CN105548576A - 同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白芯片及蛋白芯片检测试剂盒技术领域，具体的说是一种同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片及其试剂盒。目前未发现能同时检测牛乳多种蛋白并对营养价值做出综合评价的蛋白芯片及相关试剂盒的报道。本发明的蛋白芯片包括固相载体和阵列式分布于固相载体上的β-酪蛋白单克隆抗体、乳铁蛋白单克隆抗体和β-乳球蛋白单克隆抗体；所述的单克隆抗体以共价键固定在固相载体的表面；所述的固相载体经醛基化修饰；试剂盒中有蛋白芯片，还有样本稀释液、浓缩洗涤液、标准品混合液、空白对照液、抗体检测液和Cy3荧光标记羊抗兔IgG工作液；本发明还提供了一种同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片的制备方法。

Description

同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片及其试剂盒
技术领域
本发明涉及蛋白芯片及蛋白芯片检测试剂盒技术领域，具体的说是一种
同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片及其试剂盒。更进一步的说是同时检测牛乳中β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白并对三种蛋白营养价值做出综合评价的蛋白芯片，以及相应的蛋白芯片检测试剂盒。
背景技术
2014年颁布的《中国食物与营养发展纲要（2014—2020年）》明确要求到2020年人均每日蛋白质摄入量要求是78克，其中，优质蛋白质比例占45%以上。牛乳蛋白是优质蛋白质，因此《发展纲要（2014—2020年）》对重点发展的奶类产品提出了具体要求：扶持奶源基地建设，强化奶业市场监管，培育乳品消费市场，加强奶业各环节衔接，推进现代奶业建设，同时要求到2020年，全国人均全年消费奶类36公斤。《发展纲要（2014—2020年）》为我国人民在今后一段时间摄入牛乳蛋白提出的要求使得我们在利用牛乳蛋白时必须充分辨别的三个问题——牛乳中各蛋白营养价值是否合理、是否掺假、致敏性蛋白是否被降解，并且要认识到只有在及早检测到这三个问题的前提下，我们才能有效解决好这三个问题，也才能更为充分、有效的利用好牛乳蛋白并使之为我们的健康发挥有效作用。对牛乳中不同种类蛋白质含量的检测，可为牛乳的营养价值、牛乳的真假鉴定及牛乳蛋白质的过敏性问题的解决提供基础技术支持。现有的检测技术多是针对某单一蛋白质的检测，检测方法常以酶联免疫法与高效液相法为主（李景红等．中国乳品工业，2008，36(1 1)，56—59．）（张海英等.食品安全质量检测学报，2012，3（4），295-299），检测成本高，检测效率低，且无法同时高通量的检测牛奶中的多种蛋白质。也有一些可检测牛乳蛋白的专利，如申请号为20091004825.5的专利申请利用ELISA平台，采用竞争法分析，无法准确区分β-酪蛋白与β-乳球蛋白各自含量，仅能测出这两种蛋白的总含量，从而推算乳中全蛋白的总含量，其无法定量的检测出每种蛋白各自的含量；如申请号为201310680080.5的专利申请利用试剂条卡平台，仅可作定性分析，只是检测奶品中是否含有相应蛋白，无法定量分析获得相应蛋白的准确含量，同时未涉及乳铁蛋白的检测，只针对的β-酪蛋白的检测。
蛋白质芯片技术利用免疫学抗原抗体相互作用的原理，可以同时、高通量的检测多种蛋白质，利用这一技术检测牛乳中的多种蛋白，不仅可以提高检测效率，还可以整体化系统化的分析牛乳中各蛋白组成之间的关系。利用免疫学抗原抗体特异性结合的原理在同一个蛋白芯片上完成对多种蛋白的同时检测，最主要的难题就是避免同一抗原与不同抗体间发生交叉反应（也叫非特异性反应）的问题，也就是说，免疫学原理的检测都是基于抗原与抗体间特异性结合而完成的，如果一种抗原不仅与自身的抗体结合，同时还会与其他抗原的抗体结合，那么就存在了非特异性结合。因此，避免同一抗原与不同抗体间的非特异性结合一直是蛋白芯片检测技术中的重要难题。本申请主要利用蛋白质芯片技术与经抗体筛选所得的三种抗原蛋白各自的抗体，建立了能同时对牛乳中的β-酪蛋白、乳铁蛋白与β-乳球蛋白这三种主要蛋白质进行检测的系统，以期为同时解决应用牛乳时必须面对的三个问题：营养价值评价、真假鉴定及过敏性问题提供一种高效快速的检测技术方法；并在完成此目标之后以本申请为技术支撑，为将要展开的利用蛋白质芯片技术对牛乳蛋白组学的研究提供基础依据与技术支撑。经检索，未发现攻克牛乳中β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白三种抗原与不同抗体间发生交叉反应难题的报道，进而也未发现以攻克此难题为基础所建立的能同时定量检测牛乳中β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白并对三种蛋白营养价值做出综合评价的蛋白芯片及相关试剂盒的报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种用于同时检测牛乳中β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白并对三种蛋白营养价值做出综合评价的蛋白芯片。利用该蛋白芯片可同时检测三种与牛乳中各蛋白质营养价值是否合理、牛乳是否掺假、牛乳中致敏蛋白是否完全降解有关的蛋白指标，通过一次检测就可以准确判定牛乳中各蛋白质营养价值是否合理、牛乳是否掺假、牛乳中致敏蛋白是否完全降解的状况，具有检测结果准确、检测速度快，检测效率高，成本低等优点。
本发明另一目的在于提供上述蛋白芯片的制备方法。
本发明第三目的在于提供含有上述用于同时检测牛乳中β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白并对三种蛋白营养价值做出综合评价的蛋白芯片试剂盒。
为了达到上述目的，本发明所提供的技术方案是：一种同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片，包括固相载体和阵列式分布于固相载体上的β-酪蛋白单克隆抗体、乳铁蛋白单克隆抗体和β-乳球蛋白单克隆抗体；其中所述的单克隆抗体以共价键固定在固相载体的表面；所述的固相载体经醛基化修饰。
进一步，所述的固相载体是指经过醛基化修饰的载玻片。
进一步，所述的β-酪蛋白单克隆抗体是小鼠抗β-酪蛋白单克隆抗体（Anti-β-casein, mitochondrial antibody）；所述的乳铁蛋白单克隆抗体是指小鼠抗乳铁蛋白单克隆抗体（Anti-lactoferrin mitochondrial antibody）；所述的β-乳球蛋白单克隆抗体是小鼠抗β-乳球蛋白单克隆抗体（Anti- lactoglobulin mitochondrial Antibody）。
进一步，还包括阳性对照、阴性对照、空白对照；所述的阳性对照、阴性对照分别通过共价键固定于经过醛基化修饰的固相载体表面。
进一步，所述的阳性对照是指兔多克隆抗体—兔IgG；所述的阴性对照是指小牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）；所述的空白对照是指磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）。
上述的一种同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片的制备方法，其步骤为： a、选择醛基化微阵列固相载体，确定点阵的排列方式和点样位置；b、配制点样液，c、用点样针按点阵的排列方式将β-酪蛋白单克隆抗体、乳铁蛋白单克隆抗体、β-乳球蛋白单克隆抗体与阴性对照、阳性对照及空白对照分别以接触式点样方式直接点印于固相载体上；d、37℃保温静置16—20h；e、以5%小牛血清白蛋白溶液封闭1小时，f、用含有1‰吐温 20的磷酸缓冲液洗涤3次，室温晾干，g、抽真空包装，4℃保存。
一种用于检测β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白的蛋白芯片的试剂盒：包括用于检测β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白的蛋白芯片；还包括样本稀释液、浓缩洗涤液、标准品混合液、空白对照液、抗体检测液和Cy3荧光标记羊抗兔IgG工作液。
进一步，所述的样本稀释液是指3%小牛血清白蛋白溶液（BSA）；所述的浓缩洗涤液是指含有1%吐温20的磷酸盐缓冲液（PBST，pH7.4）；所述的空白对照液是指3%小牛血清白蛋白溶液（BSA）；所述的标准品混合液是指以3%小牛血清白蛋白溶液做样本稀释液溶解配制的β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白的混合液；标准品混合液中三种蛋白的浓度分别为：β-酪蛋白为2.5mg/ml，乳铁蛋白2μg/ml，β-乳球蛋白为 2μg/ml。
进一步，所述的抗体检测液是指以3%小牛血清白蛋白溶液做样本稀释液溶解配制的兔抗β-酪蛋白多克隆抗体、兔抗乳铁蛋白多克隆抗体和兔抗β-乳球蛋白多克隆抗体的混合液；所述的混合液中各种兔多克隆抗体的质量体积浓度（μg/ml）分别为：兔抗β-酪蛋白多克隆抗体5μg/ml、兔抗乳铁蛋白多克隆抗体0.36μg/ml、兔抗β-乳球蛋白多克隆抗体0.5μg/ml；所述的Cy3荧光标记羊抗兔IgG工作液是指Cy3标记的羊抗兔IgG与3%小牛血清白蛋白溶液按1：1000稀释成的二抗工作液。
本发明经抗体筛选实验克服了牛乳中β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白三种抗原与不同抗体间发生交叉反应的技术难题，在同一芯片中完成了三种蛋白的检测，具体来说，本发明通过反复抗体筛选实验条件的摸索，找到了每种抗原的特异性抗体，并保证了这种抗体在与其所对应的抗原发生反应的同时不与其他抗原发生非特异性结合。从而实现了在同一个检测条件下，在同一个芯片平台内，对三种蛋白的同时检测。
采用上述技术方案，本发明的技术效果有：
（1）、本发明利用蛋白芯片平台，采用改良双抗体夹心分析法可对同时检测牛乳中β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白并对三种蛋白营养价值做出综合评价的三项指标同时进行检测，与单一指标检测相比，结果准确性大大提高。
（2）本发明特异性强、灵敏度高、检测速度快，检测结果稳定。
（3）本发明可采用多样品微阵列技术，可同时对多份样品同时进行检测，适于对大规模的筛查检测。
（4）与现有检测方法相比，本发明是定量检测分析，可准确检测出三种蛋白各自的含量，具有方法简单、操作安全、检测效率高，样品微量化等优点，且检测一次完成，样本损失少，已有的检测方法对三项指标进行检测时需要将一份样本分三次检测才能完成，使得检测所需样品量较大，检测耗时较长，检测效率较低，且影响结果的准确性。
（5）本发明蛋白芯片生产成本低、检测成本低。
附图说明
图1.蛋白芯片阵列设计示意图。
芯片为12阵列芯片，其中阳性对照：兔多克隆抗体（兔IgG）检测点位；阴性对照：小牛血清白蛋白（BSA）检测点位；空白对照：磷酸盐缓冲液（pH 7.4 PBS）检测点位；β-酪蛋白检测点位；乳铁蛋白检测点位；β-乳球蛋白检测点位。
图2.蛋白芯片点样后扫描图。
图3. β-酪蛋白标准曲线图。
图4. 乳铁蛋白标准曲线图。
图5. β-乳球蛋白标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例仅用于对本发明做进一步的解释说明，不应理解为对本发明的保护范围构成任何限制。如无特别说明，实施例中所用的方法为本领域技术人员常规方法，所涉及的药品及浓度也是本领域常用试剂和浓度。
所述的检测指标的单克隆抗体皆可于市场上公开订制购买得到；如小鼠抗β-酪蛋白单克隆抗体、小鼠抗乳铁蛋白单克隆抗体和β-乳球蛋白单克隆抗体可于华大蛋白公司订制购买。
所述的阳性对照、阴性对照皆可于市场上公开购买；如兔IgG(兔多克隆抗体)、小牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液均可自北京中杉金桥公司购买
所述的β-酪蛋白、乳铁蛋白和β-乳球蛋白皆可于市场上购买。
所述的样本稀释液、浓缩洗涤液、标准品混合液、空白对照液、抗体检测液、Cy3荧光标记羊抗兔IgG工作液中的各种溶质成份均可公开购买。如吐温20可自北京市庆盛达化工技术有限公司购买，β-酪蛋白、乳铁蛋白和β-乳球蛋白可自Sigma公司购买，兔抗β-酪蛋白多克隆抗体、兔抗乳铁蛋白多克隆抗体、兔抗β-乳球蛋白多克隆抗体可自华大蛋白公司订制购买，Cy3荧光标记的羊抗兔IgG可自GE－Amersham Biosciences UK L imited 公司购买。
实施例1：用于同时检测牛乳中β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白并对三种蛋白营养价值做出综合评价的蛋白芯片的制备
按照如下方法进行：
（1）固相载体的选择：选用醛基化的12点阵形式的三维基片（晶芯高分子三维基片，购自博奥生物有限公司），确定点阵的排列方式为3×6阵列。
（2）配制点样液：
a.用含有游离Cy3的50%甘油点样缓冲液（购自博奥生物有限公司）与pH7.4的PBS缓冲液按点样缓冲液：PBS：单克隆抗体之间1：1：2体积比分别配制：小鼠抗β-酪蛋白单克隆抗体（Anti-casein, mitochondrial antibody，华大蛋白公司）点样液、小鼠抗乳铁蛋白单克隆抗体（Anti-lactoferrin antibody，华大蛋白公司）点样液和小鼠抗β-乳球蛋白单克隆抗体（Anti-β-lactoglobulin Antibody，华大蛋白公司）点样液。
b.阴性对照点样液：将50%甘油点样缓冲液、pH7.4的PBS溶液和12%小牛血清白蛋白溶液之间按1：1：2的体积比配制。
c.阳性对照点样液：将含有游离Cy3的含50%甘油点样缓冲液、pH7.4的PBS溶液和兔多克隆抗体（兔IgG，浓度为1mg/ml）（购自中杉金桥公司）按照1：1：2的体积比配制。
d.空白对照：pH7.4的PBS溶液。
（3）利用蛋白芯片点样仪（PersonalArrayer™ 16 Microarray Spotter, 博奥生物有限公司)将（2）中配制的各点样液：小鼠抗β-酪蛋白单克隆抗体点样液、小鼠抗乳铁蛋白单克隆抗体点样液、小鼠抗β-乳球蛋白单克隆抗体点样液、阳性对照点样液、阴性对照点样液、空白对照点样液分别点样于步骤（1）中的醛基化的三维基片上。
（4）固定、封闭、洗涤：在37℃恒温箱中固定反应16—20小时；然后以5%小牛血清白蛋白溶液（购自北京中杉金桥公司）封闭1小时。
再用含有1‰吐温20的磷酸盐缓冲液（PBST）（pH 7.4）洗涤芯片3次，室温晾干，得到本发明用于同时检测牛乳中β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白并对三种蛋白营养价值做出综合评价的蛋白芯片（见图1）。对固定好的芯片抽真空，4℃保存。
对所制备的蛋白芯片进行检测：用芯片扫描仪（LuxScan™ 10K MicroarrayScanner, 博奥生物有限公司）扫描上述制备的蛋白芯片，直接观察点样结果。结果（见图2）除了阴性对照点因不含游离Cy3而没有荧光信号外，其余各点位因含有游离的Cy3均呈清晰圆润信号结果，说明所制备的蛋白芯片质量好。
实施例2 ： 用于同时检测牛乳中β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白并对三种蛋白营养价值做出综合评价的蛋白芯片同时检测β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白的对比试验
试验样品为北京地区市售的牛奶，随机选取六份不同品牌（编号为I、II、III、IV、V、VI），每袋样品分为两份，一份用酶联免疫法（以下简称ELISA法）分别检测β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白含量；另一份用于本发明实施例1制备的蛋白芯片同时检测β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白含量。
（一）ELISA法检测：每份牛奶取200μl稀释1000倍后用ELISA法进行检测。ELISA法检测按常规方法（肖海龙等. 浙江大学学报, 2013;2:222-226；詹政科.中国乳品工业；5：44-50；李萌.中国畜牧兽医,4：84-87）进行。结果见表1。
（二）蛋白芯片检测按照如下方法进行：
（1）杂交反应：将实施例1制备的蛋白芯片取出，恢复至室温后破真空，对芯片中的1～6阵列依次滴加入将标准品混合液（以3%小牛血清白蛋白溶液（BSA）做样本稀释液溶解配制的β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白的混合液；其中混合液中各种蛋白的质量浓度分别为：β-酪蛋白 为 2.5mg/ml，乳铁蛋白，乳铁蛋白为 2μg/ml, β-乳球蛋白2μg/ml；从高至低按1：2倍比稀释所得的5个梯度的混合液，第六阵列加入空白对照液（30μl/阵）；第7～12阵列分别依次加入6份稀释的牛奶样品（30μl/阵）（用3%小牛血清白蛋白溶液（BSA）按1：8稀释各份后配成稀释的牛奶样品）；37℃温育1小时；
（2）将浓缩洗涤液按1：10稀释得1‰ PBST洗涤液，然后用1‰ PBST洗涤液洗涤芯片3次，5分钟/次，室温晾干。
（3）向各阵列中加入抗体检测液（用3%小牛血清白蛋白溶液（BSA）稀释配制的兔抗β-酪蛋白多克隆抗体（购自华大蛋白质公司）、兔抗乳铁蛋白多克隆抗体（购自华大蛋白质公司）和兔抗β-乳球蛋白多克隆抗体（购自华大蛋白质公司）的混合液。其中混合液中各种兔多克隆抗体的质量体积浓度（μg/ml）分别为：兔抗β-酪蛋白多克隆抗体5μg/ml、兔抗乳铁蛋白多克隆抗体0.36μg/ml、兔抗β-乳球蛋白多克隆抗体0.5μg/ml，30μl/阵，37℃温育1小时；用1‰ PBST洗涤液洗涤芯片3次，每次5分钟，室温晾干。
（4）向各阵列中加入Cy3荧光标记羊抗兔IgG（购买自GE——AmershamBiosciences UK L imited 公司）与3%小牛血清白蛋白按1：1000稀释的Cy3荧光标记羊抗兔IgG工作液，30μl/阵，37℃温育1小时；用1‰PBST洗涤液洗涤芯片3次，每次5分钟，室温晾干。
（5）利用芯片扫描分析仪（LuxScan™ 10K Microarray Scanner, 博奥生物有限公司）进行结果的判读与数据分析。对芯片中1-6阵列检测信号值与浓度值做六个浓度点的标准曲线（图3、图4和图5）并拟合标准回归方程（公式1、公式2、公式3）。
β-酪蛋白标准回归方程：
y = 5E-05x - 0.042 （公式1）
其中x为检测信号值，y为样本血清铁蛋白浓度值（ng/ml）。
乳铁蛋白受体标准回归方程：
y = 4E-05x - 0.280 （公式2）
其中x为检测信号值，y为样本血清铁蛋白浓度值（ng/ml）。
β-乳球蛋白标准回归方程：
y = 4E-05x - 0.315 （公式3）
将7-12阵列中牛奶样品检测信号值代入标准方程后，定量的计算出各例牛奶中检测浓度，结果见表2。
表1 ELISA法检测六份牛奶样品结果
表2.用本发明蛋白芯片检测六份牛奶样品结果
从表1与表2数据可以看出，两种方法检测牛乳中β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白含量的结果之间均无显著差异，说明用本发明蛋白芯片检测牛乳中这三种蛋白的结果准确可靠。但是，利用本发明蛋白芯片经一次加样即可同时检测三个蛋白指标，从而缩短了三个指标间的检测时间，使得检测结果更能反应出三个检测指标的真实性，并进而更能准确的同时反应出受检奶样营养价值的真实值；其次，用本发明蛋白芯片检测耗时少，本发明方法仅用五小时即可完成对42份奶样各3项检测指标3次重复的检测操作，而ELISA法则至少需要用时9-10小时；此外，本发明方法检测用样量低，本方法对每份奶样各3项指标完成3次重复仅需奶样20μl/份，而ELISA法为至少需奶样200μl/份。因而利用本发明蛋白芯片同时检测牛乳中β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白并对三种蛋白营养价值做出综合评价的方法是一种高通量、检测速度快、所需样品少的新型检测方法。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.一种同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片，其特征在于：包括固相载体和阵列式分布于固相载体上的β-酪蛋白单克隆抗体、乳铁蛋白单克隆抗体和β-乳球蛋白单克隆抗体；其中所述的单克隆抗体以共价键固定在固相载体的表面；所述的固相载体经醛基化修饰。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片，其特征在于：所述的固相载体是指经过醛基化修饰的载玻片。
3.根据权利要求1所述的一种同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片，其特征在于：所述的β-酪蛋白单克隆抗体是小鼠抗β-酪蛋白单克隆抗体；所述的乳铁蛋白单克隆抗体是指小鼠抗乳铁蛋白单克隆抗体；所述的β-乳球蛋白单克隆抗体是小鼠抗β-乳球蛋白单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的一种同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片，其特征在于：还包括阳性对照、阴性对照、空白对照；所述的阳性对照、阴性对照分别通过共价键固定于经过醛基化修饰的固相载体表面。
5.根据权利要求4所述的一种同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片，其特征在于所述的阳性对照是指兔多克隆抗体—兔IgG；所述的阴性对照是指小牛血清白蛋白；所述的空白对照是指磷酸盐缓冲液。
6.权利要求1-5任一所述的一种同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片的制备方法，其特征在于其步骤为：a、选择醛基化微阵列固相载体，确定点阵的排列方式和点样位置；b、配制点样液，c、用点样针按点阵的排列方式将β-酪蛋白单克隆抗体、乳铁蛋白单克隆抗体、β-乳球蛋白单克隆抗体与阴性对照、阳性对照及空白对照分别以接触式点样方式直接点印于固相载体上；d、37℃保温静置16—20h；e、以5%小牛血清白蛋白溶液封闭1小时，f、用含有1‰吐温 20的磷酸缓冲液洗涤3次，室温晾干，g、抽真空包装，4℃保存。
7.一种同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片的试剂盒，其特征在于包括权利要求1-5任一所述的用于检测β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白的蛋白芯片；还包括样本稀释液、浓缩洗涤液、标准品混合液、空白对照液、抗体检测液和Cy3荧光标记羊抗兔IgG工作液。
8.根据权利要求7所述的一种同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片的试剂盒，其特征在于所述的样本稀释液是指3%小牛血清白蛋白溶液；所述的浓缩洗涤液是指含有1%吐温20的磷酸盐缓冲液；所述的空白对照液是指3%小牛血清白蛋白溶液；所述的标准品混合液是指以3%小牛血清白蛋白溶液做样本稀释液溶解配制的β-酪蛋白、乳铁蛋白、β-乳球蛋白的混合液；标准品混合液中三种蛋白的浓度分别为：β-酪蛋白为2.5mg/ml，乳铁蛋白2μg/ml，β-乳球蛋白为 2μg/ml。
9.根据权利要求7或8所述的一种同时检测牛乳多种蛋白与营养价值的蛋白芯片的试剂盒，其特征在于所述的抗体检测液是指以3%小牛血清白蛋白溶液做样本稀释液溶解配制的兔抗β-酪蛋白多克隆抗体、兔抗乳铁蛋白多克隆抗体和兔抗β-乳球蛋白多克隆抗体的混合液；所述的混合液中各种兔多克隆抗体的质量体积浓度（μg/ml）分别为：兔抗β-酪蛋白多克隆抗体5μg/ml、兔抗乳铁蛋白多克隆抗体0.36μg/ml、兔抗β-乳球蛋白多克隆抗体0.5μg/ml；所述的Cy3荧光标记羊抗兔IgG工作液是指Cy3标记的羊抗兔IgG与3%小牛血清白蛋白溶液按1：1000稀释成的二抗工作液。
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