CN109507423A - 一种基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法 - Google Patents

一种基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测α‑乳白蛋白、β‑乳球蛋白和乳铁蛋白的核酸适配体探针，属于食品分析的免疫分析技术领域，本发明公开的检测α‑乳白蛋白、β‑乳球蛋白和乳铁蛋白的核酸适配体探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示。本发明方法可以快速准确的同时测定α‑乳白蛋白、β‑乳球蛋白和乳铁蛋白的含量，灵敏度高，检测时间短，操作简单易行。

Description

一种基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳 铁蛋白含量的方法
技术领域
本发明属于多种蛋白检测方法，特别涉及一种基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，属于食品分析的免疫分析技术领域。
背景技术
牛乳及其乳制品中含有丰富的蛋白质，几乎含有人体所有的必需氨基酸。在发达国家，乳蛋白及其制品提供了20％-30％的食物蛋白，是人们的重要蛋白质来源。尤其对于婴幼儿来说，牛乳是除了母乳之外的重要营养物质，但是牛乳又是较易引起过敏的食物之一。牛乳过敏对婴幼儿的健康成长已经造成了越来越大的影响，它可以引起婴幼儿腹泻、皮疹、缺铁性贫血、发育不良，严重时甚至可以引起喉头水肿和过敏性休克最终导致死亡。引起牛乳过敏的主要过敏原是乳蛋白，绝大多数牛乳蛋白都具有潜在的致敏性，其中的酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白被认为是主要的过敏原。大量的流行病学研究表明，乳蛋白过敏在婴幼儿中最为普遍，发生率大约是2％-6％。据统计，大约有20％的婴儿在1岁时用牛奶喂养都会发生牛奶蛋白过敏。
牛乳中α-乳白蛋白占总乳清蛋白的22％，易溶于水，属于溶菌酶家族，呈球状，由123个氨基酸残基构成，分子量为14.4kDa，含有4个二硫键。牛乳中α-乳白蛋白与人乳中α-乳白蛋白的同源性约为74％，另有6％的氨基酸残基化学性质相似。β-乳球蛋白是乳清中含量最多的蛋白，占乳清蛋白的50％，牛乳总蛋白的10％，在鲜牛乳中以36kDa的二聚体形式存在，属Lipoca1in蛋白，其单体由162个氨基酸残基组成。β-乳球蛋白不存在于母乳中，且胃蛋白酶不能将其消化水解，因此可通过胃肠道进入血液循环。据报道，这一类蛋白具有强致敏性，作为牛乳中的首要过敏成分，刺激婴儿免疫系统的发生超敏反应。乳铁蛋白是一种分子量约为80kD的铁结合糖蛋白，其来源主要是由动物的乳腺上皮细胞分泌。乳铁蛋白是人乳中的4种主要蛋白质之一，大约占人乳总蛋白的10％，它属于一种先天免疫系统的成分物质，可以促进铁元素的吸收，还具有抗菌杀菌、抗病毒及调节机体免疫反应等多种功能。婴儿出生后，自身免疫系统还没有完全健全，母乳中的乳铁蛋白是保证婴幼儿健康生长的一种重要物质，而大部分婴幼儿配方奶粉中几乎不含这种营养物质。在婴幼儿配方奶粉中添加使用牛乳铁蛋白，使其营养成分更接近母乳，对婴幼儿的生长发育极为重要；但是如果摄入过量，又会对婴幼儿的肝肾功能造成负担。
牛乳营养价值高、但致敏性强，而牛乳又常作为原料用于各种食品，所以开展针对食品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的检测方法具有重要的理论和现实意义。目前，国内外对食品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的检测方法包括：以检测蛋白为基础的免疫化学检测方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)和仪器检测方法高效液相色谱法(HPLC)等。ELISA一次只能检测一种蛋白，无法做到多指标同时检测。HPLC法虽可同时检测多种蛋白但前处理操作繁琐，耗时长，且需要专业的技术人员进行操作，检测成本高。此外，HPLC的检测灵敏度低，乳铁蛋白含量相对较低，无法和α-乳白蛋白、β-乳球蛋白同时检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于适配体探针同时检测食品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，在于弥补现有方法无法同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的空白，满足快速、高灵敏度，低成本检测要求。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的核酸适配体，
检测α-乳白蛋白适配体探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
检测β-乳球蛋白适配体探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
检测乳铁蛋白适配体探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
一种基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，包括以下步骤：
(1)将α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的抗体在载体片基内进行点样操作，然后固定、封闭、洗涤；
(2)在经由步骤(1)处理后的部分反应孔内加入不同浓度梯度的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白标准品混合溶液，在剩余反应孔内加入待测样品溶液，再加入所对应的标记适配体探针，所有反应孔反应并洗涤；
(3)根据不同浓度的信号值，利用外标曲线法定量检测待测样品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。
所述的载体片基为多孔板、高聚物片基、膜或玻片。
所述标记适配体探针，标记物包括荧光材料，纳米材料，酶。
所述荧光材料包括量子点、荧光素、荧光微球；纳米材料包括纳米银、纳米金；酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
步骤(2)中，所述适配体探针，α-乳白蛋白适配体序列为：5’-GCA GGA CAC CGTAAC CCT AAC ACG TAC GGG GCA TTT ATG GCA TAG CTC TTC CTC CCT GC-3’
β-乳球蛋白适配体序列为：5’-AGG CAG GAC ACC GTA ACC GGT GCA TCT ATG GCTACT AGC TTT TCC TGC CT-3’
乳铁蛋白适配体为5’-GCA GGA CAC CGT AAC ACC TAT CAACCATGACGG TGC AATATT GGC GCT AGC TCT TCC TGC-3’
步骤(2)中，所述的标记适配体探针通过物理吸附或共价结合方式将适配体与标记物相结合。
步骤(2)中，所述的标记物为纳米材料和酶时，所有反应孔内需加入底物，进行催化显色反应或催化发光反应。
所述的底物包括：邻苯二胺/过氧化氢体系、四甲基联苯胺/过氧化氢体系、BCIP/NBT体系、氯金酸/单宁酸体系、氯金酸/氢醌体系、硝酸银/氢醌体系，鲁米诺/过氧化氢体系，优选氯金酸/氢醌体系。生物催化剂对反应条件要求较高，例如部分催化剂在37℃的催化效率最高；而化学催化剂的稳定性高，适应范围广。
步骤(2)中，所述的待测样品为：生乳，鲜奶，巴士消毒奶，高温消毒奶，酸奶，奶粉。
步骤(2)中，所述反应是指在20～37℃下反应0.5～2h；所述洗涤是指用PBST洗涤3～4次，每次3～10min。
步骤(3)中，所述的信号值为荧光信号值，灰度值，化学发光强度值。
所述的待测样品溶液的制备方法为：当待测样品为液体时，取50μL～1mL于10mLEP管中，用PBS缓冲液稀释10～1000倍即得待测样品溶液；当待测样品为固体时，取样品1g，加入10-100mL PBS缓冲液，混合2～5min，即得待测样品溶液。
本发明中，所述的PBS缓冲液的配制方法为：137mmol/L氯化钠、2.7mmol/L氯化钾、10mmol/L磷酸二氢钠、2mmol/L磷酸二氢钾
PBST洗涤液配制方法：PBS缓冲液中再加0.05％Tween 20。
有益效果：
相比较于现有技术，本发明方法基于抗体和适配体探针采用夹心法同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。适于实际样品的检测，可以快速准确的同时测定α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量，灵敏度高，检测时间短，操作简单易行。
附图说明
图1检测方法的特异性考察结果。
图2α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白检测的标准曲线图。线性方程和相关系数如下：
α-乳白蛋白：y＝-0.3258x+0.5171,r＝0.9829；
β-乳球蛋白：y＝-0.2738x+0.5986,r＝0.9702；
乳铁蛋白：y＝-0.2558x+0.5658,r＝0.9952.
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出详细说明。
实施例1：
本实施例检测的是牛奶中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量，其中牛奶样品溶液的制备方法为：取50μL～1mL待测牛奶于10mL EP管中，用缓冲液稀释200倍即得待测样品溶液；其中缓冲液为PBS缓冲液。
一种基于适配体探针同时检测上述牛奶样品溶液中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，包括如下步骤：
(1)将α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白抗体通过生物芯片点样仪在96孔板内进行点样操作，点好后的96孔板在37℃中固定2h；向固定后的每个反应孔内加入100μL10mg/mL的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭1h，然后PBST洗涤3次，每次5min；
(2)在经由步骤(1)处理后的部分反应孔内加入25μL不同浓度梯度的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白标准品混合溶液，在剩余反应孔内加入25μL牛奶样品溶液，再在每孔中加入25μL α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白所对应的适配体修饰的纳米银，所有反应孔25℃反应0.5h，然后PBST洗涤3次，每次5min；
(3)在经由步骤(2)处理后的每个反应孔内加入50μL显色剂氯金酸/氢醌，避光显色反应10min后，终止反应；
(4)用芯片扫描仪进行图像扫描，根据不同浓度的灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。
利用本方法检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白时，方法的特异性结果如图1所示，说明方法的特异性良好，能很好的同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白，而不受其他蛋白的干扰。
图2为标准曲线，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白在0.05μg/mL-25μg/mL范围内成线性关系，线性方程和相关系数如下：
α-乳白蛋白：y＝-0.3208x+0.5371，r＝0.9849；
β-乳球蛋白：y＝-0.2788x+0.5483，r＝0.9722；
乳铁蛋白：y＝-0.2598x+0.5258，r＝0.9882。
在计算公式中，y：B/B0％，x：lg C.(B/B0是指当有分析物存在时响应值和没有分析物存在时最大响应B0的比率)。
方法的精确度：α-LA(1μg/mL)，β-LG(1μg/mL)，LF(1μg/mL)时，测得的批内相对标准偏差(RSD)均小于10％。批间精确度(RSD)均小于15％。
同时，用该方法检测了牛奶中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。在牛奶溶液中的加标回收率均在90％-110％之间。
回收率＝(C1-C2)/C3×100％
C1：添加标准品后的样品浓度。
C2：添加标准品前的样品浓度。
C3：添加标准品的浓度。
实施例2：
一种基于适配体探针同时检测上述牛奶样品溶液中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，包括如下步骤：
(1)将α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白抗体通过生物芯片点样仪在96孔板内进行点样操作，点好后的96孔板在37℃中固定2h；向固定后的每个反应孔内加入100μL10mg/mL的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭1h，然后PBST洗涤3次，每次5min；
(2)在经由步骤(1)处理后的部分反应孔内加入25μL不同浓度梯度的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白标准品混合溶液，在剩余反应孔内加入25μL牛奶样品溶液，再在每孔中加入25μL α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白所对应的适配体修饰的荧光微球，所有反应孔25℃反应0.5h，然后PBST洗涤3次，每次5min；
(3)用芯片扫描仪进行图像扫描，根据不同浓度的荧光信号值，利用外标曲线法定量检测样品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。
实施例3：
一种基于适配体探针同时检测上述牛奶样品溶液中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，包括如下步骤：
(1)将α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白抗体通过生物芯片点样仪在96孔板内进行点样操作，点好后的96孔板在37℃中固定2h；向固定后的每个反应孔内加入100μL10mg/mL的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭1h，然后PBST洗涤3次，每次5min；
(2)在经由步骤(1)处理后的部分反应孔内加入25μL不同浓度梯度的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白标准品混合溶液，在剩余反应孔内加入25μL牛奶样品溶液，再在每孔中加入25μLα-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白所对应的适配体修饰的HRP酶，所有反应孔25℃反应0.5h，然后PBST洗涤3次，每次5min；
(3)在经由步骤(2)处理后的每个反应孔内加入50μL鲁米诺/过氧化氢体系，避光显色反应10min后，终止反应；
(4)用芯片扫描仪进行图像扫描，根据不同浓度的化学发光强度值，利用外标曲线法定量检测样品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。
序列表
<110> 南京祥中生物科技有限公司
<120> 一种基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaggacacc gtaaccctaa cacgtacggg gcatttatgg catagctctt cctccctgc 59
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggcaggaca ccgtaaccgg tgcatctatg gctactagct tttcctgcct 50
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcaggacacc gtaacaccta tcaaccatga cggtgcaata ttggcgctag ctcttcctgc 60

Claims (11)

1.一种检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的核酸适配体探针，其特征在于，
检测α-乳白蛋白适配体探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
检测β-乳球蛋白适配体探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
检测乳铁蛋白适配体探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的抗体在载体片基内进行点样，然后固定、封闭、洗涤；
(2)在经由步骤(1)处理后的反应孔内加入不同浓度梯度的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白标准品的混合溶液，在其他反应孔内加入待测样品溶液，再加入标记物标记的适配体探针，反应并洗涤；
所述适配体探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示；
(3)根据不同浓度的信号值，利用外标曲线法定量检测待测样品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。
3.根据权利要求1所述的基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的载体片基为多孔板、高聚物片基、膜或玻片。
4.根据权利要求1所述的基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述标记物包括荧光材料、纳米材料、酶，所述荧光材料包括量子点、荧光素、荧光微球；所述纳米材料包括纳米银、纳米金；所述酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
5.根据权利要求2所述的基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的适配体探针通过物理吸附或共价结合方式与标记物相结合。
6.根据权利要求4所述的基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，其特征在于，所述的标记物为纳米材料和酶时，所有反应孔内需加入底物，进行催化显色反应或催化发光反应。
7.根据权利要求6所述的基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，其特征在于，所述的底物包括：邻苯二胺/过氧化氢体系、四甲基联苯胺/过氧化氢体系、BCIP/NBT体系、氯金酸/单宁酸体系、氯金酸/氢醌体系、硝酸银/氢醌体系，鲁米诺/过氧化氢体系。
8.根据权利要求2所述的基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的待测样品包括：生乳、鲜奶、巴士消毒奶、高温消毒奶、酸奶、奶粉。
9.根据权利要求2所述的基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述反应是指在20～37℃下反应0.5～2h；所述洗涤是指用PBST洗涤3～4次，每次3～10min。
10.根据权利要求2所述的基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的信号值为荧光信号值、灰度值、或化学发光强度值。
11.根据权利要求8所述的基于适配体探针同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，其特征在于，所述的待测样品的制备方法如下：
当待测样品为液体时，取50μL～1mL于10mL EP管中，用PBS缓冲液稀释10～1000倍即得待测样品溶液；
当待测样品为固体时，取样品1g，加入10-100mL PBS缓冲液，混合2～5min，即得待测样品溶液。
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