이터 저장소)일 수 있다. 컴퓨터 제어 시스템(401)은 통신 인터페이스(420)의 도움으로 컴퓨터 네트워크("네트워크")(430)에 작동적으로 연결될 수 있다. 네트워크(430)는 인터넷, 인터넷 및/또는 엑스트라넷, 또는 인터넷과 통신하는 인트라넷 및/또는 엑스트라넷일 수 있다. 네트워크(430)는 일부 경우에 전기통신 및/또는 데이터 네트워크이다. 네트워크(430)는 하나 이상의 컴퓨터 서버를 포함할 수 있으며, 이는 클라우드 컴퓨팅과 같은 분산 컴퓨팅을 가능하게 할 수 있다. 네트워크(430)는 일부 경우에 컴퓨터 시스템(401)의 도움으로 피어-투-피어 네트워크를 구현할 수 있으며, 이는 컴퓨터 시스템(401)에 연결된 장치가 클라이언트 또는 서버로 동작하는 것을 가능하게 할 수 있다.
CPU(405)는 프로그램 또는 소프트웨어에서 구현될 수 있는 일련의 기계-판독 가능 명령을 실행할 수 있다. 명령은 메모리 위치, 예컨대, 메모리(410)에 저장될 수 있다. 명령은 CPU(405)로 보내질 수 있고, 이는 후속적으로 본 개시내용의 방법을 구현하도록 CPU(405)를 프로그래밍하거나 달리 구성할 수 있다. CPU(405)에 의해 수행되는 작업의 예는 페치, 해독, 실행, 및 라이트백(writeback)을 포함할 수 있다.
CPU(405)는 회로, 예컨대, 집적 회로의 일부일 수 있다. 시스템(401)의 하나 이상의 다른 구성요소가 회로에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 회로는 특정 용도 지향 집적 회로(application specific integrated circuit: ASIC)이다.
저장 장치(415)는 드라이버, 라이브러리 및 저장된 프로그램과 같은 파일을 저장할 수 있다. 저장 장치(415)는 사용자 데이터, 예를 들어 사용자 선호도 및 사용자 프로그램을 저장할 수 있다. 컴퓨터 시스템(401)은 일부 경우에 인트라넷 또는 인터넷을 통해 컴퓨터 시스템(401)과 통신하는 원격 서버에 위치하는 것과 같은, 컴퓨터 시스템(401) 외부에 있는 하나 이상의 추가적인 데이터 저장 장치를 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템(401)은 네트워크(430)를 통해 하나 이상의 원격 컴퓨터 시스템과 통신할 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템(401)은 사용자(예를 들어, 스마트 웨어러블 제품을 제어하는 사용자)의 원격 컴퓨터 시스템과 통신할 수 있다. 원격 컴퓨터 시스템의 예는 퍼스널 컴퓨터(예를 들어, 휴대용 PC), 슬레이트 또는 태블릿 PC(예를 들어, Apple® iPad, Samsung® Galaxy Tab), 전화기, 스마트폰(예를 들어, Apple® iPhone, 안드로이드-지원 장치, Blackberry®), 또는 개인 휴대정보 단말기를 포함한다. 사용자는 네트워크(430)를 통해 컴퓨터 시스템(401)에 접속할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 방법은, 예를 들어 메모리(410) 또는 전자 저장 장치(415)와 같은 컴퓨터 시스템(401)의 전자 저장 위치에 저장된 기계(예를 들어, 컴퓨터 프로세서) 실행 코드에 의해 구현될 수 있다. 기계 실행 또는 기계 판독 가능 코드는 소프트웨어의 형태로 제공될 수 있다. 사용하는 동안, 코드는 프로세서(405)에 의해 실행될 수 있다. 일부 경우에, 코드는 저장 장치(415)에서 검색되고 프로세서(405)에 의한 빠른 접근을 위해 메모리(410)에 저장될 수 있다. 일부 상황에서, 전자 저장 장치(415)는 배제될 수 있고, 기계-실행 가능 명령은 메모리(410)에 저장된다.
코드는 코드를 실행하도록 구성된 프로세서를 가지는 기계와 함께 사용하기 위해 프리-컴파일 및 구성될 수 있거나, 실행 시간 동안 컴파일될 수 있다. 코드는 프리-컴파일되거나 컴파일된 방식 그대로 코드를 실행할 수 있도록 선택될 수 있는 프로그래밍 언어로 공급될 수 있다.
본 명세서에 제공된 시스템 및 방법의 양태, 예컨대, 컴퓨터 시스템(401)은 프로그래밍으로 구현될 수 있다. 기술의 다양한 양태는 전형적으로 기계(또는 프로세서) 실행 코드 및/또는 기계 판독 가능 매체의 유형에서 수행되거나 구현되는 연관된 데이터 형태의 "제품" 또는 "제조품"으로 간주될 수 있다. 기계-실행 코드는 전자 저장 장치, 예컨대, 메모리(예를 들어, 읽기 전용 기억 장치, 임의 접근 기억 장치, 플래시 메모리) 또는 하드 디스크에 저장될 수 있다. "저장" 유형 매체는 컴퓨터, 프로세서 등의 유형 메모리(tangible memory), 또는 이의 연관된 모듈, 예컨대, 다양한 반도체 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 등 중 임의의 것 또는 전부를 포함할 수 있으며, 이는 소프트웨어 프로그래밍을 위해 언제든 비-일시적인 저장소를 제공할 수 있다. 소프트웨어의 전부 또는 일부는 때때로 인터넷 또는 다른 다양한 통신 네트워크를 통해 통신될 수 있다. 이와 같은 통신은, 예를 들어 하나의 컴퓨터 또는 프로세서에서 다른 컴퓨터 또는 프로세서로, 예를 들어 관리 서버 또는 호스트 컴퓨터에서 응용 서버의 컴퓨터 플랫폼으로 소프트웨어의 로딩을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 소프트웨어 요소를 보유할 수 있는 또 다른 유형의 매체는 유선 및 광학 유선 네트워크를 통해 그리고 다양한 에어-링크를 통해, 로컬 장치 간의 물리적 인터페이스 전반에 걸쳐 사용되는 것과 같은 광학, 전기 및 전자기파를 포함한다. 이와 같은 파, 예컨대, 유선 또는 무선 링크, 광회선 등을 전달하는 물리적 요소도 또한 소프트웨어를 보유하는 매체로 간주될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 비일시적, 유형 "저장" 매체로 제한되지 않는 한, 컴퓨터 또는 기계 "판독 가능 매체"와 같은 용어는 일반적으로 실행을 위해 프로세서에 명령을 제공하는 데 참여하는 임의의 매체를 지칭한다.
따라서, 기계 판독 가능 매체, 예컨대, 컴퓨터-실행 코드는 유형 저장 매체, 반송파 매체 또는 물리적 전송 매체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 많은 형태를 취할 수 있다. 비휘발성 저장 매체는, 예를 들어 도면에 나타낸 데이터베이스 등을 구현하는 데 사용될 수 있는 것과 같은 임의의 컴퓨터(들) 등에서 임의의 저장 장치와 같은 광학 또는 자기 디스크를 포함한다. 휘발성 저장 매체는 동적 메모리, 예컨대, 이와 같은 컴퓨터 플랫폼의 주기억 장치를 포함한다. 유형 전송 매체는 컴퓨터 시스템 내에서 버스를 포함하는 전선을 포함하여, 동축 케이블; 동선 및 광섬유를 포함한다. 반송파 전송 매체는 전기 또는 전자기 신호, 또는 무선 주파수(RF) 및 적외선(IR) 데이터 통신 동안 생성되는 것과 같은 음파 또는 광파의 형태를 취할 수 있다. 따라서 일반적인 형태의 컴퓨터-판독 가능 매체는, 예를 들어 플로피 디스크, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 임의의 다른 자기 매체, 즉, CD-ROM, DVD 또는 DVD-ROM, 임의의 기타 광학 매체, 펀치 카드 종이 테이프, 홀(hole) 패턴이 있는 임의의 다른 물리적 저장 매체, 즉, RAM, ROM, PROM 및 EPROM, FLASH-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 데이터 또는 명령을 전송하는 반송파, 이와 같은 반송파를 전송하는 케이블 또는 링크, 또는 컴퓨터가 프로그래밍 코드 및/또는 데이터를 읽을 수 있는 임의의 다른 매체를 포함한다. 컴퓨터 판독 가능 매체의 이러한 형태 중 다수는 실행을 위해 프로세서에 하나 이상의 명령의 하나 이상의 시퀀스를 전달하는 데 관련될 수 있다.
컴퓨터 시스템(401)은, 예를 들어 슬러리를 생성하고/거나 슬러리를 기판에 적용하기 위한 매개변수를 제공하기 위한 사용자 인터페이스(UI)(440)를 포함하는 전자 디스플레이(435)를 포함하거나 이와 통신할 수 있다. UI의 예는 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 및 웹 기반 사용자 인터페이스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시내용의 방법 및 시스템은 하나 이상의 알고리즘에 의해 구현될 수 있다. 알고리즘은 중앙 처리 장치(405)에 의해 실행 시 소프트웨어에 의해 구현될 수 있다. 알고리즘은, 예를 들어 스마트 웨어러블 제품으로부터 데이터를 수집하고, 한정된 기간 동안 데이터의 변화에 대해 데이터를 분석할 수 있다.
실시예
재료 및 방법
샘플 준비
화학적 참조 표준물을 추출 용액에서 1μM 농도로 준비하고 LC-MS에 의해 분석하여 체류 시간 및 특징적인 이온 질량을 확인한다.
대략 100 ㎎의 샘플을 20㎕ 수성 첨가제 및 100㎕ 메탄올에서 균질화하여 혼합물을 50mM 암모늄 바이카보네이트, 5mM EDTA, 트립신(1:20 m/m 트립신:단백질), 및 약 10% 건조 샘플 질량의 최종 농도로 만든다. 샘플 분해 혼합물을 회전하면서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한다. 분해 후, 샘플을 100㎕ 아세토나이트릴 및 100㎕ 아세톤으로 처리하고 4℃에서 15분 동안 평형이 되게 한다. 샘플을 15000 × g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 새로운 바이알로 옮긴 다음 LC-MS 분석을 할 때까지 4℃에서 보관한다.
액체 크로마토그래피
양이온 및 음이온 교환 및 역상 특징을 특성으로 하는 혼합 모드 크로마토그래피(프리칼럼 필터(precolumn filter) 및 보호 칼럼이 장착된 Dionex Trinity P1 2.1㎜×150㎜)를 사용하여 분석물을 분리한다. 용매 프로그래밍은 다음 이동상으로 이루어진 2개의 선형 구배로 구성된다: 이동상 A - 95:5 물:0.1% 폼산 및 5mM 암모늄 아세테이트가 포함된 아세토나이트릴, 이동상 B - 95:5 아세토나이트릴:0.1% 폼산 및 5mM 암모늄 아세테이트가 포함된 물, 및 이동상 C - 50:50 물:200mM 폼산 및 200mM 암모늄 아세테이트가 포함된 메탄올. 5μM의 메드론산을 모든 이동상에 첨가하여 크로마토그래피 및 인산화 화합물의 검출을 개선시킨다. 선형 구배 프로그래밍은 200㎕/분 및 30℃에서 100% A에서 100% B로 그 다음에 100% C로 순방향으로 진행하고 0, 20, 40, 45, 50, 및 60분에 각각 역방향으로 진행한다. 구배 프로그래밍의 전방 부분을 연장함으로써 실행을 확장한다. 분석에 사용되는 기기에 따라 Dionex Ultimate 3000RS UHPLC 또는 Thermo Surveyor HPLC 오토샘플러 및 LC 스택이 이용된다.
질량 분석 검출
용리액을 전자분무 이온화 공급원에 의해 MS, 즉, hermo Q Exactive Plus 또는 Thermo LTQ Orbitrap XL에 도입한다. 분석 전에 표준 양성 및 음성 ESI 보정 용액으로 외부 보정을 수행하였다. 양이온 및 음이온 모드 둘 다에서 MRFA 펩타이드에 대한 감도를 최대화하도록 최적화된 질량 분석기 매개변수를 사용하여 양이온 및 음이온 모드 둘 다에서 동적 배제가 있는 저해상도 또는 고해상도 MS2 데이터-종속적 획득이 있는 고해상도 전체 스캔을 획득하도록 질량 분석기를 설정한다.
효소 분해
효소 및 트립신 원액을 공급자 지침에 의해 지정된 바와 같이 10 ㎎/㎖로 준비한다. 효소 용액(10㎕) 및 트립신 용액(10㎕)을 기질 용액(100㎕)에 첨가하고 회전하면서 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션한다. 기질 또는 효소가 없는 등가 용액을 적절한 경우 음성 대조군으로 대체한다. 유기 용매(200㎕ 1:1 아세토나이트릴:아세톤)를 첨가하여 반응을 정지시킨다.
데이터 분석
화학적 다양성 및 인지된 생물의학적 중요성을 기반으로 하여 선택된, 선택된 화합물을 정량화하는 데 사용되는 Thermo Qual 브라우저를 사용하여 정성적 데이터 분석을 수행하였다. 전체 스캔에 걸쳐 피크 면적을 측정하였고 첨가된 내부 표준물(주입 부피를 조정하기 위함)과 일정한 오염 이온(이온화 효율성을 조정하기 위함)으로 정규화하였다.
원 LC-MS 데이터를 OpenMS로 처리하기 위해 proteowizard를 사용하여 mzML 형식으로 변환하였다. MS/MS 단편화 스펙트럼을 !Tandem 펩타이드 맵핑 알고리즘을 사용하여 인간, 역 유인체(reversed decoy), 및 cRAP 단백질에서 생성된 트립신에 의한 펩타이드 서열과 일치시켰다. 단편화 스펙트럼을 또한 Sirius 어댑터를 사용하여 대사물질과 일치시켰다. 질량 추적 접근법을 사용하여 특성을 식별하였으며 샘플의 20% 초과에서 검출된 경우 유지하였다. R 소프트웨어 환경에서 분석을 위해 탭으로 구분된 텍스트로 특성을 내보냈다. 강도를 log10으로 변환하고 데이터를 펩타이드, 지질, 및 대사물질의 중앙값 강도에 대한 선형 조정에 의해 총량, 분해 및 추출 효율 및 주입된 총량 및 기기 감도에 대해 정규화하였다.
상기 언급한 방법을 사용하여, 인간 혈장에서 검출된 것으로 제시된 선택된 분석물이 도 2에 도시되어 있다. 시간 및 강도 피크 면적은 각각 가로축 및 세로축에 표시되어 있다. 선택된 분석물은 나트륨, 콜레스테롤, 페닐알라닌, 크레아티닌, 프럭토사민(및 이성질체), 트라이글리세라이드 이성질체(52:2), 트립신에 의한 알부민 펩타이드, 및 빌리루빈이다. 도 3은 5개의 복제물에서 5가지의 상이한 혈장 샘플에 걸친 선택된 분석물의 상자 도표를 나타낸다. 각각의 분석물의 명칭은 샘플 중앙값 간의 임의의 차이가 통계적으로 유의한지 여부를 나타내는 크루스칼 왈리스 p-값과 함께 각각의 점 도표 위에 열거되어 있다. 샘플 번호 및 log10-스케일 강도 피크 면적은 각각 가로축 및 세로축에 표시되어 있다. 점은 각각의 샘플의 5중 측정값을 나타내고 수평선은 모든 복제물의 4분위수를 나타낸다.
도 4는 효소 없이 분해되고 기재된 절차에 따라 분석된 마우스 간 호모제네이트로부터 얻은 스펙트럼을 나타낸다. 시간 및 질량-대-전하는 가로축 및 세로축에 표시되어 있으며, 색상의 밝기가 증가할수록 이온 강도가 더 높음을 표시한다. 선택된 분석물 부류의 대략적인 위치는 이전 관찰에 따라 표지되어 있다.
도 5는 RNase A로 분해되고 기재된 절차에 따라 분석된 마우스 간 호모제네이트로부터 얻은 스펙트럼을 나타낸다. 시간 및 질량-대-전하는 가로축 및 세로축에 표시되어 있으며, 색상의 밝기가 증가할수록 이온 강도가 더 높음을 표시한다. 선택된 분석물 부류의 대략적인 위치는 이전 관찰에 따라 표지되어 있다.
도 6은 RNase A 및 트립신으로 분해되고 기재된 절차에 따라 분석된 마우스 간 호모제네이트로부터 얻은 스펙트럼을 나타낸다. 시간 및 질량-대-전하는 가로축 및 세로축에 표시되어 있으며, 색상의 밝기가 증가할수록 이온 강도가 더 높음을 표시한다. 선택된 분석물 부류의 대략적인 위치는 이전 관찰에 따라 표지되어 있다.
도 7은 트립신으로 분해되고 기재된 절차에 따라 분석된 배양된 인간 간암 세포로부터 얻은 스펙트럼을 나타낸다. 시간 및 질량-대-전하는 가로축 및 세로축에 표시되어 있으며, 색상의 밝기가 증가할수록 이온 강도가 더 높음을 표시한다. 선택된 분석물 부류의 대략적인 위치는 이전 관찰에 따라 표지되어 있다.
도 8은 트립신으로 분해되고 기재된 절차에 따라 분석된 인간 혈장으로부터 얻은 스펙트럼을 나타낸다. 시간 및 질량-대-전하는 가로축 및 세로축에 표시되어 있으며, 색상의 밝기가 증가할수록 이온 강도가 더 높음을 표시한다. 선택된 분석물 부류의 대략적인 위치는 이전 관찰에 따라 표지되어 있다.
도 9는 트립신으로 분해되고 옴니-MS 절차에 따라 분석된 소 지방으로부터 얻은 스펙트럼을 나타낸다. 시간 및 질량-대-전하는 가로축 및 세로축에 표시되어 있으며, 색상의 밝기가 증가할수록 이온 강도가 더 높음을 표시한다. 선택된 분석물 부류의 대략적인 위치는 이전 관찰에 따라 표지되어 있다.
도 10은 트립신으로 분해되고 옴니-MS 절차에 따라 분석된 인간 소변으로부터 얻은 스펙트럼을 나타낸다. 시간 및 질량-대-전하는 가로축 및 세로축에 표시되어 있으며, 색상의 밝기가 증가할수록 이온 강도가 더 높음을 표시한다. 선택된 분석물 부류의 대략적인 위치는 이전 관찰에 따라 표지되어 있다.
도 11의 좌측 패널은 대표적인 혈장 샘플 및 복제물에 걸친 이온 빈의 대표적인 쌍별 산점도. 가로축 및 세로축은 이온 빈에서 발견되는 log10 강도 카운트에 해당한다. 우측 패널: 혈장 샘플 및 복제물의 상관관계를 기반으로 하는 계층적 클러스터링. 세로축은 프로파일 간의 상관관계 거리이며, 샘플은 대략적으로 상관관계에 따라 가장 가까운 이웃에 따라 정렬된다.
다중오믹 데이터로부터 알려진 임상 적응증의 식별
상기 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 다중오믹 방법을 사용하여 바이오뱅크 임상 혈장 또는 혈청 샘플로부터 다중오믹 데이터를 얻었다. 얻은 다중오믹 데이터(즉, 도 12b, 도 13b, 도 14b, 도 15b 및 도 16b의 스펙트로그램)를 픽셀 "빈"으로 합산하였으며, 각각은 질량-대-전하 비율 및 검출된 분석물의 체류 시간을 기반으로 하여 검출된 분석물을 나타낸다. 얻은 다중오믹 데이터를 이후 생물정보학, 예컨대, 거짓 발견 비율(FDR)을 이용한 맨해튼 플롯을 사용하여 분석하고 적어도 하나의 임상 지표와의 통계적 연관성(들)을 식별하였다. 선택된 임상 지표는 질환 또는 병태, 예컨대, 연령 또는 노화(도 12a 내지 도 12b), 심혈관 질환 위험(도 13a 내지 도 13b), 심부전(도 14a 내지 도 14b), 염증(도 15a 내지 도 15b), 또는 치매(도 16a 내지 도 16b)와 연관된 것으로 알려졌다. 특히, 맨해튼 플롯(즉, 도 12a, 13a, 14a, 15a 및 16a)을 사용하여 통계적으로 유의한 분석물을 예시하였다.
도 12a, 도 13a, 도 14a, 도 15a 및 도 16a는 각각 단일 샘플 및 각각 연령, 심혈관 질환, 심부전, 염증, 및 치매와 연관된 임상 변수로부터 다양한 다중-오믹으로 검출된 분석물 간의 통계적 연관성을 나타내는 맨해튼 플롯을 예시한다. 통계적 연관 결과를 거짓 발견 비율(FDR) 임계값에서 필터링하였다: < 0.2(빨강색 삼각형), 0.2(포함함) 내지 0.5(녹색 사각형), 및 ≥ 0.5(회색 원).
도 12b, 도 13b, 도 14b, 도 15b 및 도 16b는 각각 대응하는 맨해튼 플롯에서 분석된 혈액 샘플의 다중-오믹 스펙트로그램을 예시한다. 0.3 거짓 발견 비율(FDR) 임계값에 속하는 분석물을 사각형으로 표시하였다.
멀티오믹 데이터를 사용하는 모델 훈련 및 검증
예측 모델, 교차 검증에 의한 신축망 회귀분석 모델(elastic net regression model)(예컨대, 문헌[Zou and Hastie (Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology) 67.2 (2005): 301-320)]에 기재된 것, 이는 전문이 참조에 의해 원용됨)을 사용하여 상기 기재되거나 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 다중오믹 방법을 사용하여 얻은 다중오믹 데이터는 예측 모델을 훈련시키는 데 사용될 수 있음을 입증하였다. 당업자는 다른 기계 학습 알고리즘(예컨대, 선형 회귀(예를 들어, 라쏘 또는 릿지) 또는 서포트 벡터 머신)이 상기 기재된 바 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 다중오믹 방법을 사용하여 얻은 다중오믹 데이터에 의해 훈련될 수 있음을 이해할 것이다. 교차 검증 방법(예컨대, 10배 교차 검증)으로 리브 원 아웃 전략을 구현하였다. 당업자는 하나의 10배 교차 검증 접근법에서, 얻은 다중오믹 데이터가 10개의 하위집합으로 무작위로 분할될 수 있고, 그 중 9개는 훈련에 사용되고 1개는 모든 순열에 대해 테스트하는 데 사용된다는 것을 이해할 것이다. 모델 훈련은 가장 낮은 교차 검증 테스트 세트 오류를 달성하기 위해 하이퍼변수(hyperparameter) 설정을 조정하는 것을 추가로 포함하였다. 그 다음 훈련된 예측 모델을 남아있는 하위세트에 대해 테스트하여 다중오믹 데이터로부터 임상 표지(적응증)를 예측하였다. 앞서 언급한 예측 모델 및 훈련 전략을 사용하여 한 번에 하나의 적응층을 예측하였다.
도 12c는 기계 학습 모델의 자유도를 변화시키면서 리브-원-아웃-교차 검증을 사용하여 연령에 대한 예측 세트의 평균 절대 오차(MAE)를 예시한다. 도 12c의 하단 축은 모델이 접근하는 자유도를 제어하는 신축망 회귀분석 모델의 무단위 매개변수 설정을 표시한다. 도 12c의 상단 축은 예측에 사용된 데이터로부터 선택되는 변수의 수를 표시한다. 도 12c의 좌측 세로축은 상기에서 논의된 바와 같은 10배 교차 검증에 걸쳐 측정된 연령과 비교하여 예측된 연령(년)의 평균 절대 오차를 표시한다.
도 13c는 기계 학습 모델의 자유도를 변화시키면서 ApoB 리브-원-아웃-교차 검증에 대한 예측 세트의 평균 절대 오차(MAE)를 예시한다. 도 13c의 하단 축은 모델이 접근하는 자유도를 제어하는 신축망 회귀분석 모델의 무단위 매개변수 설정을 표시한다. 도 13c의 상단 축은 예측에 사용된 데이터로부터 선택되는 변수의 수를 표시한다. 도 13c의 좌측 세로축은 상기에서 논의된 바와 같은 10배 교차 검증에 걸쳐 측정된 값과 비교하여 예측된 ApoB 수준(㎎/㎗)의 평균 절대 오차를 표시한다.
도 14c는 기계 학습 모델의 자유도를 변화시키면서 리브-원-아웃-교차 검증을 사용하여 N-말단 프로 b-형 나트륨이뇨 펩타이드(NT-ProBNP)에 대한 예측 세트의 평균 절대 오차(MAE)를 예시한다. 도 14c의 하단 축은 모델이 접근하는 자유도를 제어하는 신축망 회귀분석 모델의 무단위 매개변수 설정을 표시한다. 도 14c의 상단 축은 예측에 사용된 데이터로부터 선택되는 변수의 수를 표시한다. 도 14c의 좌측 세로축은 상기에서 논의된 바와 같은 10배 교차 검증에 걸쳐 측정된 값과 비교하여 예측된 NT-ProBNP 수준(pg/㎖)의 평균 절대 오차를 표시한다.
도 15c는 기계 학습 모델의 자유도를 변화시키면서 C-반응성 단백질(CRP) 리브-원-아웃-교차 검증에 대한 예측 세트의 평균 절대 오차(MAE)를 예시한다. 도 15c의 하단 축은 모델이 접근하는 자유도를 제어하는 신축망 회귀분석 모델의 무단위 매개변수 설정을 표시한다. 도 15c의 상단 축은 예측에 사용된 데이터로부터 선택되는 변수의 수를 표시한다. 도 15c의 좌측 세로축은 상기에서 논의된 바와 같은 10배 교차 검증에 걸쳐 측정된 값과 비교하여 예측된 CRP 수준(㎎/ℓ)의 평균 절대 오차를 표시한다.
도 16c는 기계 학습 모델의 자유도를 변화시키면서 리브-원-아웃-교차 검증을 사용하여 대조군에 대한 임상 치매의 분류에 대한 예측 세트의 평균 절대 오차(MAE)를 예시한다. 도 16c의 하단 축은 모델이 접근하는 자유도를 제어하는 신축망 회귀분석 모델의 무단위 매개변수 설정을 표시한다. 도 16c의 상단 축은 예측에 사용된 데이터로부터 선택되는 변수의 수를 표시한다. 도 16c의 좌측 세로축은 10배 교차 검증(예컨대, 상기에서 논의된 것)에 걸쳐 측정된 치매의 평균 절대 오차(이진, 오분류 오류)를 표시한다.
도 12d, 도 13d, 도 14d, 도 15d 및 도 16d는 각각 예측된 임상 바이오마커(본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 사용함) 및 실제 임상 바이오마커를 비교함으로써 예측 정확도를 예시한다. 상관 계수(r)는 도표 위에 도시되어 있으며; 샘플 크기(n)는 도표 아래에 도시되어 있다.
본 발명의 특정 특성이 본 명세서에 예시되고 기재되었지만, 이제 다수의 변형, 대체, 변경, 및 등가물이 당업자에게 일어날 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상에 속하는 이와 같은 모든 변형 및 변경을 포괄하는 것으로 의도됨이 이해되어야 한다.
본 발명의 바람직한 실시형태를 본 명세서에 나타내고 기재하였지만, 이와 같은 실시형태는 단지 예로서 제공되는 것임이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 본 명세서 내에서 제공되는 특정 예에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명은 상기 언급한 명세서를 참조하여 기재되었지만, 본 명세서에서 실시형태의 기재 및 예시는 제한적인 의미로 해석됨을 의미하지 않는다. 수많은 변형, 변경, 및 대체가 이제 본 발명을 벗어나지 않으면서 당업자에게 일어날 것이다. 또한, 본 발명의 모든 양태는 다양한 조건 및 변수에 따라 달라지는 본 명세서에 제시된 특정 묘사, 구성 또는 상대적 비율로 제한되지 않음이 이해될 것이다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 이용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 또한 임의의 이와 같은 대체물, 변형, 변화 또는 균등물을 포괄하는 것으로 고려된다. 하기 청구범위는 본 발명의 범주를 한정하고 이들 청구범위 및 이의 균등물의 범주 내의 방법 및 구조는 이에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims (100)

  1. 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법으로서,
    a. 샘플을 상기 샘플 중 생체고분자를 변성시키는 변성 시약 또는 처리로 처리하여 변성된 샘플을 형성하는 단계로서, 상기 변성 시약 또는 처리는 첨가될 때 표준화 시약의 성분을 변성시키지 않는, 상기 변성된 샘플을 형성하는 단계;
    b. 상기 변성된 샘플을 표준화 시약으로 처리하는 단계로서, 상기 표준화 시약은 상기 변성된 샘플 중 다중 분석물을 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종으로 전환시키고, 상기 종은 다중 모드의 크로마토그래피에 의해 분리되고 질량 분석법에 의해 개별적으로 식별 가능함으로써 표준화된 샘플을 형성하는, 상기 처리하는 단계;
    c. 상기 표준화된 샘플을 추출 시약으로 처리하고 내부에 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 보유하여 추출된 샘플을 형성하는 단계;
    d. 상기 추출된 샘플에 다중 모드의 크로마토그래피를 적용한 다음 질량 분석법(MS)을 적용하여, 내부에 존재하는 각각의 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종에 대한 데이터를 생성하는 단계; 및
    e. 상기 데이터로부터 상기 추출된 샘플에 존재하는 상기 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 컴퓨터로 결정하는 단계
    를 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분석물은 단백질, 탄수화물, 핵산, 지질, 전해질, 금속, 소분자, 휘발성 화합물, 외인성 화학물질, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 샘플은 생물학적 샘플인, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 (a) 전에 또는 동안에, 상기 샘플은 균질화되는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 변성 시약 또는 처리는 하나 이상의 용매, 하나 이상의 카오트로픽제, 열, 압력, 방사선조사, 하나 이상의 참조 표준물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 변성 시약 또는 처리는 금속-킬레이트제를 추가로 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 변성 단계 및 상기 변성된 샘플을 표준화 시약으로 처리하는 것은 실질적으로 동시에 수행되는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 표준화 시약은 췌장 내용해 효소를 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 표준화 시약은 하나 이상의 프로테이나제, 하나 이상의 뉴클레아제, 하나 이상의 글리코시다제, 하나 이상의 리파제, 하나 이상의 킬레이트제, 하나 이상의 완충제, 하나 이상의 환원제, 하나 이상의 유도체화제, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 표준화 시약은 트립신, 리보뉴클레아제 A, EDTA, 암모늄 바이카보네이트 또는 아밀라제를 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 표준화 시약은 DNase I을 포함하는 경우, EDTA는 동시에 존재하지 않는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 다중 모드의 크로마토그래피는 역상 분리, 양이온 교환 분리, 음이온 교환 분리, 이온쌍 분리, 정상 분리, 이온 이동성 분리, 크기-배제 분리, 키랄 분리, 친화성 분리, 리간드 교환 분리, 극성 비이온성 분리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 크로마토그래피에 사용되는 이동상은 암모늄, 양성자, 나트륨, 아세테이트, 폼에이트, 프로피오네이트, 포스페이트, 메드로네이트, 우레아, 뷰렛, 트라이유렛, 또는 이들의 임의의 조합물로부터 선택되는 하나 이상의 이온화 부가물을 추가로 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 질량 분석법에 의한 데이터 획득은 양이온 및 음이온 모드 둘 다에서 동적 배제가 있는 저해상도 또는 고해상도 MS2 데이터-독립적 또는 데이터-종속적 획득이 있는 고해상도 전체 스캔을 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 데이터로부터 상기 추출된 샘플에 존재하는 상기 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 컴퓨터로 결정하는 것은 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편 종의 데이터를 기지의 분석물의 기지량으로부터 생성된 종의 질량 분석과 비교하는 것을 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 방법.
  16. 생물학적 샘플이 유래된 살아있는 공급원의 병리학적 병태를 결정하기 위한 방법으로서,
    a. 제1항에 따라서 생물학적 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하는 단계;
    b. 내부 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 상기 병리가 없는 살아있는 공급원 샘플 유래의 생물학적 샘플과 비교하는 단계로서, 상기 병리학적 병태는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양의 변화로부터 식별 가능한 것인, 상기 비교하는 단계; 및
    c. 상기 살아있는 공급원의 병리학적 병태를 결정하는 단계
    를 포함하는, 살아있는 공급원의 병리학적 병태를 결정하기 위한 방법.
  17. 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비로서,
    a. 샘플 중 생체고분자를 변성시켜 변성된 샘플을 형성하기 위한 수단으로서, 상기 변성은 첨가될 때 표준화 시약의 성분을 변성시키지 않는, 상기 변성된 샘플을 형성하기 위한 수단;
    b. 상기 샘플을 표준화시키기 위한 수단으로서, 상기 변성된 샘플 중 다중 분석물은 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종으로 전환되고, 상기 종은 다중 모드의 크로마토그래피에 의해 분리되고 질량 분석법에 의해 개별적으로 식별 가능한, 상기 샘플을 표준화시키기 위한 수단;
    c. 표준화된 샘플을 추출하고 내부에 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 보유하기 위한 수단;
    d. 추출된 샘플에 다중 모드의 크로마토그래피를 적용한 다음 질량 분석법을 적용하여, 내부에 존재하는 각각의 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종에 대한 데이터를 생성하기 위한 수단; 및
    e. 상기 데이터로부터 상기 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 컴퓨터로 결정하기 위한 수단
    을 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비.
  18. 제17항에 있어서, 상기 분석물은 단백질, 탄수화물, 핵산, 지질, 전해질, 금속, 소분자, 휘발성 화합물, 외인성 화학물질, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 샘플은 생물학적 샘플인, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비.
  20. 제17항에 있어서, 상기 샘플을 균질화하기 위한 수단은 단계 (a) 전 또는 동안에 제공되는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비.
  21. 제17항에 있어서, 상기 샘플 중 생체고분자를 변성시키기 위한 수단은 하나 이상의 용매, 하나 이상의 카오트로픽제, 열, 압력, 방사선조사, 하나 이상의 참조 표준물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 변성 시약 또는 처리를 사용하는 것을 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비.
  22. 제17항에 있어서, 상기 변성은 금속 킬레이트화를 추가로 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비.
  23. 제17항에 있어서, 상기 변성 및 표준화는 실질적으로 동시에 수행되는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비.
  24. 제17항에 있어서, 상기 표준화 시약은 췌장 내용해 효소를 포함하는, 장비.
  25. 제17항에 있어서, 상기 표준화 시약은 하나 이상의 프로테이나제, 하나 이상의 뉴클레아제, 하나 이상의 글리코시다제, 하나 이상의 리파제, 하나 이상의 킬레이트제, 하나 이상의 완충제, 하나 이상의 환원제, 하나 이상의 유도체화제, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비.
  26. 제25항에 있어서, 상기 표준화 시약은 트립신, 리보뉴클레아제 A, EDTA, 암모늄 바이카보네이트 또는 아밀라제를 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비.
  27. 제25항에 있어서, 상기 표준화 시약은 DNase I을 포함하는 경우, EDTA는 동시에 존재하지 않는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비.
  28. 제25항에 있어서, 상기 프로테이나제는 상기 변성된 샘플에 동시에 또는 상기 변성된 샘플을 표준화 시약의 다른 성분과 인큐베이션한 후에 첨가되는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비.
  29. 제17항에 있어서, 상기 다중 모드의 크로마토그래피를 위한 수단은 역상 분리, 양이온 교환 분리, 음이온 교환 분리, 이온쌍 분리, 정상 분리, 이온 이동성 분리, 크기-배제 분리, 키랄 분리, 친화성 분리, 리간드 교환 분리, 극성 비이온성 분리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비.
  30. 제29항에 있어서, 상기 크로마토그래피에 사용되는 이동상은 암모늄, 양성자, 나트륨, 아세테이트, 폼메이트, 프로피오네이트, 포스페이트, 메드로네이트, 우레아, 뷰렛, 트라이유렛, 또는 이들의 임의의 조합물로부터 선택되는 하나 이상의 이온화 부가물을 추가로 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비.
  31. 제17항에 있어서, 상기 질량 분석법에 의한 데이터 획득은 양이온 및 음이온 모드 둘 다에서 동적 배제가 있는 저해상도 또는 고해상도 MS2 데이터-독립적 또는 데이터-종속적 획득이 있는 고해상도 전체 스캔을 포함하는, 단일 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 장비.
  32. 제17항에 있어서, 상기 데이터로부터 상기 추출된 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 컴퓨터로 결정하기 위한 수단은 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편 종의 데이터를 기지의 분석물의 기지량으로부터 생성된 종의 질량 분석과 비교하는 것을 포함하는, 장비.
  33. 생물학적 샘플이 유래된 살아있는 공급원의 병태를 결정하기 위한 방법으로서,
    a. 제17항의 장비를 이용하여 생물학적 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하는 단계;
    b. 내부 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 상기 병리가 없는 살아있는 공급원 샘플 유래의 생물학적 샘플과 비교하는 단계로서, 병리학적 병태는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양의 변화로부터 식별 가능한 것인, 상기 비교하는 단계 및
    c. 상기 살아있는 공급원의 병리학적 병태를 결정하는 단계
    를 포함하는, 살아있는 공급원의 병태를 결정하기 위한 방법.
  34. 단일 샘플에 존재하는 화학적으로 관련된 다중 분석물 및 화학적으로 관련되지 않은 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하기 위한 시스템으로서,
    a. 샘플 중 생체고분자를 변성시켜 변성된 샘플을 형성하는 변성 시약 또는 처리로서, 첨가될 때 표준화 시약의 성분을 변성시키지 않는, 상기 변성 시약 또는 처리;
    b. 샘플 중 다중 분석물을 혼합 모드 액체 크로마토그래피에 의해 분리되고 직렬 질량 분석법에 의해 개별적으로 식별 가능한 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편 종으로 전환시키는 표준화 시약;
    c. 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 추출하는 추출 시약;
    d. 내부에 상기 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 보유하여 추출된 샘플을 형성하는 분리 공정;
    e. 상기 가용성 분석물 종 및 분석물 단편 종을 분석하는 다중 모드의 크로마토그래피;
    f. 개별 종에 대한 데이터를 생성하는 질량 분석; 및
    g. 각각의 표준화된 분석물 종 및 표준화된 분석물 단편 종의 데이터로부터 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 수준을 컴퓨터로 결정하기 위한 하나 이상의 알고리즘
    을 포함하는, 시스템.
  35. 제34항에 있어서, 상기 분석물은 단백질, 탄수화물, 핵산, 지질, 전해질, 금속, 소분자, 휘발성 화합물, 외인성 화학물질, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 시스템.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 샘플은 생물학적 샘플인, 시스템.
  37. 제34항에 있어서, 단계 (a) 전 또는 동안에, 상기 샘플은 균질화되는, 시스템.
  38. 제34항에 있어서, 상기 변성 시약 또는 처리는 하나 이상의 용매, 하나 이상의 카오트로픽제, 열, 압력, 방사선조사, 하나 이상의 참조 표준물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 시스템.
  39. 제34항에 있어서, 상기 변성 시약 또는 처리는 금속-킬레이트제를 추가로 포함하는, 시스템.
  40. 제34항에 있어서, 상기 변성 단계 및 변성된 샘플을 표준화 시약으로 처리하는 것은 실질적으로 동시에 수행되는, 시스템.
  41. 제34항에 있어서, 상기 표준화 시약은 췌장 내용해 효소를 포함하는, 시스템.
  42. 제34항에 있어서, 상기 표준화 시약은 하나 이상의 프로테이나제, 하나 이상의 뉴클레아제, 하나 이상의 글리코시다제, 하나 이상의 리파제, 하나 이상의 킬레이트제, 하나 이상의 완충제, 하나 이상의 환원제, 하나 이상의 유도체화제, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 시스템.
  43. 제42항에 있어서, 상기 표준화 시약은 트립신, 리보뉴클레아제 A, EDTA, 암모늄 바이카보네이트 또는 아밀라제를 포함하는, 시스템.
  44. 제42항에 있어서, 상기 표준화 시약이 DNase I을 포함하는 경우, EDTA는 동시에 존재하지 않는, 시스템.
  45. 제42항에 있어서, 상기 프로테이나제는 상기 변성된 샘플에 동시에 또는 상기 변성된 샘플을 표준화 시약의 다른 성분과 인큐베이션한 후에 첨가되는, 시스템.
  46. 제34항에 있어서, 상기 다중 모드의 크로마토그래피는 역상 분리, 양이온 교환 분리, 음이온 교환 분리, 이온쌍 분리, 정상 분리, 이온 이동성 분리, 크기-배제 분리, 키랄 분리, 친화성 분리, 리간드 교환 분리, 극성 비이온성 분리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 시스템.
  47. 제46항에 있어서, 상기 크로마토그래피에 사용되는 이동상은 암모늄, 양성자, 나트륨, 아세테이트, 폼메이트, 프로피오네이트, 포스페이트, 메드로네이트, 우레아, 뷰렛, 트라이유렛, 또는 이들의 임의의 조합물로부터 선택되는 하나 이상의 이온화 부가물을 추가로 포함하는, 시스템.
  48. 제34항에 있어서, 상기 질량 분석법에 의한 데이터 획득은 양이온 및 음이온 모드 둘 다에서 동적 배제가 있는 저해상도 또는 고해상도 MS2 데이터-독립적 또는 데이터-종속적 획득이 있는 고해상도 전체 스캔을 포함하는, 시스템.
  49. 제34항에 있어서, 상기 데이터로부터 상기 추출된 샘플에 존재하는 상기 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 컴퓨터로 결정하는 것은 상기 표준화된 분석물 종 또는 표준화된 분석물 단편 종의 데이터를 기지의 분석물의 기지량으로부터 생성된 종의 질량 분석과 비교하는 것을 포함하는, 시스템.
  50. 생물학적 샘플이 유래된 살아있는 공급원의 병리학적 병태를 결정하기 위한 방법으로서,
    a. 제34항의 시스템을 이용하여 생물학적 샘플에 존재하는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 실질적으로 동시에 결정하는 단계;
    b. 내부 분석물의 존재, 정체성 또는 양을 상기 병리가 없는 살아있는 공급원 샘플 유래의 생물학적 샘플과 비교하는 단계로서, 상기 병리학적 병태는 다중 분석물의 존재, 정체성 또는 양의 변화로부터 식별 가능한 것인, 상기 비교하는 단계; 및
    c. 상기 살아있는 공급원의 병리학적 병태를 결정하는 단계
    를 포함하는, 살아있는 공급원의 병리학적 병태를 결정하기 위한 방법.
  51. 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법으로서,
    (a) 상기 상이한 유형의 복수의 분석물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 상기 샘플에 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체를 포함하는 용액을 산출하기에 충분한 조건을 적용하는 단계; 및
    (b) 기기를 사용하여 상기 용액을 처리하여 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체를 식별하여 상기 복수의 분석물을 식별하는 단계로서, 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체가 상기 기기의 단일 실행에서 식별되는, 상기 복수의 분석물을 식별하는 단계
    를 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 복수의 분석물은 단백질, 핵산, 소분자, 지질, 탄수화물, 전해질, 및 금속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분석물 중 적어도 3가지 유형을 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 복수의 분석물은
    소분자, 지질, 및 탄수화물로부터 선택되는 분석물 중 적어도 1가지 유형; 및
    단백질, 핵산, 전해질, 및 금속으로부터 선택되는 분석물 중 적어도 2가지 유형
    을 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  54. 제52항에 있어서, 상기 복수의 분석물은
    단백질, 및 핵산으로부터 선택되는 분석물 중 적어도 1가지 유형; 및
    소분자, 지질, 및 탄수화물로부터 선택되는 분석물 중 적어도 2가지 유형
    을 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  55. 제51항에 있어서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 상기 복수의 분석물과 상이한 분자 크기 또는 질량 분포를 가지는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  56. 제51항에 있어서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 상기 복수의 분석물과 상이한 하전된 분자의 양, 친수성 분자의 양, 소수성 작용기를 갖는 분자의 양, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  57. 제51항에 있어서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 미리 결정된 범위 내에 속하는 분자의 질량 백분율이 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 상기 복수의 분석물보다 더 큰, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  58. 제51항에 있어서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 상기 복수의 분석물보다 더 좁은 분자 크기 또는 질량 분포를 가지는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  59. 제51항에 있어서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 하전된 분자의 질량 백분율이 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 상기 복수의 분석물보다 더 큰, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  60. 제51항에 있어서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 옥탄올-물 분배 계수에 의해 측정된 친수성 분자의 질량 백분율이 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 상기 복수의 분석물보다 더 큰, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  61. 제51항에 있어서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 상기 복수의 분석물보다 더 좁은 질량-대-전하 비(m/z)의 분포를 가져서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체는 질량 분석에 의해 검출 가능한 범위 내에 속하는 분자의 질량 백분율이 상기 샘플에 포함되거나 포함되는 것으로 의심되는 상기 복수의 분석물보다 더 큰, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 질량 분석법에 의해 검출 가능한 범위는 전자 전하 당 100 달톤(Da/e) 내지 2,000 Da/e인, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  63. 제61항에 있어서, 상기 용액 중 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체 각각은 질량-대-전하 비(m/z)가 전자 전하 당 15 달톤(Da/e) 내지 4,000 Da/e인, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  64. 제51항에 있어서, (a)는 처리된 샘플을 얻기 위해 다음 중 하나 또는 임의의 조합을 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법:
    (i) 상기 샘플을 균질화하는 것;
    (ii) 상기 샘플을 변성제와 접촉시켜 상기 복수의 분석물 중 적어도 하나의 형태를 변화시키는 것;
    (iii) 상기 샘플을 킬레이트제와 접촉시켜 상기 복수의 분석물 중 적어도 하나와 킬레이트 착물을 형성하는 것;
    (iv) 상기 샘플을 유도체화제와 접촉시켜 상기 복수의 분석물 중 적어도 하나의 유도체를 형성하는 것;
    (v) 상기 샘플을 환원제와 접촉시켜 상기 복수의 분석물 중 적어도 하나를 변형시키는 것; 및
    (vi) 상기 샘플을 효소와 접촉시켜 상기 복수의 분석물 중 적어도 하나의 단편을 생성하는 것.
  65. 제64항에 있어서, (iii)은 1회 이상 수행되는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  66. 제64항에 있어서, (vi)은 1회 이상 수행되는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  67. 제64항에 있어서, (i)은 (ii) 전에 또는 실질적으로 동시에 수행되는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  68. 제64항에 있어서, (ii)는 (iii)과 실질적으로 동시에 수행되는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  69. 제64항에 있어서, (ii)는 (vi) 전에 또는 이와 실질적으로 동시에 수행되는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  70. 제64항에 있어서, (vi)은 (iii), (iv), 및 (v) 중 하나 이상과 실질적으로 동시에 수행되는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  71. 제70항에 있어서, (vi)은 (iv)와 실질적으로 동시에 수행되는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  72. 제71항에 있어서, (vi)은 (iii) 및 (iv)와 실질적으로 동시에 수행되는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  73. 제64항에 있어서, (iii)은 (i)과 실질적으로 동시에 1회, 그리고 (vi)과 실질적으로 동시에 다시, 적어도 2회 수행되는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  74. 제64항에 있어서, (vi)은 (ii)와 실질적으로 동시에 1회, 그리고 (iv)와 실질적으로 동시에 다시, 적어도 2회 수행되는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  75. 제64항에 있어서, (i)은 1:5 내지 5:1의 부피비인 물과 메탄올의 혼합물에서 수행되는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  76. 제64항에 있어서, 상기 변성제는 용매, 카오트로픽제, 및 참조 표준물을 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  77. 제64항에 있어서, 상기 유도체화제는 펩타이드-알킬화제인, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 유도체화제는 오오도아세트아마이드인, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  79. 제64항에 있어서, 상기 효소는 (vi)의 각각의 경우에 독립적으로, 뉴클레아제, 프로테아제, 글리코시다제, 및 리파제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 임의의 조합물을 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 DNase I 및 리보뉴클레아제 A 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  81. 제80항에 있어서, DNase I 및 EDTA는 (vi)에 동시에 존재하지 않는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  82. 제64항에 있어서, (a)는 상기 처리된 샘플로부터 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체를 추출 시약으로 추출하여 상기 용액을 얻는 것을 추가로 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  83. 제51항에 있어서, (b)는 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체에 전자빔을 적용하여 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체 중 적어도 하나의, 적어도 하나의 이온화된 형태 또는 단편을 생성하는 단계를 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  84. 제51항에 있어서, (b)는 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체를, 적어도 3개의 직교 크로마토그래피 모드를 포함하는 혼합 모드 크로마토그래피 매트릭스와 접촉시키는 것을 추가로 포함하되, 상기 적어도 3개의 직교 크로마토그래피 모드 각각은 상기 용액으로부터 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체의 주어진 유형을 분리하도록 구성되는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 혼합 모드 크로마토그래피 매트릭스는 양이온 교환 특성, 음이온 교환 특성, 이온 배제 특성, 리간드 교환 특성, 크기 배제 특성, 키랄 특성, 역상 특성, 친화성 특성, 친수성 특성, 다배위자(polydentate) 특성, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3가지 특성을 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  86. 제84항에 있어서, (b)는 상기 복수의 분석물 및 이의 유도체를 적어도 3가지 이동상으로 용리시키는 것을 추가로 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 적어도 3가지 이동상 중 적어도 하나, 또는 상기 제1 이동상, 상기 제2 이동상, 및 상기 제3 이동상 중 적어도 하나는 암모늄, 양성자, 나트륨, 아세테이트, 폼메이트, 프로피오네이트, 포스페이트, 메드로네이트, 우레아, 뷰렛 및 트라이유렛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이온화 부가물을 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  88. 제51항에 있어서, (b)는 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체 각각의 질량을 질량 분석법으로 결정하는 것을 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  89. 제51항에 있어서, (b)는 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체 각각의 양을 질량 분석법으로 결정하는 것을 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 질량 분석법은 양이온 및 음이온 모드 둘 다에서 동적 배제 유무에 관계없이 데이터-독립적 또는 데이터-종속적 획득에 의해 생성되는 저해상도 또는 고해상도 전체 또는 단편화 스캔 질량 분석법인, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 질량 또는 상기 양을 상기 결정하는 것은 저해상도 또는 고해상도 질량 분석 특징을 하나 이상의 참조 질량 전체 또는 스펙트럼과 비교하는 것을 포함하는, 샘플로부터 상이한 유형의 복수의 분석물을 식별하기 위한 방법.
  92. 대상체에서 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법으로서,
    (i) 상기 대상체의 단일 샘플로부터 상기 질환 또는 병태와 연관된 것으로 알려진 복수의 분석물을 개별적으로 또는 종합적으로 식별하여 상기 복수의 분석물 각각에 대한 식별된 양을 얻는 단계로서, 상기 복수의 분석물은 상이한 유형의 분석물을 포함하는, 상기 상기 복수의 분석물 각각에 대한 식별된 양을 얻는 단계;
    (ii) 상기 복수의 분석물 상기 각각에 대한 참조량과 상기 식별된 양 사이의 차이를 결정하여 복수의 상이한 값을 얻는 단계; 및
    (iii) 훈련된 기계 학습 알고리즘을 사용하여 상기 복수의 차이값을 기반으로 하여 상기 질환 또는 병태를 결정하는 단계
    를 포함하는, 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법.
  93. 제92항에 있어서, (i)은
    (a) 상기 복수의 분석물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 상기 단일 샘플에 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체를 포함하는 용액을 산출하기에 충분한 조건을 적용하는 것; 및
    (b) 상기 복수의 분석물 또는 이의 유도체를 식별하는 데 상기 용액을 사용하여 상기 복수의 분석물을 식별하는 것
    을 포함하는, 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법.
  94. 제92항에 있어서, 상기 훈련된 기계 학습 알고리즘은 170개 이하의 훈련용 샘플을 포함하는 복수의 훈련용 샘플을 사용하여 훈련되는, 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법.
  95. 제92항에 있어서, 상기 훈련된 알고리즘은 30개 이하의 훈련용 샘플을 포함하는 복수의 훈련용 샘플을 사용하여 훈련되는, 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법.
  96. 제92항에 있어서, (i) 전에, 상기 복수의 훈련용 샘플 각각으로부터 상기 복수의 분석물을 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법.
  97. 제92항에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 적어도 80%의 정확도로 결정되는, 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법.
  98. 제92항에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 노화, 심혈관 질환, 염증, 심부전, 및 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는, 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법.
  99. 제92항에 있어서, 상기 복수의 분석물은 아포지질단백질 B(apoB), 코티솔, C-반응성 단백질(CRP), N-말단 프로 b-형 나트륨이뇨 펩타이드(N-terminal pro b-type natriuretic peptide: NT-ProBNP), 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분석물을 포함하는, 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법.
  100. 제92항에 있어서, 상기 복수의 분석물은 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 대사물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 분석물을 포함하는, 질환 또는 병태를 결정하기 위한 방법.
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