CN101504410A - 用于蛋白悬浮芯片检测的血清样品处理制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于液相蛋白悬浮芯片检测方法的血清样本处理制剂，该制剂包括基础缓冲液、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮，其中，该基础缓冲液的pH值在5.5－9.0之间，聚乙烯醇的质量体积百分比含量在0.05％－1.5％之间，聚乙烯吡咯烷酮的质量体积百分比含量在0.05％－2％之间。由于本发明的血清样本处理制剂中含有高分子表面活性剂聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮，可有效的降低抗体的一些非特异性吸附，降低本底值，提高检测的灵敏度。

Description

用于蛋白悬浮芯片检测的血清样品处理制剂

技术领域

本发明涉及一种血清样品的处理制剂，尤指一种用于蛋白悬浮芯片检测的血清样品处理制剂。

背景技术

随着全球生物安全战略的广泛实施，针对病原生物的快速诊断需求明显增加，像经典的检测方法如检测核酸的各类PCR、原位杂交、DNA芯片、NASBA等技术，检测蛋白质等抗原、抗体物质的ELISA、免疫层析技术、蛋白芯片技术等，都具有各自的特点。但是一般的方法主要检测单种病原或传染病，面对一个感染者，难以实现多病因的同时筛查。

悬浮芯片检测的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红色和橙色两种荧光染料，当微球被635nm的激光照射后，发射658nm和712nm的荧光。比较二者发射光的比率，能够区分100种不同的荧光微球，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.6μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。检测通道中设有两道激光，一道识别微球分类编码以确定检测项目；一道记录荧光信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与信号强弱，判定待测样本中有几种测试目标物在其中，从而得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。

采用蛋白悬浮芯片进行检测时，其检测对象主要可分为抗原和抗体两大类，目前，应用蛋白悬浮芯片检测蛋白质时多是用抗体包被微球然后检测体液中的细胞因子或是抗原，但是在检测不同的抗原时需要选择不同的抗体，由此就增加了实验的繁琐程度。如果用抗原包被微球，进而检测血清中的抗体就可简化实验，易于操作。但是，由于血清中的抗体成分种类复杂繁多，用抗原包被的微球检测抗体常常出现严重的非特异性吸附现象，严重影响检测敏感性，因此，采用悬浮芯片检测血清时需要制备一种能有效降低血清中非特异性吸附的样品处理制剂。

蛋白悬浮芯片用于检测抗体的原理基于免疫学中抗原抗体的特性性反应，在免疫学中用于检测抗体的方法有酶联免疫吸附剂测定(ELISA)间接法中测抗体时，所用的血清样本处理液为PB或PBS溶液，将PB或PBS溶液用于悬浮芯片检测的血清样本处理液时，非特异性吸附较严重，易出现假阳性和弱阳性，主要是由于人血清中含有约40％以上的异嗜性抗体，易与微球发生非特异性吸附，从而导致假阳性和弱阳性的现象。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可减少待测血清样品中非特异性吸附的样品处理制剂，尤其是用于蛋白悬浮芯片检测的样品处理中，由此提高蛋白悬浮芯片检测的灵敏度，而且该血清样品处理制剂的原料来源容易，配制方法简便。

为达到上述目的，本发明提供一种用于蛋白悬浮芯片检测血清抗体的样品处理制剂，其特征在于：该制剂包括基础缓冲液、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮，其中，该基础缓冲液的pH值在5.5-9.0之间，聚乙烯醇的质量体积百分比含量在0.05％-1.5％(即0.5-15毫克/毫升)之间，聚乙烯吡咯烷酮的质量体积百分比含量在0.05％-2.0％(即0.5-20毫克/毫升)之间。

本发明所述的血清样品处理制剂进一步含有所属技术领域常用的封闭剂，例如，所述封闭剂可选自BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、赖氨酸等中的一种或多种。

本发明所述的血清样品处理制剂进一步包括所属技术领域的常用防腐剂，所述防腐剂例如是：叠氮钠、硫汞撒或庆大霉素。

本发明的处理制剂中的基础缓冲液可以为生物化学中常用的缓冲液或盐溶液，例如，可选自Tris缓冲液、Hepes缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等中的一种或几种的混合液。

本发明所述的样品处理制剂还可以含有高分子表面活性剂，其选自海藻酸钠、甲基纤维素、聚维酮等中的一种或多种。

本发明的样品处理制剂中包括特定含量的高分子表面活性剂聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮，因此可有效的降低血清样品中的非特异性吸附，使之在经过简单处理后适用于悬浮芯片检测，从而提高悬浮芯片分析方法检测血清样品的能力。另外，本发明优化了所述制剂中的聚乙烯醇和聚乙烯吡咯酮的浓度、基础缓冲液pH值，适用于蛋白悬浮芯片的血清检测。

本发明的样品处理制剂与现有样品处理剂比较，明显降低了反应中的非特异性吸附现象，有效提高了检测的敏感度。同时，本发明的样品制剂所采用的组分原料容易获得，配制简便，普通技术人员在无特殊设备的条件下就可以完成对所述制剂的配制工作。

具体实施方式

本发明下面结合实施例进一步非限定地说明本发明。

实施例1

本发明的用于悬浮芯片血清检测的样品处理制剂，其组成如下：

1、基础缓冲液，本实施例以PB缓冲液作为本发明的溶液基质(即基础缓冲液)；

2、聚乙烯醇0.05％(w/v)；

3、聚乙烯吡咯烷酮2.0％(w/v)；

将本发明的处理制剂的PH值调整为7.0。

将配制好的上述样品处理制剂用于处理添加了兔抗结核抗体的正常健康人血清样本。室温下，取5μl血清样本加入到50μl的上述处理制剂中(1∶10稀释)，混匀，处理过的血清样本采用蛋白悬浮芯片进行结核抗体的检测。

结果显示，与用PB溶液处理相比较，经本实施例的样品处理制剂作用后，非特异性吸附的荧光值降低约为10％，检测灵敏度提高10倍以上。

表1、经PB溶液处理和本实施例的样品处理制剂处理

后10份样本非特异性吸附的荧光值检测结果

 

	PB溶液处理	本实施例的样品处理制剂处理
			1	1965.5	1782.0
2	1828.5	1603.5
			3	518.0	456.5
4	1364.5	1208.5
			5	314.5	280.5
6	345.0	336.5
			7	426.0	379.5
8	101.0	88.5
			9	1100.0	1008.5
10	194.0	139.5

实施例2

以PBS缓冲液作为本发明的溶液基质(基础缓冲液)，将其PH值调整为7.4，配制成含以下成分的溶液：

聚乙烯醇0.5％(w/v)

聚乙烯吡咯烷酮1.0％(w/v)

BSA1％(w/v)

上述样本处理制剂用于处理结核病人的血清样本，在室温条件下取5μl血清样本加入到50μl处理制剂中(1∶10稀释)，吹打混匀，用于蛋白悬浮芯片结核抗体的检测。

结果显示，与通用同浓度的Tween-20溶液处理相比较，经本实施例的样品处理制剂作用后，非特异性吸附可降低15％左右，检测灵敏度提高10倍以上。而且，在基质中加入BSA更可增加试剂的封闭性。表格2是经通用同浓度的Tween-20溶液处理和本实施例的样品处理制剂作用后10份样本非特异性吸附的荧光值检测结果。

表2、通用同浓度的Tween-20溶液处理与本实施例的样品处理

制剂作用10份样本非特异性吸附的荧光值检测结果

 

	通用同浓度的Tween-20溶液	本实施例的样品处理制剂处理
			1	1028.5	869.5
2	319.0	280.5
			3	192.0	158.5
4	650.5	563.5
			5	273.5	229.0
6	194.0	155.5
			7	293.5	235.5
8	137.0	125.5
			9	205.5	163.0
10	234.5	210.5

实施例3

以PBS缓冲液作为本发明的溶液基质(基础缓冲液)，将其PH值调整为9.0，配制成含以下成分的溶液：

聚乙烯醇0.05％(w/v)

聚乙烯吡咯烷酮1.0％(w/v)

酪蛋白2％(w/v)

叠氮钠0.05％(w/v)

上述样本处理制剂用于处理添加兔抗结核抗体的正常健康人血清样本，在室温条件下取5μl血清样本原液加入到50μl处理制剂中(1∶10稀释)，吹打混匀，用于蛋白悬浮芯片结核抗体的检测。结果显示，与用同浓度的Tween-20溶液处理相比较，经本实施例的样品处理制剂作用后，非特异性吸附可降低20％左右，检测灵敏度提高了10倍，而且在溶液基质中加入0.05％叠氮钠可以起到防腐作用，使配制好的溶液不会变质，加入2％的酪蛋白增强试剂的封闭性可有效的降低非特异性吸附，从而提高检测的敏感性。表格3是经Tween-20溶液处理和本实施例的样品处理制剂作用后10份样本非特异性吸附的荧光值检测结果。

表3、同浓度的Tween-20溶液处理与本实施例的样品处理

制剂作用10份样本非特异性吸附的荧光值检测结果

 

	同浓度的Tween-20溶液处理	本实施例的样品处理制剂处理
			1	103.5	79.0
2	144.0	121.5
			3	203.5	171.5
4	147.0	110.5
			5	260.0	208.5
6	60.5	57.0
			7	141.5	109.0
8	256.0	224.5
			9	311.0	230.5
10	353.0	270.0

实施例4

以PB缓冲液作为本发明的溶液基质(基础缓冲液)，将其PH值调整为7.4，配制成含以下成分的溶液：

聚乙烯醇0.05％(w/v)

聚乙烯吡咯烷酮1.0％(w/v)

BSA 2％(w/v)

叠氮钠0.05％(w/v)

上述样本处理制剂用于处理添加兔抗结核抗体的正常健康人血清样本，在室温条件下取5μl血清样本加入到50μl处理制剂中(1∶10稀释)，吹打混匀，用于蛋白悬浮芯片结核抗体的检测。结果显示，与同浓度Tween-20和BSA的PB溶液处理比较，经本实施例的样品处理制剂作用后，非特异性吸附可降低20％左右，检测敏感性提高10倍左右。而且在溶液基质中加入0.05％叠氮钠可以起到防腐作用，使配制好的溶液不会变质。表格4是经Tween-20和BSA的PB溶液和本实施例的样品处理制剂作用后10份样本非特异性吸附的荧光值检测结果。

表4、经Tween-20和BSA的PB溶液和本实施例的样品处理制剂作

用后10份样本非特异性吸附的荧光值检测结果

 

	Tween-20和BSA的PB溶液处理	本实施例的样品处理制剂处理
			1	238.0	170.5
2	364.5	307.5
			3	686.0	539.0
4	109.0	100.0
			5	405.5	333.5
6	134.0	97.0
			7	111.0	101.0
8	512.5	404.5
			9	136.0	99.5
10	313.5	273.0

实施例5

以PB缓冲液作为本发明的溶液基质(基础缓冲液)，将其PH值调整为8.0，配制成含以下成分的溶液：

聚乙烯醇0.05％(w/v)

聚乙烯吡咯烷酮1.0％(w/v)

BSA 1％(w/v)

酪蛋白0.2％(w/v)

叠氮钠0.05％(w/v)

上述样本处理制剂用于处理添加兔抗结核抗体的正常健康人血清样本，在室温条件下取5μl血清样本原液加入到50μl处理制剂中(1∶10稀释)，吹打混匀，用于蛋白悬浮芯片的检测。结果显示，与通用的同浓度Tween-20溶液处理比较，经本实施例的样品处理制剂作用后，非特异性吸附可降低15％左右，检测灵敏度提高10倍以上。而且在溶液基质中加入0.05％叠氮钠起到防腐作用，使配制好的溶液不会变质。表格5是经Tween-20溶液和本实施例的样品处理制剂作用后10份样本非特异性吸附的荧光值的检测结果。

表5、通用同浓度的Tween-20溶液处理与本实施例的样品处理

制剂作用10份样本非特异性吸附的荧光值检测结果

 

	通用同浓度的Tween-20溶液处理	本实施例的样品处理制剂处理
			1	724.0	691.5
2	510.5	480.0
			3	393.5	370.5
4	136.0	128.0
			5	165.5	160.5
6	775.0	740.0
			7	657.5	619.0
8	212.5	201.5
			9	135.0	127.5
10	330.5	313.0

综上所述，本发明所述的血清样品处理制剂可以降低血液检测中的非特异性吸附，由此提高了检测的灵敏度，而且原料易得，方法简单，结果准确，为蛋白悬浮芯片的检测技术作出了突破性的贡献。

Claims (6)

1、一种用于蛋白悬浮芯片血清样品检测的处理制剂，其特征在于：该制剂包括基础缓冲液、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮，其中该基础缓冲液的PH值在5.5-9.0之间，聚乙烯醇的质量体积百分比含量是0.05％-1.5％，聚乙烯吡咯烷酮的质量体积百分比含量是0.05％-2.0％。

2、如权利要求1所述的处理制剂，其特征在于：所述制剂还包括封闭剂，所述封闭剂可选自BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、赖氨酸中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的样品处理制剂，其特征在于：所述制剂还包括防腐剂，所述防腐剂选自叠氮钠、硫汞撒或庆大霉素中的一种或多种。

4.如权利要求1所述的样品处理制剂，其特征在于：所述制剂还包括高分子表面活性剂。

5.如权利要求4所述的样品处理制剂，其特征在于：所述高分子表面活性剂可为海藻酸钠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素中的一种或多种。

6.如权利要求1所述的处理制剂，其特征在于：所述基础缓冲液可选自Tris缓冲液、Hepes缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等中的一种或几种的混合液。