CN114075565A - 一种用于检测β-乳球蛋白的双功能G-四链体变构生物传感器 - Google Patents

一种用于检测β-乳球蛋白的双功能G-四链体变构生物传感器 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测β‑乳球蛋白的双功能G‑四链体变构生物传感器，包括：（1）β‑乳球蛋白双功能G‑四链体适配体设计；（2）β‑乳球蛋白生物传感器反应条件优化；（3）β‑乳球蛋白的检测。设计原理是基于β‑乳球蛋白生物传感器序列在引入检测靶标前后发生构象变化，对G‑四链体/氯化血红素（Hemin）DNA仿生酶的过氧化氢酶活产生影响，进而实现β‑乳球蛋白的检测。G‑四链体序列响应靶标浓度，使得其催化3,3',5,5'‑四甲基联苯胺（TMB）显色后溶液呈现出相应的比色梯度，最终实现了β‑乳球蛋白简便、快速、低成本、超灵敏的比色检测。

Description

一种用于检测β-乳球蛋白的双功能G-四链体变构生物传感器
技术领域
本发明属于生物传感器领域，具体是一种用于检测β-乳球蛋白的双功能G-四链体变构生物传感器。
背景技术
食物过敏已成为严重的全球性公共卫生问题，约5%的成年人和8%的儿童对食物过敏，其中约1/3由牛乳过敏引起，且发病率呈上升趋势。牛乳是联合国粮食及农业组织（Foodand Agriculture Organization，FAO）和世界卫生组织（World Health Organization，WHO）认定的八大过敏性食物之一，婴幼儿是牛乳过敏的主要人群。我国最新流行病学调查表明，我国约有2.69%的婴幼儿对牛乳蛋白过敏。在食品加工中，牛乳蛋白被广泛添加到各类食品中，而且在食品加工、储存、运输等环节也存在牛乳蛋白污染的可能性。因而增加了牛乳过敏人群接触牛乳过敏原的风险，严重影响牛乳过敏人群的身体健康与生活质量。目前，食物过敏尚无特效疗法，牛乳过敏患者需要严格避免食用含牛乳蛋白的食品。欧美等发达国家均要求标识食品中的过敏原成分，其中就包括牛乳及乳制品。牛乳中超过30种蛋白具有潜在致敏性，主要过敏原为酪蛋白和乳清蛋白。其中，β-乳球蛋白约占牛乳总蛋白的10%，乳清蛋白的50%，而且约82%的牛乳过敏患者对β-乳球蛋白过敏。因此，β-乳球蛋白可以作为一种检测食品中是否含牛乳蛋白的一种有效标志物。
目前，有关过敏原的检测方法包括经典的ELISA检测法、色谱检测法、PCR检测法。由于牛乳中基本不含过敏原相关DNA，所以色谱技术和免疫学技术是检测牛乳过敏原的主要方法。然而，色谱学方法对仪器场地、人员技术要求较高，经典免疫学方法操作繁琐、抗体成本较高，同时这两种方法的操作时间较长，都被限制了即时检测应用。随着牛乳过敏患者人数及发病率的增加，世界各国对食物过敏原的强制管理升级，消费者对食品安全意识的增强，公众知情需求及执法效率提高的客观要求，快速检测食品中β-乳球蛋白的含量具有重要意义。
核酸适配体是一类能够与靶物质特异性结合的寡核苷酸序列。适配体的筛选主要依靠指数富集进化技术（systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX），即在体外含有随机序列的分子池中选择可与靶物质高亲和性结合的核酸序列，通过靶物质诱导适配体发生构象变化，形成配体络合物，并不断的对配体络合物进行PCR扩增、富集、测序等过程，最终将单个核酸从文库中筛选出来。1990年，Ellington和Szostak首次通过SELEX技术体外筛选获得适配体。2001年，有学者报道了一个包含G-四链体结构的23 mer β-乳球蛋白核酸适配体，这种具有特殊二级结构的适配体在传感领域应用广泛。目前，基于核酸适配体实现的β-乳球蛋白传感应用多为电化学生物传感器，其组装成本高，需要特定化学基团修和信号输出元件的引入，且大多难以用于即时检测，应用受限。
G-四链体是由4个鸟嘌呤通过Hoogsteen氢键键合形成的高级结构。G-四链体和氯化血红素（Hemin）结合，可以增强Hemin的过氧化物酶活，形成DNA仿生酶。这类酶由富含鸟嘌呤G的DNA序列和Hemin构成，在H2O2或O2的存在下，能够对如2,2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）和3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）等底物进行催化显色。
本发明基于β-乳球蛋白生物传感器序列在引入检测靶标前后发生构象变化，对G-四链体/Hemin DNA仿生酶的过氧化氢酶活产生影响，进而实现β-乳球蛋白的检测。G-四链体序列响应靶标浓度，使得其催化TMB显色后呈现出相应的颜色梯度，最终实现了β-乳球蛋白简便、快速、低成本、超灵敏的比色检测。对靶标的可视化快速检测。
发明内容
基于此，本发明提供一种用于检测β-乳球蛋白的双功能G-四链体适配体的设计方法，以及β-乳球蛋白双功能G-四链体变构生物传感器。
一方面，本申请提供了一种β-乳球蛋白的双功能G-四链体适配体的设计方法。
所述β-乳球蛋白双功能G-四链体适配体设计是指对β-乳球蛋白的适配体通过中心区域碱基设计赋予适配体双重功能；
具体的，首先在β-乳球蛋白适配体org-G4（SEQ ID NO.1）的中心区域引入不同碱基对；然后在 org-G4的中心区域引入不同个数的T碱基对；最后将上述优化序列进行整合获得具有识别靶标和信号输出的β-乳球蛋白双功能G-四链体适配体序列；
具体的，β-乳球蛋白的双功能G-四链体适配体序列如下：
enlg1：5’- GGGGTTGGGGTTGTTGGGGTTGGGG -3’ ，如SEQ ID NO.2所示；
enlg2：5’- GGGGTTGGGGATGTAGGGGTTGGGG -3’，如SEQ ID NO.3所示；
enlg3：5’- GGGGTTGGGGCTGTCGGGGTTGGGG -3’，如SEQ ID NO.4所示；
enlg6：5’- GGGGTTGGGGTTTGTTTGGGGTTGGGG -3’， 如SEQ ID NO.5所示；
enlg7：5’- GGGGTTGGGGTTTTGTTTTGGGGTTGGGG -3’ ， 如SEQ ID NO.6所示；
enlg9：5’- GGGGTTGGGGTTTTTGTTTTTGGGGTTGGGG -3’ ， 如SEQ ID NO.7所示；
enlg2-pl3：5’- GGGGTTGGGGTATGTATGGGGTTGGGG -3’ ， 如SEQ ID NO.8所示。
所述的β-乳球蛋白的双功能G-四链体适配体在β-乳球蛋白检测中的应用。
另一方面，本申请开发了一种用于检测β-乳球蛋白的双功能G-四链体变构生物传感器，其特征在于，（1）β-乳球蛋白双功能G-四链体适配体设计；（2）β-乳球蛋白生物传感器反应条件优化；（3）β-乳球蛋白的检测。
所述β-乳球蛋白双功能G-四链体适配体设计是指对β-乳球蛋白的适配体通过中心区域碱基设计赋予适配体双重功能；
所述中心区域碱基设计是指β-乳球蛋白适配体经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加使其具有靶向识别和信号输出的双重功能。
所述β-乳球蛋白生物传感器反应条件优化包括G四链体形成条件以及信号输出条件；
所述G四链体形成条件包括G-四链体孵育液pH、Na+和K+的离子浓度；
所述G四链体形成条件为10 mmol·L-1 Tris buffer中增加10~100 mmol·L-1 K+和10~100 mmol·L-1 Na+，pH调节为3.8~8.4；
优选地，β-乳球蛋白生物传感器的G-四链体孵育液条件及成分是100 mmol·L-1Na+、100 mmol·L-1 K+、10 mmol·L-1 Tris buffer，pH 7.0；
所述信号输出条件包括G-四链体与Hemin的浓度比、TMB显色液pH、催化反应时间；
所述信号输出的条件为G-四链体与Hemin浓度比例：0.1~2，TMB显色液pH 3.9~8.4，催化反应孵育时间为5~40 min；
优选的，TMB比色实验中G-四链体与Hemin浓度比例1：1，TMB显色液pH 3.9，催化反应孵育时间为20 min。
所述β-乳球蛋白的检测是基于β-乳球蛋白双功能G-四链体适配体在靶标存在时发生构象变化，进而对G-四链体/Hemin DNA仿生酶的过氧化氢酶活产生影响，使得催化TMB显色的溶液呈现梯度变化，实现β-乳球蛋白的检测。
另一方面，证明β-乳球蛋白生物传感器对β-乳球蛋白的选择性。
选用牛奶中的乳蛋白或过敏原对β-乳球蛋白生物传感器的选择性进行评估。将10μL 60 μmol·L-1 enlg2-pl3与10 μL 60 μmol·L-1 Hemin和1000 μg·mL-1 牛血清白蛋白、酪蛋白和乳铁蛋白和40 μL G-四链体孵育液混合，37℃孵育20 min后，将30 μL 0.8 μmol·L-1 TMB显色液加入反应液中进行20 min催化反应。随后加入30 μL 2 mol·L-1 H2SO4溶液终止催化反应；最后，利用酶标仪在450 nm处测量溶液吸光度。将吸光度变化值代入线性回归方程中，计算出的相应蛋白质浓度远小于β-乳球蛋白组的检测浓度，表明该β-乳球蛋白生物传感器具有较好的选择性。
另一方面，β-乳球蛋白传感器对含有β-乳球蛋白的实际样品检测，具体操作如下：
分别选用奶粉和鲜奶作为固体样品和液体样品。0.1 g奶粉用蒸馏水预稀释至1ml。奶粉和鲜奶样在40℃孵育30 min后离心20 min （6000 rpm），随后冰浴冷却15 min。去除凝乳后，加入HCl调节pH至4.7。然后，将含有β-乳球蛋白的上清液从酪蛋白和牛血清白蛋白沉淀中离心分离出来。随后将乳清样品用NaOH中和至pH 7.4，稀释20倍后分别在牛奶样品中添加10 μg·mL-1、100 μg·mL-1和1000 μg·mL-1 β-乳球蛋白。将10 μL 60 μmol·L-1enlg2-pl3与10 μL 60 μmol·L-1 Hemin、40 μL G-四链体孵育液（100 mmol·L-1 Na+、100mmol·L-1 K+、10 mmol·L-1 Tris buffer，pH 7.0）和40 μL待测样品混合，37℃孵育20 min后，将30 μL 0.8 μmol·L-1 TMB显色液加入反应液中进行20 min催化反应。随后加入30 μL2 mol·L-1 H2SO4溶液终止催化反应。最后，利用酶标仪在450 nm处测量吸光度，将加入β-乳球蛋白加入前后吸光度的变化值代入标准曲线，计算得到待测样品中β-乳球蛋白的含量，实现对β-乳球蛋白的定量检测。
另一方面，涉及该生物传感器在β-乳球蛋白检测方法开发中的应用，以及在β-乳球蛋白食品安全检测试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明对β-乳球蛋白的G-四链体适配体进行了设计，得到了具有信号输出和靶标识别双重功能的β-乳球蛋白适配体。
2、本发明将优化得到的β-乳球蛋白适配体构建为β-乳球蛋白生物传感器，实现了β-乳球蛋白的无标记、快速、低成本、灵敏的生物传感器。
3、本发明利用优化得到的β-乳球蛋白适配体序列提升了生物传感器的检测灵敏度、检测和输出一体化的生物传感平台，拓展了传感器的应用广泛性。
4、本发明提出的β-乳球蛋白生物传感器能够实现简便、快速、低成本和超灵敏的β-乳球蛋白检测，具有一定的通用性和产业化潜力。
5、本发明提出的β-乳球蛋白生物传感器在1 μg·mL-1~4000 μg·mL-1范围内具有良好线性关系（R2=0.994），线性回归方程为Y=-0.2159 lgX + 0.9014，检出限低至0.19 μg·mL-1。
附图说明
图1为β-乳球蛋白的G-四链体适配体优化结果。（A）为中心区域引入不同碱基对TMB比色实验结果；（B）为中心区域引入不同个数T碱基对的TMB比色实验结果；（C）为（A）和（B）中最优序列整合的TMB比色实验结果。
图2为β-乳球蛋白的G-四链体适配体的圆二色光谱图。（A）为org-G4；（B）为enlg1；（C）为enlg2；（D）为enlg3；（E）为enlg6；（F）为enlg7；（G）为enlg9；（H）为enlg2-pl3（SEQ IDNO.8）。
图3为β-乳球蛋白生物传感器检测β-乳球蛋白的原理图。
图4为β-乳球蛋白生物传感器检测β-乳球蛋白的标准曲线图。
图5为β-乳球蛋白生物传感器选择性验证的结果图。其中，BSA为牛血清白蛋白，Casein为酪蛋白，Lactoferrin为乳铁蛋白，β-LG为β-乳球蛋白；插图为加入不同蛋白的TMB比色实验结果。
图6为β-乳球蛋白传感器的G-四链体孵育液pH及成分浓度以及TMB显色液pH优化的结果图。（A）为不同G-四链体孵育液的成分浓度、pH以及不同TMB显色液pH的相关信息；（B）和（C）为不同条件下的TMB比色实验结果。
图7为β-乳球蛋白传感器的G-四链体与Hemin浓度比例优化的结果图。
图8为β-乳球蛋白传感器的TMB比色反应催化时间优化的结果图。（A）和（B）分别为催化时间20和40 min组别的标准曲线图；（C）-（F）分别为催化时间为5、10、20和40 min组别的TMB比色实验结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1. β-乳球蛋白适配体的设计
1. 在β-乳球蛋白适配体中心区域引入不同碱基对
目前报道的基于适配体检测β-乳球蛋白的应用大多需要引入信号输出元件，为了得到具有靶标识别和信号输出双重功能的β-乳球蛋白适配体，将原β-乳球蛋白适配体进行设计，并通过圆二色光谱和TMB比色实验验证设计结果。首先，在org-G4（SEQ ID NO.1）的中心环部区域分别引入1对T、A、C碱基，并将序列命名为enlg1（SEQ ID NO.2），enlg2（SEQ IDNO.3）和enlg3（SEQ ID NO.4）。
通过圆二色光谱对不同序列形成G-四链体结构的能力进行评估。将20 μL 60 μmol·L-1不同序列与20 μL 60 μmol·L-1 Hemin和160 μL G-四链体孵育液（100 mmol·L-1Na+、100 mmol·L-1 K+、10 mmol·L-1 Tris buffer （0.083 mol·L-1 Na2HPO4、0.083mol·L-1 KH2PO4、0.017 mol·L-1 KCl），pH 7.0））混合，37℃孵育20 min后进行圆二色光谱测定。在220~320 nm范围内，以2 nm/s的速率进行3次扫描。
通过TMB比色法对不同G-四链体序列与Hemin形成DNA仿生酶的酶活进行评估。首先配置0.8 μmol·L-1 TMB显色液（pH 3.9），将50 μL 0.16 mmol·L-1 TMB溶液和10 μL0.06% H2O2溶于10 mL TMB底物缓冲液（包含0.1843 g Na2HPO4·12H2O和0.933 g柠檬酸）中。将10 μL 60 μmol·L-1不同序列与10 μL 60 μmol·L-1 Hemin、10 μL不同浓度的β-乳球蛋白和40 μL G-四链体孵育液混合，37℃孵育20 min后，将30 μL 0.8 μmol·L-1 TMB显色液加入反应液中进行20 min催化反应。随后加入30 μL 2 mol·L-1 H2SO4溶液终止催化反应，溶液变黄。最后，利用酶标仪在450 nm处测量吸光度。通过比较实验组和对照组之间的吸光度变化反映β-乳球蛋白加入前后的DNA仿生酶的活性变化。
实验中用到G-四链体序列如下：
org-G4（SEQ ID NO.1）：5’- GGGGTTGGGGTGTGGGGTTGGGG -3’
enlg1（SEQ ID NO.2）：5’- GGGGTTGGGGTTGTTGGGGTTGGGG -3’
enlg2（SEQ ID NO.3）：5’- GGGGTTGGGGATGTAGGGGTTGGGG -3’
enlg3（SEQ ID NO.4）：5’- GGGGTTGGGGCTGTCGGGGTTGGGG -3’
（注：加粗碱基为引入碱基）
如图1A所示，未加入β-乳球蛋白时，所有序列均具有催化TMB显色的能力，并且enlg2比原序列的催化能力高，而enlg3和enlg1与原序列相比催化能力降低。在四条不同G-四链体序列中，都基本呈现出溶液吸光度随β-乳球蛋白浓度变化而变化的规律，即β-乳球蛋白含量越高，吸光度越低，这表明序列具有靶标识别和信号输出的双重功能。此外，典型的反平行G-四链体结构会在圆二色光谱图中呈现260 nm左右处的负峰和290 nm左右处的正峰。由图2A-D可知，enlg1和enlg3具有G-四链体的反平行构象，而enlg2和org-G4的反平行构象被不同程度破环。综上，在该部分研究中，在org-G4中心环部区域引入了1对A碱基的enlg2展现了相对于其它序列更理想的β-乳球蛋白传感潜力。
在β-乳球蛋白适配体中心区域引入不同个数的T碱基对
随后，在org-G4（SEQ ID NO.1）的中心环部区域分别引入1、2、3、4对T碱基并分别命名为enlg1（SEQ ID NO.2），enlg6（SEQ ID NO.5），enlg7（SEQ ID NO.6）和enlg9（SEQ IDNO.7）。
同样采用圆二色光谱和TMB比色法对不同序列形成G-四链体结构的能力以及不同G-四链体序列与Hemin形成DNA仿生酶的酶活进行评估，具体方法同上。
实验中用到G-四链体序列如下：
org-G4（SEQ ID NO.1）：5’- GGGGTTGGGGTGTGGGGTTGGGG -3’
enlg1（SEQ ID NO.2）：5’- GGGGTTGGGGTTGTTGGGGTTGGGG -3’
enlg6（SEQ ID NO.5）：5’- GGGGTTGGGGTTTGTTTGGGGTTGGGG -3’
enlg7（SEQ ID NO.6）：5’- GGGGTTGGGGTTTTGTTTTGGGGTTGGGG -3’
enlg9（SEQ ID NO.7）：5’- GGGGTTGGGGTTTTTGTTTTTGGGGTTGGGG -3’
（注：加粗碱基为引入碱基）
如图1B所示，enlg6比原序列催化能力提高，而enlg7和enlg9与原序列相比，催化能力减弱。在三条新G-四链体序列中，均呈现了溶液吸光度随β-乳球蛋白浓度变化而变化的规律，即β-乳球蛋白含量越高，吸光度越低，这表明序列具有靶标识别和信号输出的双重功能。此外，由圆二色光谱图可知（图2E-G），engl6、enlg7和enlg9均不能形成的较为稳定的G-四链体反平行结构。综上，在该部分研究中，在org-G4中心环部区域引入了2对T碱基的enlg6展现了相对于其它序列更理想的β-乳球蛋白传感潜力。
β-乳球蛋白适配体的整合
最后，将前两步设计的优势序列进行整合，于org-G4（SEQ ID NO.1）的中心环部区域引入1对A-T串联碱基，命名为enlg2-pl3（SEQ ID NO.8）。
同样采用圆二色光谱和TMB比色法对不同序列形成G-四链体结构的能力以及不同G-四链体序列与Hemin形成DNA仿生酶的酶活进行评估，具体方法同上。
实验中用到G-四链体序列如下：
org-G4（SEQ ID NO.1）：5’- GGGGTTGGGGTGTGGGGTTGGGG -3’
enlg2（SEQ ID NO.3）：5’- GGGGTTGGGGATGTAGGGGTTGGGG -3’
enlg6（SEQ ID NO.5）：5’- GGGGTTGGGGTTTGTTTGGGGTTGGGG -3’
enlg2-pl3（SEQ ID NO.8）：5’- GGGGTTGGGGTATGTATGGGGTTGGGG -3’
（注：加粗碱基为引入碱基）
如图1C所示，enlg2-pl3序列展现出比enlg2和enlg6更好的催化能力，且呈现出溶液吸光度随β-乳球蛋白浓度变化而变化，即β-乳球蛋白含量越高，吸光度越低，这表明该序列具有靶标识别和信号输出的双重功能。此外，其圆二色光谱图在260 nm左右处出现正峰，说明该序列具有混合平行G-四链体结构（图2H）。综上，在设计部分的研究中，优势整合后的enlg2-pl3序列体现了相对于其它序列更好的β-乳球蛋白检测潜力。
实施例2. β-乳球蛋白生物传感器的检测性能评估
1. β-乳球蛋白生物传感器的检测原理
为了构建双功能的适配体生物传感器用于β-乳球蛋白检测，通过对原适配体org-G4进行改造设计，将其反平行G-四链体结构改造为反平行/平行混合G-四链体结构，设计后的适配体enlg2-pl3具有信号输出和靶标识别的双重功能（图3）。当检测体系中不存在β-乳球蛋白时，enlg2-pl3被K+离子诱导折叠成稳定的混合平行结构，随后在Hemin的存在下大部分形成平行G-四链体拓扑结构。只有当平行G-四链体与氯化血红素结合组装，复合物才具有过氧化氢酶活性，能够催化TMB底物反应致使溶液呈蓝色，加入硫酸溶液终止反应后，溶液变黄，依据溶液体系的吸光度变化进行信号输出。然而，在β-乳球蛋白存在时，体系中少量的反平行G-四链体结构被β-乳球蛋白结合。靶标与Hemin竞争结合位点，破环反平行G-四链体结构，致使Hemin无法被包裹在G-四链体结构，进而实现DNA仿生酶的组装。并且，由于反平行G-四链体结构在所有G-四链体构象中的比例降低，体系中原有的正平行G-四链体结构由于动态平衡效应的存在，会向反平行G-四链体结构形成的方向转化，进一步使溶液体系的颜色发生变化。基于此原理，体系中β-乳球蛋白的浓度梯度变化会导致溶液体系呈现比色吸光度梯度，即β-乳球蛋白浓度越高，溶液颜色越浅，吸光度的变化值越大。
β-乳球蛋白生物传感器的灵敏度评估
利用enlg2-pl3对已知浓度的β-乳球蛋白进行检测，依据溶液吸光度的变化制作标准曲线。将10 μL 60 μmol·L-1 enlg2-pl3与10 μL 60 μmol·L-1 Hemin和0，1，5，10，50，100，500，1000，4000 μg·mL-1 β-乳球蛋白和40 μL G-四链体孵育液混合，37℃孵育20min后，将30 μL 0.8 μmol·L-1 TMB显色液加入反应液中进行20 min催化反应。随后加入30μL 2 mol·L-1 H2SO4溶液终止催化反应。最后，利用酶标仪在450 nm处测量吸光度，基于加入β-乳球蛋白加入前后吸光度的变化值绘制标准曲线。
如图4所示，β-乳球蛋白生物传感器在1 μg·mL-1~4000 μg·mL-1范围内具有良好线性关系（R2=0.994），线性回归方程为Y=-0.2159 lgX + 0.9014，检出限低至0.19 μg·mL-1。
β-乳球蛋白生物传感器的选择性评估
选用牛奶中的乳蛋白或过敏原对β-乳球蛋白生物传感器的选择性进行评估。将10μL 60 μmol·L-1 enlg2-pl3与10 μL 60 μmol·L-1 Hemin和1000 μg·mL-1 牛血清白蛋白、酪蛋白和乳铁蛋白和40 μL G-四链体孵育液混合，37℃孵育20 min后，将30 μL 0.8 μmol·L-1 TMB显色液加入反应液中进行20 min催化反应。随后加入30 μL 2 mol·L-1 H2SO4溶液终止催化反应。最后，利用酶标仪在450 nm处测量溶液吸光度。
如图5所示，将吸光度变化值代入线性回归方程中，计算出的相应蛋白质浓度远小于100和1000 μg·mL-1 β-乳球蛋白组的检测浓度，表明该β-乳球蛋白生物传感器具有较好的选择性。
实施例3. β-乳球蛋白生物传感器的检测条件优化
优化了G-四链体孵育液的pH及其包含的K+、Na+浓度，且对TMB显色液的pH也进行了优化。依据溶液pH及离子含量的不同，将优化条件分为8组，从M1至M8命名。将10 μL 40 μmol·L-1 enlg2-pl3与10 μL 60 μmol·L-1 Hemin、10 μL 0，10，100，1000和4000 μg·mL-1β-乳球蛋白和40 μL G-四链体孵育液（具体成分见图6A）混合，37℃孵育20 min后，将30 μL0.8 μmol·L-1 TMB显色液（pH 3.9和8.4）加入反应液中进行20 min催化反应。随后加入30μL 2 mol·L-1 H2SO4溶液终止催化反应。最后，利用酶标仪在450 nm处测量吸光度。通过比较实验组和对照组之间的吸光度变化反映β-乳球蛋白加入前后的DNA仿生酶的活性变化。结果如图6所示，由图6B和图6C可知M8组的条件优化结果最好，即G-四链体孵育液中Na+和K+浓度均为100 mM，pH 7.0，TMB显色液pH 3.9。
此外，对Hemin与G-四链体序列的浓度比例也进行了优化。将10 μL 20 μmol·L-1enlg2-pl3与10 μL 2，5，10，20，40，80，200 μmol·L-1 Hemin、10 μL 蒸馏水和40 μL G-四链体孵育液混合，37℃孵育20 min后，将30 μL 0.8 μmol·L-1 TMB显色液加入反应液中进行20 min催化反应。随后加入30 μL 2 mol·L-1 H2SO4溶液终止催化反应。最后，利用酶标仪在450 nm处测量吸光度。通过比较实验组和对照组之间的吸光度变化反映β-乳球蛋白加入前后的DNA仿生酶的活性变化。结果如图7所示，由图可知Hemin与G-四链体序列的浓度比例为1：1时催化效果最好。
并且，还对TMB显色时间进行了优化。将10 μL 10 μmol·L-1 enlg2-pl3与10 μL10 μmol·L-1 Hemin、10 μL 0，10，100，1000和4000 μg·mL-1 β-乳球蛋白和40 μL G-四链体孵育液混合，37℃孵育20 min后，将30 μL 0.8 μmol·L-1 TMB显色液加入反应液中分别进行5，10，20和40 min催化反应。随后加入30 μL 2 mol·L-1 H2SO4溶液终止催化反应。最后，利用酶标仪在450 nm处测量吸光度。通过比较实验组和对照组之间的吸光度变化反映β-乳球蛋白加入前后的DNA仿生酶的活性变化。结果如图8所示，对于反应时间为20和40min的组别，基于其加入β-乳球蛋白加入前后吸光度的变化值绘制标准曲线（图8A、B）,由图可知催化反应时间为20 min最优。
实施例4 真实样品中β-乳球蛋白的检测
分别选用奶粉和鲜奶作为固体样品和液体样品。0.1 g奶粉用蒸馏水预稀释至1ml。奶粉和鲜奶样在40℃孵育30 min后离心20 min （6000 rpm），随后冰浴冷却15 min。去除凝乳后，加入HCl调节pH至4.7。然后，将含有β-乳球蛋白的上清液从酪蛋白和牛血清白蛋白沉淀中离心分离出来。随后将乳清样品用NaOH中和至pH 7.4，稀释20倍后分别在牛奶样品中添加10 μg·mL-1、100 μg·mL-1和1000 μg·mL-1 β-乳球蛋白。将10 μL 60 μmol·L-1enlg2-pl3与10 μL 60 μmol·L-1 Hemin、40 μL G-四链体孵育液和10 μL待测样品混合，37℃孵育20 min后，将30 μL 0.8 μmol·L-1 TMB显色液加入反应液中进行20 min催化反应。随后加入30 μL 2 mol·L-1 H2SO4溶液终止催化反应。最后，利用酶标仪在450 nm处测量吸光度，将加入β-乳球蛋白加入前后吸光度的变化值代入标准曲线，计算得到待测样品中β-乳球蛋白的含量，实现对β-乳球蛋白的定量检测。
如表1所示，基于β-乳球蛋白生物传感器的乳制品样品加标回收率比较理想，说明该生物传感器能够实现真实样品中的β-乳球蛋白定量检测。
表1 基于β-乳球蛋白生物传感器的乳制品样品加标实验
Figure 984670DEST_PATH_IMAGE001
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但是本发明不限于上述实施例，在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种用于检测β-乳球蛋白的双功能G-四链体变构生物传感器
<130> S010220113003Y
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggttgggg tgtggggttg ggg 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggggttgggg ttgttggggt tgggg 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggggttgggg atgtaggggt tgggg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggggttgggg ctgtcggggt tgggg 25
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggggttgggg tttgtttggg gttgggg 27
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggggttgggg ttttgttttg gggttgggg 29
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggggttgggg tttttgtttt tggggttggg g 31
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggggttgggg tatgtatggg gttgggg 27

Claims (10)

1.一种β-乳球蛋白的双功能G-四链体适配体，其特征在于，所述适配体的核酸序列选自如下序列：
enlg1：5’- GGGGTTGGGGTTGTTGGGGTTGGGG -3’ ，如SEQ ID NO.2所示；
enlg2：5’- GGGGTTGGGGATGTAGGGGTTGGGG -3’，如SEQ ID NO.3所示；
enlg3：5’- GGGGTTGGGGCTGTCGGGGTTGGGG -3’，如SEQ ID NO.4所示；
enlg6：5’- GGGGTTGGGGTTTGTTTGGGGTTGGGG -3’， 如SEQ ID NO.5所示；
enlg7：5’- GGGGTTGGGGTTTTGTTTTGGGGTTGGGG -3’ ， 如SEQ ID NO.6所示；
enlg9：5’- GGGGTTGGGGTTTTTGTTTTTGGGGTTGGGG -3’ ， 如SEQ ID NO.7所示；
enlg2-pl3：5’- GGGGTTGGGGTATGTATGGGGTTGGGG -3’ ， 如SEQ ID NO.8所示。
2.如权利要求1所述的β-乳球蛋白的双功能G-四链体适配体，其特征在于，所述适配体的核酸序列为enlg2-pl3：5’- GGGGTTGGGGTATGTATGGGGTTGGGG -3’，如SEQ ID NO.8所示。
3.如权利要求1所述的β-乳球蛋白的双功能G-四链体适配体在β-乳球蛋白检测中的应用。
4.一种用于检测β-乳球蛋白的双功能G-四链体变构生物传感器，其特征在于，（1）β-乳球蛋白双功能G-四链体适配体设计；（2）β-乳球蛋白生物传感器反应条件优化；（3）β-乳球蛋白的检测；
所述β-乳球蛋白双功能G-四链体适配体设计是指对β-乳球蛋白的适配体通过中心区域碱基设计赋予适配体双重功能；
所述β-乳球蛋白生物传感器反应条件优化包括G四链体形成条件以及信号输出条件；
所述β-乳球蛋白的检测是基于β-乳球蛋白双功能G-四链体适配体在靶标存在时发生构象变化，进而对G-四链体/Hemin DNA仿生酶的过氧化氢酶活产生影响，使得催化TMB显色的溶液呈现梯度变化，实现β-乳球蛋白的检测。
5.根据权利要求4所述的β-乳球蛋白生物传感器，其特征在于，中心区域碱基设计是指β-乳球蛋白适配体经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加使其具有靶向识别和信号输出的双重功能。
6.根据权利要求4所述的β-乳球蛋白生物传感器，其特征在于，所述G-四链体适配体为权利要求1中适配体的核酸序列。
7.根据权利要求4所述的β-乳球蛋白生物传感器，其特征在于，反应条件优化包括G四链体形成条件以及信号输出条件；
所述G四链体形成条件为10 mmol·L-1 Tris buffer中增加10~100 mmol·L-1 K+和10~100 mmol·L-1 Na+，pH调节为3.8~8.4；
所述信号输出的条件为G-四链体与Hemin浓度比例：0.1~2，TMB显色液pH 3.9~8.4，催化反应孵育时间为5~40 min。
8.根据权利要求4所述的β-乳球蛋白生物传感器，其特征在于，相较于牛血清白蛋白、酪蛋白和乳铁蛋白，该传感器具有β-乳球蛋白选择性。
9.根据权利要求4~8任一所述的生物传感器在β-乳球蛋白检测方法开发中的应用。
10.根据权利要求4~8任一所述的生物传感器在β-乳球蛋白食品安全检测试剂盒中的应用。
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