CN114317543B - 可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体及其应用 - Google Patents

Abstract

本公开提供一种可特异性识别α‑乳白蛋白的核酸适配体及其应用，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1所示，或所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.2所示。该核酸适配体相比于蛋白抗体具有更高的亲和特异性，且无免疫原性、能够化学合成、分子量小且性质稳定、能够特异性结合α‑乳白蛋白，该核酸适配体以α‑乳白蛋白为靶标，可实现过敏原α‑乳白蛋白定性和定量的快速检测，成本低、特异性高且适用范围广，还可以基于该核酸适配体构建各种用于检测α‑乳白蛋白的生物传感器。

Description

可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体及其应用

技术领域

本公开涉及生物技术领域，尤其涉及一种可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体及其应用。

背景技术

α-乳白蛋白是牛乳清中第二大丰富的蛋白质，占乳清成分的25％，在乳中浓度大约为1mg/mL。全部分子质量为14186Da，属于小分子蛋白质。研究显示，在牛乳过敏患者当中，约有27.6％-62.8％对α-乳白蛋白过敏。对牛乳及乳制品中过敏原α-乳白蛋白的高灵敏度检测，为易过敏群体提供必要的饮食指导具有重要的意义。

目前牛乳过敏原的检测方法有很多种，例如：酶联免疫法、气相色谱、高效液相色谱等方法。仪器方法虽然检测的灵敏度较高，检测结果准确，但通常需要昂贵的大型仪器，且前处理复杂，需要专业的操作人员进行分析检测，难以满足对食品进行现场、实时、快速、便携化检测的需要。目前的酶联免疫法都是依赖于抗体做的检测试剂盒，虽然有一些可以做到快速简单的检测，但是抗体制备过程比较复杂，批次之间有差异。

因此，亟需能够高效且高灵敏度检测α-乳白蛋白的检测技术。

发明内容

有鉴于此，本公开的目的在于提出一种可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体及其应用。

基于上述目的，本公开第一方面提供了一种可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1所示。

基于相同目的，本公开第二方面提供了一种可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.2所示。

基于相同目的，本公开第三方面提供了一种可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的序列与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列具有60％以上的同源性；

或，

所述核酸适配体的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列的杂交序列；

或，

所述核酸适配体的序列为由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列转录的RNA序列。

基于相同目的，本公开第四方面提供了如本公开第一方面、第二方面或第三方面所述的可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体在制备α-乳白蛋白检测试剂盒或α-乳白蛋白分子探针中的应用。

基于相同目的，本公开第五方面提供了应用本公开第一方面、第二方面或第三方面所述的可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体的α-乳白蛋白的检测方法，包括如下步骤：

S1、对核酸适配体进行FAM荧光基团标记；

S2、将标记后的核酸适配体与氧化石墨烯按照1:20的质量比混合，避光反应30～35min后，加入待测样品，混匀，反应30～35min后测定上清液荧光值。

基于相同目的，本公开第六方面提供了一种用于检测α-乳白蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括本公开第一方面、第二方面或第三方面所述的可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体。

从上面所述可以看出，本公开提供的可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体及其应用，该核酸适配体相比于蛋白抗体具有更高的亲和特异性，且无免疫原性、能够化学合成、分子量小且性质稳定、能够特异性结合α-乳白蛋白，该核酸适配体以α-乳白蛋白为靶标，可实现过敏原α-乳白蛋白定性和定量的快速检测，成本低、特异性高且适用范围广，还可以基于该核酸适配体构建各种用于检测α-乳白蛋白的生物传感器。

附图说明

为了更清楚地说明本公开或相关技术中的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本公开实施例提供的Capture-SELEX筛选流程图；

图2为本公开实施例提供的核酸适配体筛选过程中回收率富集率的变化图；

图3为本公开实施例提供的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的二级结构图；

图4为本公开实施例提供的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2利用GO的荧光共振能量转移检测亲和力的非线性拟合曲线图；

图5为本公开实施例提供的截短核酸适配体的特异性分析示意图；

图6为本公开实施例提供的检测标准曲线；

图7为本公开实施例提供的序列为SEQ ID No.3的核酸适配体的亲和力的非线性拟合曲线和特异性验证。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。

需要说明的是，除非另外定义，本公开实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

牛乳蛋白过敏(cow milk protein allergy,CMPA)是指由牛奶蛋白引起的异常或过强的免疫反应，过敏者会出现荨麻疹、血管性水肿、呕吐或急性特应性皮炎等症状影响健康。流行病学调查显示，高达8％的婴幼儿和1％-2％的成人对牛乳过敏，近年来由于生活方式的改变、微生物的暴露、饮食习惯的改变等多种因素，婴幼儿的肠道免疫功能越来越低，婴幼儿牛乳过敏发生率正呈逐年上升的趋势。酪蛋白(Casein)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)和α-乳白蛋白(α-lactalbumin)被认为是牛奶中主要的过敏原。

α-乳白蛋白是牛乳清中第二大丰富的蛋白质，占乳清成分的25％，在乳中浓度大约为1mg/mL。全部分子质量为14186Da，属于小分子蛋白质。研究显示，在牛乳过敏患者当中，约有27.6％-62.8％对α-乳白蛋白过敏。对牛乳及乳制品中过敏原α-乳白蛋白的高灵敏度检测，为易过敏群体提供必要的饮食指导具有重要的意义。

目前牛乳过敏原的检测方法有很多种，例如：酶联免疫法、气相色谱、高效液相色谱等方法。仪器方法虽然检测的灵敏度较高，检测结果准确，但通常需要昂贵的大型仪器，且前处理复杂，需要专业的操作人员进行分析检测，难以满足对食品进行现场、实时、快速、便携化检测的需要。目前的酶联免疫法都是依赖于抗体做的检测试剂盒，虽然有一些可以做到快速简单的检测，但是抗体制备过程比较复杂，批次之间有差异。

因此，亟需能够高效且高灵敏度检测α-乳白蛋白的检测技术。

为了解决上述问题，本公开提供了一种可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的序列为5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATGGTGCTGCGAACTTAACGCAAGATAGGCTGGACGCGAGTCCCCTATGCGTGCTACCGTG-3'(SEQ ID NO.1)。经试验证明，序列为SEQ ID No.1的核酸适配体的解离常数Kd值为92.6±18.0，对α-乳白蛋白具有良好的特异性。

对序列为SEQ ID No.1的核酸适配体进行二级结构预测，发现其结构中含有典型的茎环结构，而且核酸适配体与靶标结合中依赖核酸适配体的二级结构，茎环属于二级结构中的一种，是茎环结构的形成是核酸适配体呈现亲和性的结构基础，含有典型的茎环结构表明该核酸适配体具有较好的稳定性；还发现其具有两个可能结合的发夹结构，且5’端形成的发夹结构是最有可能的结合位点，可以在此进行了截短优化。

本公开还提供了一种可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的序列为5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATGGTGCTGCGAA-3'(SEQ ID NO.2)。经试验证明，序列为SEQID No.2的核酸适配体的解离常数Kd值为14.05±4.2，相对于序列为SEQ ID No.1的核酸适配体，其结合亲和力提高了约6倍，且该核酸适配体能很好区分乳中其他蛋白，例如β-乳球蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白、IgG等，对α-乳白蛋白具有良好的特异性。对序列为SEQ ID No.2的核酸适配体进行二级结构预测，发现其结构中也含有典型的茎环结构，序列为SEQ IDNo.2的核酸适配体也具有较好的稳定性。

本公开还提供了一种可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的序列与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列具有60％以上的同源性；

或，

所述核酸适配体的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列的杂交序列；

或，

所述核酸适配体的序列为由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列转录的RNA序列。

在一些可能的实施方式中，所述核酸适配体的核苷酸序列上可以结合有标记物。所述核酸适配体可实现过敏原α-乳白蛋白定性和定量的快速检测，具有成本低，特异性高和适用范围广等优点，作为一种过敏原识别分子在食品加工、食品管理及营养规划等领域中用途广泛。

优选地，所述标记物可以包括荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA和酶中的一种或多种。

在一些可能的实施方式中，所述核酸适配体的核苷酸序列可以被修饰。利用该核酸适配体修饰不同的分子基团，可以构建各种生物传感器用于检测食品中的α-乳白蛋白。

优选地，所述修饰可以包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的一种或多种。

在一些可能的实施方式中，所述核酸适配体的核苷酸序列可以被衍生化。

优选地，所述衍生化可以包括将核苷酸序列的骨架衍生为硫代磷酸酯骨架序列，或将核苷酸序列衍生为肽核酸。

本公开还提供了可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体在制备α-乳白蛋白检测试剂盒或α-乳白蛋白分子探针中的应用。

本公开还提供了应用可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体的α-乳白蛋白的检测方法，可以包括如下步骤：

S1、对核酸适配体进行FAM荧光基团标记；

S2、将标记后的核酸适配体与氧化石墨烯按照1:20的质量比混合，避光反应30～35min后，加入待测样品，混匀，反应30～35min后测定上清液荧光值。

氧化石墨烯(GO)具有易于表面修饰、导电性好、表面积大和水分散性良好等优点，且可以通过碱基和GO之间的疏水作用和π-π堆积相互作用将ssDNA强烈地吸附在GO表面，该特性被广泛应用于适体与靶标结合的分析。

核酸适配体探针末端标记FAM荧光基团，当无α-乳白蛋白存在时，荧光标记的核酸适配体被GO吸附并发生荧光共振能量转移淬灭其荧光信号；当有α-乳白蛋白存在时，适配体与α-乳白蛋白结合形成复合物，从GO上脱落，引起荧光的重新恢复。因此，荧光信号随着α-乳白蛋白的增加而增加，可以通过测量荧光信号的恢复来检测牛乳及乳制品中的过敏原α-乳白蛋白。

经验证，应用可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体的α-乳白蛋白的检测方法能够检测到α-乳白蛋白的最低检测限位0.27μg/mL；该检测方法的标准曲线为：y＝20.973x+71.191，R²＝0.995。

在一些可能的实施方式中，所述步骤S2中标记后的核酸适配体的浓度为100nM。

本公开还提供了一种用于检测α-乳白蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体。

下述通过具体实施例和附图，对本公开进行详细说明。

以下实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。

实施例1、可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体的筛选

1、合成下述序列所示的随机ssDNA文库和引物

随机起始单链ssDNA文库：

5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-40N-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'

生物素化的互补短链：5’-Biotin-AGCACGCATAGG-3’

上游引物：5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3'

下游引物：5'-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'

5'-磷酸化标记的下游引物：5'-P-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'

其中，“40N”表示由40个任意的核苷酸碱基连接而成的序列，该文库和引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

文库和引物分别用由TE缓冲液(PH＝8.0：10mMTris-HCl，1mM EDTA)配制成的浓度为100μM的贮存液存于-20℃备用。

2、Capture-SELEX筛选特异性核酸适配体

图1是本公开实施例提供的Capture-SELEX筛选流程图，如图1所示，Capture-SELEX筛选过程主要包括四个步骤：结合、分离、洗脱、扩散。体外合成寡核苷酸文库，两端是固定的引物序列，中间是随机序列，将随机文库与靶标混合孵育，除去未结合或结合力弱的寡核苷酸，获得寡核苷酸-靶标复合物，然后以此为模板进行PCR扩增，富集后制备单链次级文库进行下一轮筛选。经过多轮的筛选和扩增，逐渐淘汰亲和力低的寡核苷酸，最终通过测序及鉴定得到能与靶标高亲和力和特异性结合的核酸适配体。

下述对Capture-SELEX筛选特异性核酸适配体的过程进行详细说明。

(1)文库预处理：将初始ssDNA文库或次级文库和生物素化互补短链以1：1.5的比例混合溶于100μL的结合缓冲液BB(pH 8.0：100mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/LMgCl₂，5mmol/L KCl，1mmol/L CaCl₂，0.02％Tween 20)中，95℃热水浴处理5min后，然后缓慢降温至室温至两者充分互补。

(2)文库的固定：将上述互补混合物与链霉亲和素的磁珠按照1:300的质量比混合后，在37℃、150rpm下反应2h，利用生物素与链霉亲和素的强结合作用将文库固定在磁珠上。

(3)孵育结合：将上述固定化的文库与50μg/mLα-乳白蛋白在300μL体系下进行孵育，孵育条件为37℃、150rpm，利用外加磁场进行分离，计算每一筛选循环的回收率。在第六轮、第八轮和第十轮增加反筛过程，与靶标孵育之前，在体系里引入共存物质(β-乳球蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白、IgG)以增加筛选的压力，获得更好亲和性和特异性的序列。

(4)PCR扩增：以磁分离的上清液为模板进行PCR扩增。PCR扩增反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s；72℃再延伸5min，25个循环。

PCR扩增反应的体系为：

(5)PCR产物的纯化：在PCR产物中加入1/10原体积的3M醋酸钠(PH＝5.2)溶液及核酸共沉剂和2.5倍体积的无水乙醇(-20℃下预冷)均匀混合。于4℃，12000rpm，离心15min，弃上清，再加入1mL70％无水乙醇(-20℃下预冷)，充分洗涤沉淀后再次离心，弃去上清，干燥后的沉淀用TE缓冲液溶解。

(6)琼脂糖凝胶电泳验证：每轮筛选得到的次级文库经过PCR扩增后，用4％体积分数的琼脂糖凝胶电泳进行检测，与marker比较所得条带大小是否约为80bp。

琼脂糖凝胶电泳步骤如下：根据上样量的个数和目的条带大小用1×TAE溶液配制适当体积浓度的琼脂糖溶液，放入微波炉中加热1分钟至琼脂糖溶解，稍冷却后倒入制胶槽中，插上梳子；待胶凝固后，垂直拔出梳子。把胶放入电泳槽1×TAE核酸电泳缓冲液中，样品和上样缓冲液按5:1的体积比混合后上样，电压100V，45min；凝胶成像系统中观察结果。

(7)ss DNA次级文库的制备：通过Lambda核酸外切酶酶切去除PCR产物中的5’磷酸化标记反义链得到ssDNA。向纯化的PCR产物中加入5000U/mL的Lambda核酸外切酶及1/10原体积的Lambda核酸外切酶缓冲液。反应条件为：37℃水浴1h进行酶切，75℃水浴10min终止反应。用含7M尿素的8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证酶切是否完全。

(8)ss DNA次级文库的纯化：在酶切产物中加入1/10原体积的3M醋酸钠(PH＝5.2)溶液及核酸共沉剂和2.5倍体积的无水乙醇(-20℃下预冷)均匀混合。于4℃，12000rpm，离心15min，弃上清，再加入1mL70％无水乙醇(-20℃下预冷)，充分洗涤沉淀后再次离心，弃去上清，干燥后的沉淀用TE缓冲液溶解作为下一轮筛选的次级文库，并用微量紫外分光光度计测定其核酸浓度。

(9)重复多轮筛选：将步骤(8)中收集到的ssDNA次级文库，代替步骤(1)中的初始文库，重复以上步骤(1)-(9)。

为了获得对靶标α-乳白蛋白具有更高亲和力的ssDNA，随着SELEX筛选轮数的增加，逐渐增大筛选压力。如表1所示，ssDNA文库的用量由1000pmol逐渐减少至100pmol，而文库和α-乳白蛋白的孵育时间由120min逐渐缩短至45min。

表1.Capture-SELEX筛选条件

结果如图2所示，由图2可以看出，随着筛选轮数的增加，与α-乳白蛋白结合的ssDNA也越来越多，回收率逐渐增大，表明能与α-乳白蛋白结合ssDNA得到富集，未能与α-乳白蛋白结合或结合能力弱的适体已经被淘汰。第六轮回收率的减少是由于加入了酪蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、IgG蛋白进行了反筛，增强了适配体的特异性。第八轮和第十轮再次反筛，回收率不再降低。后续又进行了5轮正向筛选后，结束筛选过程，从投入文库中能回收50％以上的ssDNA。

3、高通量测序及序列分析

将最后一轮筛选产物通过PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，对80bp条带进行切胶回收，然后送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行高通量测序。用Mage 6软件对测序结果中出现次数占比较多的序列进行比对分析，并预测序列的二级结构。从不同家族中挑选出能级较低、结构稳定的代表序列，合成带5′-FAM标记，进行下一步的亲和力鉴定。通过对候选ss DNA间的共有序列及二级结构进行分析，预测最有可能结合的茎环位置进行截短优化。二级结构通过UNAFold(http://www.unafold.org/)进行预测，结果如图3所示。

由图3可以看出，通过对全长的核酸适配体SEQ ID No.1进行了二级结构的预测，发现具有两个可能结合的发夹结构。由于本公开所采用的Capture-SELEX方法以短链互补的形式固定了文库的3’端，推测5’端形成的发夹结构是最有可能的结合位点，因此进行了截短优化，从全长80个碱基截短到30个碱基序列。

4、候选ss DNA的亲和力鉴定

将5′-FAM标记ss DNA序列溶液进行加热后缓慢降温的折叠处理，随后不同浓度α-乳白蛋白分别与固定浓度(100nmol/L)的ssDNA序列3孵育2h，反应总体积为300μL，同时设置不加入α-乳白蛋白作为阴性对照，结束反应后，按照GO与ssDNA质量比为20:1加入GO，继续避光孵育60min，13000rpm离心，测定上清液的荧光值(Ex＝492nm，Em＝522nm)。利用GraphPad Prism 6软件非线性拟合确定每条序列的解离常数Kd值。全长及截短后的ssDNA核酸适配体的非线性拟合曲线如图4所示，序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2及对应Kd值如表2所示，说明经过截短优化后的ssDNA核酸适配体与α-乳白蛋白的结合能力明显提高。

表2.SEQ ID No.1和SEQ ID No.2序列及其Kd值

由表2和图4结果可知，全长序列SEQ ID No.1的亲和力Kd值为92.6±18.0nM，而截短优化后的序列SEQ ID No.2的亲和力Kd值为14.05±4.2nM，去掉冗余序列使得结合亲和力提高了约6倍。

5、截短后核酸适配体对α-乳白蛋白的特异性分析

100μM的核酸适配体探针候选序列分别与100μg/mL酪蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、IgG及50μg/mL的α-乳白蛋白混合，37℃避光孵育2h，并用结合缓冲液作为阴性对照。随后，按照GO与ssDNA质量比为20:1加入GO，继续避光孵育60min，13000rpm离心，测定上清液的荧光值(Ex＝492nm，Em＝522nm)。通过荧光值来评估截短核酸适配体对α-乳白蛋白的特异性，每个样品平行测定3次，并避光操作，结果见图5。

由图5可见，靶标α-乳白蛋白的荧光强度比酪蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、IgG蛋白及空白对照组的荧光强度高出约5倍，表明该截短后核酸适配体的特异性良好。

与相关技术中筛选蛋白质的核酸适配体采用靶标固定技术相比，通过文库固定的方法筛选到了α-乳白蛋白的适配体，有效的克服了传统方法的空间位阻效应以及靶标固定引起的构象的改变缺陷，可在体外筛选，筛选周期短、稳定性强、合成方便且易于标记各种修饰基团，操作简便、筛选过程成本低，可长期保存使用。

实施例2、利用截短后获得的短链核酸适配体SEQ ID No.2建立检测α-乳白蛋白的方法

将100nM核酸适配体与GO按照1:20的质量比混合后避光反应30min，再向体系中加入一系列浓度(0.3125μg/mL、0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL)的α-乳白蛋白，测定上清液的荧光值(Ex＝492nm，Em＝522nm)。以荧光强度值为纵坐标，α-乳白蛋白浓度为横坐标，从而实现对α-乳白蛋白的灵敏检测。结果如图6所示，该方法检测方法在α-乳白蛋白浓度为0.3125-10.0μg/mL内线性范围良好，能检测到α-乳白蛋白的最低检测限为0.27μg/mL，标准曲线为y＝20.973x+71.191，R²＝0.995。

利用文库筛选得到的ssDNA核酸适配体具有较好的亲和力及特异性，且本公开实施例的ssDNA核酸适配体结构稳定，在进行基团标记及修饰后，仍具有较好的亲和力和特异性，可应用于α-乳白蛋白检测试剂盒中。

对比例

合成序列为5'-GCA GGA CAC CGT AAC CCT AAC ACG TAC GGG GCA TTT ATG GCATAG CTC TTC CTC CCT GC-3'(SEQ ID No.3)的对照核酸适配体。

利用实施例1中同样的方法测定序列为SEQ ID No.3的对照核酸适配体对α-乳白蛋白的亲和力和特异性，结果如图7所示。

由图7可以看出，序列为SEQ ID No.3的对照核酸适配体的亲和力Kd值为268.7±45.2nmol/L相较序列为SEQ ID No.2的核酸适配体的亲和力Kd值增加了约20倍，且特异性较差，不能更好的区分牛奶中酪蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白和IgG蛋白等。

本公开提供的可特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体，相比于蛋白抗体具有更高的亲和特异性，且无免疫原性、能够化学合成、分子量小且性质稳定、能够特异性结合α-乳白蛋白，该核酸适配体以α-乳白蛋白为靶标，可实现过敏原α-乳白蛋白定性和定量的快速检测，成本低、特异性高且适用范围广，还可以基于该核酸适配体构建各种用于检测α-乳白蛋白的生物传感器。通过文库固定的方法筛选到了该α-乳白蛋白的核酸适配体，有效的克服了传统方法的空间位阻效应以及靶标固定引起的构象的改变缺陷，可在体外筛选，筛选周期短、稳定性强、合成方便且易于标记各种修饰基团，操作简便、筛选过程成本低，可长期保存使用。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本公开实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本公开实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本公开实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.2所示；所述核酸适配体的二级结构具有茎环结构。

2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物；

所述标记物包括荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、si RNA和酶中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰；

所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列被衍生化；

所述衍生化包括将核苷酸序列的骨架衍生为硫代磷酸酯骨架序列，或将核苷酸序列衍生为肽核酸。

5.如权利要求1所述的特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体在制备α-乳白蛋白检测试剂盒或α-乳白蛋白分子探针中的应用。

6.一种应用权利要求1所述的特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体的α-乳白蛋白的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、对核酸适配体进行FAM荧光基团标记；

S2、将标记后的核酸适配体与氧化石墨烯按照1:20的质量比混合，避光反应30～35min后，加入待测样品，混匀，反应30～35min后测定上清液荧光值。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中的标记后的核酸适配体的浓度为100nM。

8.一种用于检测α-乳白蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的特异性识别α-乳白蛋白的核酸适配体。