CN103575894A - 一种可视化生物芯片的检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种可视化生物芯片的检测方法，包括以下步骤：将待测物的抗原或抗体或受体和有色偶联物或有色蛋白在PBS缓冲溶液中混合，点样于载体片基的反应区内，再用小牛血清封闭载体基片上没有结合点样物的活性基团；在生物芯片的部分反应孔内分别加入含有不同浓度梯度的检测目标物的混合标准溶液，在剩余反应孔内分别加入待测物溶液，继续向所有反应孔中依次加入检测目标物所对应的单克隆抗体和标记的羊抗鼠IgG，于水浴中反应，洗涤液洗涤；所有反应孔内继续加入显色剂，显色反应；反应后终点颜色的深浅可目视定性判断样品中待测物的含量或者使用仪器定量计算待测物溶液中检测目标物的含量。

Description

一种可视化生物芯片的检测方法
技术领域
本发明涉及一种生物芯片检测方法，尤其涉及一种便于直观判断芯片的质量、可视化检测待测样品中多指标的生物芯片的检测方法。
背景技术
现有的生物芯片是指包被在固定载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微阵列。利用生物大分子具有特异相互识别的能力而将他们有序的排列在固相载体基片（孔板、膜、玻璃片，高聚物载体等）上，与检测样品和标记的生物分子同时反应或杂交，经过自动阅读设备可获得大量有用的生物信息。目前生物芯片检测方法主要有荧光法，化学发光法、催化显色法等。由于荧光法和化学发光法等检测设备价格昂贵，不利于在食品安全检测领域推广。利用纳米材料或者生物酶催化其相应底物显色，根据反应后终点颜色的深浅可以目视定性判断样品中待测物的含量，也可以通过仪器测得灰度值，通过计算灰度值得出样品中待测组分的含量，大大降低检测成本。同时，传统的生物芯片在检测样品之前，芯片产品都是无色的，无法直观判断芯片的质量，如有无漏点等。所以在芯片上加上有色的点样物可以作为产品质控，便于直接观测。
发明内容
针对以上问题本发明提供了一种便于直观判断芯片的质量、可视化检测待测样品中多指标生物芯片的检测方法。
为了解决以上问题本发明提供了一种可视化的生物芯片，由载体基片及载体基片上的点样物组成，点样物包括待测物的抗原或抗体或受体和有色偶联物或有色蛋白，两者在PBS缓冲溶液中混合；所述的有色偶联物是将有色化合物和蛋白质以共价键形式偶联。
所述的有色蛋白包括血红蛋白，荧光蛋白，血蓝蛋白；
所述的有色化合物包括食用色素或有色染料；
所述的蛋白质为亲水性蛋白；
所述的PBS缓冲液的配制：用137 mmol/L氯化钠、2.7 mmol/L氯化钾、10 mmol/L磷酸二氢钠、2 mmol/L磷酸二氢钾配制pH 7.4的PBS缓冲液。
所述的蛋白质包括牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）、人血清白蛋白（HSA）、兔血清白蛋白（RSA）、钥孔血蓝蛋白（KLH）以及多聚赖氨酸（PLL）。
所述的偶联方法包括以下几种：含羧基的化合物可用包括碳二亚胺法、混合酸酐法、N -羟基丁二酰亚胺活性酯法的方法；含氨基的化合物可用包括戊二醛法、卤代硝基苯法、二异氰酸酯法、重氮化法的方法；含羟基的化合物可用包括琥珀酸酐法、光气法、卤代羧酸法的方法；含有巯基、醛、酮结构的化合物均可利用相应的双功能团试剂与蛋白偶联的方法。
所述的载体片基为透明的多孔板、高聚物片基、膜、玻片；
所述的多孔板包括24孔板，48孔板，96孔板，384孔板。
取上述点样物于载体片基的反应区内，再用小牛血清封闭载体基片上没有结合点样物的活性基团。
一种可视化生物芯片的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在上述生物芯片的部分反应孔内分别加入含有不同浓度梯度的检测目标物的混合标准溶液，在剩余反应孔内分别加入待测物溶液，继续向所有反应孔中依次加入检测目标物所对应的单克隆抗体和标记的羊抗鼠IgG，于20~37℃水浴中反应10~20min，洗涤液洗涤；
(2) 所有反应孔内继续加入显色剂，显色反应2~5min后，终止反应；
(3) 反应后终点颜色的深浅可以目视定性判断样品中待测物的含量或者使用仪器进行图像采集，根据检测目标物的灰度值以及标准溶液的浓度对数制作标准曲线，采用外标曲线法定量，分别计算待测物溶液中检测目标物的含量。
所述的羊抗鼠IgG为纳米材料或者生物酶标记，所述的显色剂为生物催化剂及其底物或者化学催化剂及其底物；所述的洗涤液为盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液。
所述的待测物为临床样品或动物源性食品，包括血样、牛奶、奶粉、奶酪、饲料、尿液、动物组织、血清、蜂蜜、蜂皇浆、鸡蛋和水产品。
所述点样物的颜色在检测前后发生变化，检测前为有色偶联物或者有色蛋白呈现的颜色；反应后利用纳米材料或者生物酶催化相应底物显色，呈现另一种颜色；反应后终点颜色的深浅可以目视定性判断样品中待测物的含量，也可以通过仪器测得灰度值，通过计算灰度值得出样品中待测组分的含量。
所述的待测样品溶液的制备方法为：当待测样品为液体时，取50μL~1mL于10mL EP管中，用缓冲液稀释10~100倍即得待测样品溶液；当待测样品为固体时，取粉碎样品5 g，加入8 mL缓冲液，混合2~5 min，置50 ℃水浴下放置10~30 min，离心5~10 min，取50 μL 上清液，加入450 μL缓冲液混匀，取50 μL ~500μL即得待测样品溶液。
有益的效果：
本发明提供一种可视化生物芯片的检测方法，基于一种有颜色点构成的生物芯片，便于直观判断芯片的质量，如有无漏点等。利用上述芯片可同时可视化检测待测样品中的多指标，满足对临床样品和动物源性食品中多指标同时进行快速定量检测的要求，生物芯片制备工艺简单、具有多靶标、成本低、灵敏度高、检测时间短和操作简单易行等特点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
一种可视化的生物芯片，由载体基片及载体基片上的点样物组成，点样物包括待测物的抗原或抗体或受体和有色偶联物或有色蛋白，两者在PBS缓冲溶液中混合；所述的有色偶联物是将有色化合物和蛋白质以共价键形式偶联。
所述的有色蛋白包括血红蛋白，荧光蛋白，血蓝蛋白等；
所述的有色化合物包括食用色素或有色染料有色化合物；
所述的蛋白质包括牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）、人血清白蛋白（HSA）、兔血清白蛋白（RSA）、钥孔血蓝蛋白（KLH）以及多聚赖氨酸（PLL）等亲水性物质。
所述的PBS缓冲液的配制：用137 mmol/L氯化钠、2.7 mmol/L氯化钾、10 mmol/L磷酸二氢钠、2 mmol/L磷酸二氢钾配制pH 7.4的PBS缓冲液。
所述的偶联方法包括以下几种：含羧基的化合物可用包括碳二亚胺法、混合酸酐法、N -羟基丁二酰亚胺活性酯法的方法；含氨基的化合物可用包括戊二醛法、卤代硝基苯法、二异氰酸酯法、重氮化法的方法；含羟基的化合物可用包括琥珀酸酐法、光气法、卤代羧酸法的方法；含有巯基、醛、酮结构的化合物均可利用相应的双功能团试剂与蛋白偶联的方法。
所述的载体片基为透明的多孔板、高聚物片基、膜、玻片；
所述的多孔板包括24孔板，48孔板，96孔板，384孔板。
取上述点样物于载体片基的反应区内，再用小牛血清封闭载体基片上没有结合点样物的活性基团。
一种可视化生物芯片的检测方法，包括以下步骤：
(1)在上述生物芯片的部分反应孔内分别加入含有不同浓度梯度的检测目标物的混合标准溶液，在剩余反应孔内分别加入待测物溶液，继续向所有反应孔中依次加入检测目标物所对应的单克隆抗体和标记的羊抗鼠IgG，于20~37℃水浴中反应10~20min，洗涤液洗涤；
(2) 所有反应孔内继续加入显色剂，显色反应2~5min后，终止反应；
(3) 反应后终点颜色的深浅可以目视定性判断样品中待测物的含量或者使用仪器进行图像采集，根据检测目标物的灰度值以及标准溶液的浓度对数制作标准曲线，采用外标曲线法定量，分别计算待测物溶液中检测目标物的含量。
所述的羊抗鼠IgG为纳米材料或者生物酶标记，所述的显色剂为生物催化剂及其底物或者化学催化剂及其底物；所述的洗涤液为盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液。
所述的待测物为临床样品或动物源性食品，包括血样、牛奶、奶粉、奶酪、饲料、尿液、动物组织、血清、蜂蜜、蜂皇浆、鸡蛋和水产品。
所述点样物的颜色在检测前后发生变化，检测前为有色偶联物或者有色蛋白呈现的颜色；反应后利用纳米材料或者生物酶催化相应底物显色，呈现另一种颜色；反应后终点颜色的深浅可以目视定性判断样品中待测物的含量，也可以通过仪器测得灰度值，通过计算灰度值得出样品中待测组分的含量。
所述的待测样品溶液的制备方法为：当待测样品为液体时，取50μL~1mL于10mL EP管中，用缓冲液稀释10~100倍即得待测样品溶液；当待测样品为固体时，取粉碎样品5 g，加入8 mL缓冲液，混合2~5 min，置50 ℃水浴下放置10~30 min，离心5~10 min，取50 μL 上清液，加入450 μL缓冲液混匀，取50 μL ~500μL即得待测样品溶液。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不限制于本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。

Claims (10)

1.一种可视化生物芯片的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 制作生物芯片：将待测物的抗原或抗体或受体和有色偶联物或有色蛋白在PBS缓冲溶液中混合，点样于载体片基的反应区内，再用小牛血清封闭载体基片上没有结合点样物的活性基团；
(2)在上述生物芯片的部分反应孔内分别加入含有不同浓度梯度的检测目标物的混合标准溶液，在剩余反应孔内分别加入待测物溶液，继续向所有反应孔中依次加入检测目标物所对应的单克隆抗体和标记的羊抗鼠IgG，于20~37℃水浴中反应10~20min，洗涤液洗涤；
(3) 所有反应孔内继续加入显色剂，显色反应2~5min后，终止反应；
(4) 反应后终点颜色的深浅可以目视定性判断样品中待测物的含量或者使用仪器进行图像采集，根据检测目标物的灰度值以及标准溶液的浓度对数制作标准曲线，采用外标曲线法定量，分别计算待测物溶液中检测目标物的含量。
2.根据权利要求1所述的一种可视化生物芯片的检测方法，其特征在于：所述的有色蛋白包括血红蛋白，荧光蛋白，血蓝蛋白；
所述的有色偶联物其偶联方法是将有色化合物和蛋白质以共价键形式偶联；
所述的有色化合物包括食用色素或有色染料等有色化合物；
所述的蛋白质为亲水蛋白；
所述的PBS缓冲液的配制：用137 mmol/L氯化钠、2.7 mmol/L氯化钾、10 mmol/L磷酸二氢钠、2 mmol/L磷酸二氢钾配制pH 7.4的PBS缓冲液；
所述的有色蛋白包括血红蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的一种可视化生物芯片的检测方法，其特征在于：所述的蛋白质包括牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白以及多聚赖氨酸。
4.根据权利要求2所述的一种可视化生物芯片的检测方法，其特征在于：所述的偶联方法包括以下几种：含羧基的化合物可用包括碳二亚胺法、混合酸酐法、N -羟基丁二酰亚胺活性酯法的方法；含氨基的化合物可用包括戊二醛法、卤代硝基苯法、二异氰酸酯法、重氮化法的方法；含羟基的化合物可用包括琥珀酸酐法、光气法、卤代羧酸法的方法；含有巯基、醛、酮结构的化合物均可利用相应的双功能团试剂与蛋白偶联的方法。
5.根据权利要求1所述的一种可视化生物芯片的检测方法，其特征在于：所述的羊抗鼠IgG为纳米材料或者生物酶标记，所述的显色剂为生物催化剂及其底物或者化学催化剂及其底物；所述的洗涤液为盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液。
6.根据权利要求1所述的一种可视化生物芯片的检测方法，其特征在于：所述的载体片基为透明的多孔板、高聚物片基、膜、玻片。
7.根据权利要求5所述的一种可视化的生物芯片，其特征在于：所述的多孔板包括24孔板，48孔板，96孔板，384孔板。
8.根据权利要求1所述的基于一种可视化生物芯片的检测方法，其特征在于：所述的待测物为临床样品或动物源性食品，包括血样、牛奶、奶粉、奶酪、饲料、尿液、动物组织、血清、蜂蜜、蜂皇浆、鸡蛋和水产品。
9.权利要求1所述的基于一种可视化生物芯片的检测方法，其特征在于：所述点样物的颜色在检测前后发生变化，检测前为有色偶联物或者有色蛋白呈现的颜色；反应后利用纳米材料或者生物酶催化相应底物显色，呈现另一种颜色；反应后终点颜色的深浅可以目视定性判断样品中待测物的含量，也可以通过仪器测得灰度值，通过计算灰度值得出样品中待测组分的含量。
10.根据权利要求1所述的一种可视化生物芯片的检测方法，其特征在于：所述的待测样品溶液的制备方法为：当待测样品为液体时，取50μL~1mL于10mL EP管中，用缓冲液稀释10~100倍即得待测样品溶液；当待测样品为固体时，取粉碎样品5 g，加入8 mL缓冲液，混合2~5 min，置50 ℃水浴下放置10~30 min，离心5~10 min，取50 μL 上清液，加入450 μL缓冲液混匀，取50 μL ~500μL即得待测样品溶液。
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