CN114231534B - 可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体及其应用 - Google Patents
可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本公开提供一种可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体及其应用，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1所示，或所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.2所示。该核酸适配体相比于蛋白抗体具有更高的亲和特异性，且无免疫原性、能够化学合成、分子量小且性质稳定、能够特异性结合氟苯尼考及氟苯尼考胺，该核酸适配体以氟苯尼考及氟苯尼考胺为靶标，可实现氟苯尼考及氟苯尼考胺定性和定量的快速检测，成本低、特异性高且适用范围广，还可以基于该核酸适配体构建各种用于检测氟苯尼考和/或氟苯尼考胺的生物传感器。
Description
技术领域
本公开涉及生物技术领域，尤其涉及一种可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体及其应用。
背景技术
目前，对于氟苯尼考和氟苯尼考胺的检测方法以免疫分析法和气相色谱-质谱联用法为主；免疫分析法适用于现场检测但抗体的制备需要实验动物，很难被重复生产；气相色谱-质谱联用法可用于确证检测，但前期处理过程复杂，需进行衍生化处理。。
因此，亟需操作简便且能够高效、高灵敏度检测氟苯尼考及氟苯尼考胺的检测技术。
发明内容
有鉴于此，本公开的目的在于提出一种可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体及其应用。
基于上述目的，本公开第一方面提供了一种可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1所示。
基于相同目的，本公开第二方面提供了一种可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.2所示。
基于相同目的，本公开第三方面提供了一种可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体，所述核酸适配体的序列与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列具有60％以上的同源性；
或，
所述核酸适配体的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列的杂交序列；
或，
所述核酸适配体的序列为由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列转录的RNA序列。
基于相同目的，本公开第四方面提供了如本公开第一方面、第二方面或第三方面所述的可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体在制备氟苯尼考和/或氟苯尼考胺检测试剂盒或氟苯尼考和/或氟苯尼考胺分子探针中的应用。
基于相同目的，本公开第五方面提供了应用本公开第一方面、第二方面或第三方面所述的可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体的氟苯尼考和/或氟苯尼考胺的检测方法，所述方法包括：将核酸适配体与胶体金避光反应30～35min，然后向反应后的体系中加入待测样品，混匀，于37～40℃避光反应60～70min后测定溶液的吸光度值。
基于相同目的，本公开第六方面提供了一种用于检测氟苯尼考和/或氟苯尼考胺的试剂盒，所述试剂盒包括本公开第一方面、第二方面或第三方面所述的可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体。
从上面所述可以看出，本公开提供的可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体及其应用，该核酸适配体相比于蛋白抗体具有更高的亲和特异性，且无免疫原性、能够化学合成、分子量小且性质稳定、能够特异性结合氟苯尼考及氟苯尼考胺，该核酸适配体以氟苯尼考及氟苯尼考胺为靶标，可实现氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺定性和定量的快速检测，成本低、特异性高且适用范围广，还可以基于该核酸适配体构建各种用于检测氟苯尼考和/或氟苯尼考胺的生物传感器；该核酸适配体作为抗生素识别分子为食品加工、食品管理及营养规划等领域中的重要工具。
附图说明
为了更清楚地说明本公开或相关技术中的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本公开实施例提供的甲苯磺酰基磁珠与氟苯尼考胺共价偶联(A)及MB-SELEX筛选流程图(B)；
图2为本公开实施例提供的核酸适配体筛选过程中回收率富集率的变化图；
图3为本公开实施例提供的核酸适配体SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的二级结构预测图；
图4为本公开实施例提供的核酸适配体SEQ ID No.1和SEQ ID No.2利用GO的荧光共振能量转移检测亲和力的非线性拟合曲线图；
图5为本公开实施例提供的核酸适配体SEQ ID No.2的结合力分析示意图；
图6为本公开实施例提供的核酸适配体SEQ ID No.2的特异性分析示意图；
图7为本公开实施例提供的核酸适配体SEQ ID No.2用于氟苯尼考检测的标准曲线。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本公开实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
氟苯尼考(Florfenicol，FF)作为一种广谱类抗菌药在临床上被广泛应用，但其半衰期长，在动物组织中残留会使细菌产生耐药性，且具有胚胎毒性，从而严重危害消费者的健康与安全。氟苯尼考胺(Florfenicol amine hydrochloride，FFA)是氟苯尼考的主要代谢物，不具有任何抗菌活性，用作监测氟苯尼考动物和环境残留物的标记物。为了确保食用组织中氟苯尼考残留的存在，最大残留限量标准设定为氟苯尼考和氟苯尼考胺的总和。
目前，对于氟苯尼考和氟苯尼考胺的检测方法以免疫分析法和气相色谱-质谱联用法为主。免疫分析法适用于现场检测但抗体的制备需要实验动物，很难被重复生产。气相色谱-质谱联用法可用于确证检测，但前期处理过程复杂，需进行衍生化处理。
因此，亟需操作简便且能够高效、高灵敏度检测氟苯尼考及氟苯尼考胺的检测技术。
为了解决上述问题，本公开提供了一种可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体，所述核酸适配体的序列为5'-GCTGTGTGACTCCTGCAAACGGCCAGTGGGTGGGGCGGGTGGCGGCC GGTTGTTTCTATGCGCAGCTGTATCTTGTCTCC-3'(SEQ ID NO.1)。经试验证明，序列为SEQID No.1的核酸适配体的解离常数Kd值为34.65±10.07nmol/L，对氟苯尼考及氟苯尼考胺具有良好的特异性。
对序列为SEQ ID No.1的核酸适配体进行二级结构预测，发现其结构中含有典型的茎环结构，而且核酸适配体与靶标结合中依赖核酸适配体的二级结构，茎环结构属于二级结构中的一种，茎环结构的形成是核酸适配体呈现亲和性的结构基础，含有典型的茎环结构表明该核酸适配体具有较好的稳定性；还发现该核酸适配体的序列中间具有可能结合的发夹结构，可以在此进行截断优化。
本公开还提供了一种可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体，所述核酸适配体的序列为5'-ACGGCCAGTGGGTGGGGCGGGTGGCGGCCGGTTGTTTCTATGC-3'(SEQ IDNO.2)。经试验证明，序列为SEQ ID No.2的核酸适配体的解离常数Kd值为4.76±3.09，相对于序列为SEQ ID No.1的核酸适配体，其结合亲和力提高了约8倍，且该核酸适配体能很好区分其他抗生素，例如氯霉素、甲砜霉素等，对氟苯尼考及氟苯尼考胺具有良好的特异性。对序列为SEQ ID No.2的核酸适配体进行二级结构预测，发现其结构中也含有典型的茎环结构，序列为SEQ ID No.2的核酸适配体也具有较好的稳定性；
本公开中，序列为SEQ ID No.1的核酸适配体和序列为SEQ ID No.2的核酸适配体的5'端或者3'端均可标记FAM、巯基和生物素，可实现氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺定性和定量的快速检测。
本公开还提供了一种可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体，所述核酸适配体的序列与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列具有60％以上的同源性；
或，
所述核酸适配体的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列的杂交序列；
或，
所述核酸适配体的序列为由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列转录的RNA序列。
氟苯尼考胺是氟苯尼考的酰胺键断裂形成氨基后的代谢产物，氟苯尼考胺和氟苯尼考的其他部分结构均相同，因此，核酸适配体能够同时特异性识别氟苯尼考和氟苯尼考胺。
氟苯尼考的结构式为：
氟苯尼考胺的结构式为：
在一些可能的实施方式中，所述核酸适配体的核苷酸序列上可以结合有标记物。所述核酸适配体可实现氟苯尼考及氟苯尼考胺定性和定量的快速检测，具有成本低，特异性高和适用范围广等优点，作为一种抗生素识别分子在食品加工、食品管理及营养规划等领域中用途广泛。
优选地，所述标记物可以包括荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA和酶中的一种或多种。
在一些可能的实施方式中，所述核酸适配体的核苷酸序列可以被修饰。利用该核酸适配体修饰不同的分子基团，可以构建各种生物传感器用于检测氟苯尼考及氟苯尼考胺。
优选地，所述修饰可以包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的一种或多种。
在一些可能的实施方式中，所述核酸适配体的核苷酸序列可以被衍生化。
优选地，所述衍生化可以包括将核苷酸序列的骨架衍生为硫代磷酸酯骨架序列，或将核苷酸序列衍生为肽核酸。
本公开还提供了可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体在制备氟苯尼考和/或氟苯尼考胺检测试剂盒或氟苯尼考和/或氟苯尼考胺分子探针中的应用。
本公开还提供了应用可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体的氟苯尼考和/或氟苯尼考胺的检测方法，该方法可以包括：将核酸适配体与胶体金避光反应30～35min，然后向反应后的体系中加入待测样品，混匀，于37～40℃避光反应60～70min后测定溶液的吸光度值。
金纳米粒子具有独特的光学性能和极高的摩尔消光系数，可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体可以通过核酸碱基上N和O键与金纳米的范德华力及疏水作用而结合。基于免修饰金纳米粒子和无标记核酸适配体建立的可视化检测氟苯尼考和/或氟苯尼考胺的原理为：核酸适配体可保护金纳米粒子免受盐诱导的聚集作用，使金纳米粒子呈分散状态而显红色；当有氟苯尼考和/或氟苯尼考胺存在时，核酸适配体与氟苯尼考和/或氟苯尼考胺特异结合，导致金纳米粒子失去保护而聚集，肉眼可观察到溶液由红色变为蓝色；通过可见分光光度法可检测出溶液在520nm和650nm处吸光度值的变化，A650/A520的值越大，待测样品中的氟苯尼考和/或氟苯尼考胺含量越多。
经验证，应用可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体的氟苯尼考的检测方法能够检测到氟苯尼考的最低检测限位0.00128ng/mL；该检测方法的标准曲线为：y＝0.0098ln(x)+0.7197，R2＝0.9904。
在一些可能的实施方式中，所述核酸适配体的浓度为1μM，所述胶体金的粒径为20nm，所述核酸适配体和所述胶体金的体积比为4:5。
本公开还提供了一种用于检测氟苯尼考和/或氟苯尼考胺的试剂盒，所述试剂盒包括可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体。
下述通过具体实施例和附图，对本公开进行详细说明。
以下实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。
实施例1、可特异性识别氟苯尼考胺的核酸适配体的筛选
1、合成下述序列所示的随机ssDNA文库和引物
5'-GCTGTGTGACTCCTGCAA-N43-GCAGCTGTATCTTGTCTCC-3'
上游引物：5'-GCTGTGTGACTCCTGCAA-3'
下游引物：5'-PHO-GGAGACAAGATACAGCTGC-3'
其中，“N43”表示43个任意的核苷酸碱基连接而成的序列，该文库和引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
文库和引物分别用由TE缓冲液(PH＝8.0：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/LEDTA)配制成的浓度为100μM的贮存液存于-20℃备用。
2、MB-SELEX筛选特异性核酸适配体
图1是本公开实施例提供的甲苯磺酰基磁珠与氟苯尼考胺共价偶联(A)及MB-SELEX筛选流程图(B)；如图1所示，MB-SELEX筛选过程主要包括四个步骤：结合、分离、洗脱、扩增。体外合成寡核苷酸文库，两端是固定的引物序列，中间是随机序列，长度一般在20-60bp。将随机文库与靶标混合孵育，利用外加磁场方法除去未结合或结合力弱的寡核苷酸，获得寡核苷酸-靶标复合物，然后以此为模板进行PCR扩增，富集后制备单链次级文库进行下一轮筛选。经过多轮的筛选和扩增，逐渐淘汰亲和力低的寡核苷酸，最终通过测序及鉴定得到能与靶标高亲和力和特异性结合的核酸适配体。
下述对MB-SELEX筛选特异性核酸适配体的过程进行详细说明。
(1)靶标与磁珠偶联：将0.01M的靶标氟苯尼考胺溶于1ml硼酸盐缓冲液BBS(pH9.5：100mmol/L H3BO3)中，用冰水和BBS依次清洗100ul的甲苯磺酰基磁珠，利用外加磁场进行分离，弃去上清。将溶解的靶标与清洗后的磁珠在37℃、150rpm下反应16h。取出后，弃去上清，用磷酸盐缓冲液PBS(pH 7.4：1.5mol/L NaCl，100mmol/L Na2HPO4·12H2O，30mmol/LNaH2PO4·2H2O)清洗4～5次，最后悬浮于100μl PBS中，4℃备用。
(2)文库预处理：初始ssDNA文库或次级文库溶于100μL结合缓冲液BB(pH 7.6：100mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L MgCl2，5mmol/L KCl，1mmol/L CaCl2，0.02％Tween 20)中，90℃热水浴处理10min后，迅速冰浴15min，最后置于室温下7min。
(3)孵育结合：将与靶标偶联的磁珠用BB洗涤5次，利用外加磁场进行分离，弃去上清后，迅速加入上述复性文库，在37℃，150rpm条件下反应2h。
(4)洗脱：孵育结束后，弃去上清，用BB清洗，洗去未结合到磁珠上的ssDNA，加入100μl洗脱缓冲液EB(pH 8.0：10mmol/L EDTA-2Na，3.5mol/L Urea，50mmol/L Tris-HCl，0.02％Tween 20)，在80℃条件下震荡10min，重复四次，收集洗脱液于4ml离心管中；进行线性聚丙烯酰胺-乙醇沉淀，在4℃、12000rpm条件下离心20min后，弃去上清，接着用乙醇洗两次，弃去上清，将沉淀在50℃烘干，用30μl的超纯水复溶，得到结合上靶标的ssDNA，用微量紫外分光光度计测其浓度；计算每一筛选循环的回收率，在第六轮、第八轮和第十轮增加负筛过程，与靶标孵育之前，将上一轮得到的ssDNA先与磁珠进行孵育，取上清液与磁珠-靶标孵育，弃去与磁珠结合力较强的ssDNA以增加筛选的压力，获得更好亲和性和特异性的序列。
(5)PCR扩增：以洗脱后的溶液为模板进行PCR扩增，PCR扩增反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸30s；72℃再延伸5min，24个循环。
PCR扩增反应的体系为：
(6)PCR产物的纯化：在PCR产物中加入1/10原体积的3M醋酸钠(PH＝5.2)溶液及核酸共沉剂和2.5倍体积的无水乙醇(-20℃下预冷)均匀混合。于4℃，12000rpm，离心15min，弃上清，再加入1mL 70％无水乙醇(-20℃下预冷)，充分洗涤沉淀后再次离心，弃去上清，干燥后的沉淀用超纯水溶解。
(7)琼脂糖凝胶电泳验证：每轮筛选得到的次级文库经过PCR扩增后，用4％体积分数的琼脂糖凝胶电泳进行检测，与marker比较所得条带大小是否约为80bp。
琼脂糖凝胶电泳步骤如下：根据上样量的个数和目的条带大小用1×TAE溶液配制适当体积浓度的琼脂糖溶液，放入微波炉中加热1min至琼脂糖溶解，稍冷却后倒入制胶槽中，插上梳子；待胶凝固后，垂直拔出梳子；把胶放入电泳槽1×TAE核酸电泳缓冲液中，样品和上样缓冲液按相应比例混合后上样，电压100V，45min；凝胶成像系统中观察结果。
(8)ssDNA次级文库的制备：通过Lambda核酸外切酶酶切去除PCR产物中的5’磷酸化标记反义链得到ssDNA；向纯化的PCR产物中加入5000U/mL的Lambda核酸外切酶及1/10原体积的Lambda核酸外切酶缓冲液。反应条件为：37℃水浴1h进行酶切，75℃水浴10min终止反应。
(9)ss DNA次级文库的纯化：在酶切产物中加入1/10原体积的3M醋酸钠(PH＝5.2)溶液及核酸共沉剂和2.5倍体积的无水乙醇(-20℃下预冷)均匀混合；于4℃，12000rpm，离心15min，弃上清，再加入1mL70％无水乙醇(-20℃下预冷)，充分洗涤沉淀后再次离心，弃去上清，干燥后的沉淀用超纯水溶解作为下一轮筛选的次级文库，并用微量紫外分光光度计测定其核酸浓度。
(10)重复多轮筛选：将步骤(9)中收集到的ssDNA次级文库，代替步骤(2)中的初始文库，重复以上步骤(1)-(10)。
为了获得对靶标氟苯尼考胺具有更高亲和力的ssDNA，随着SELEX筛选轮数的增加，逐渐增大筛选压力。如表1所示，，ssDNA文库的用量逐渐减少，而文库和氟苯尼考胺的孵育时间由120min逐渐缩短至90min。
表1.MB-SELEX筛选条件
结果如图2所示，由图2可以看出，随着筛选轮数的增加，与氟苯尼考胺结合的ssDNA也越来越多，回收率逐渐增大，表明能与氟苯尼考胺结合ssDNA得到富集，未能与氟苯尼考胺结合或结合能力弱的适配体已经被淘汰；第六和八轮回收率的减少是由于加入了未偶联靶标的空白磁珠进行了负筛，增强了适配体的特异性；第十轮再次反筛，回收率已不再降低，结束筛选过程，从投入文库中能回收50％以上的ssDNA。
3、高通量测序及序列分析
将最后一轮筛选产物通过PCR扩增后送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行高通量测序。用Mage 6软件对测序结果中出现次数占比较多的序列进行比对分析，并预测序列的二级结构。从不同家族中挑选出能级较低、结构稳定的代表序列，合成带5′-FAM标记，进行下一步的亲和力鉴定。通过对候选ssDNA间的共有序列及二级结构进行分析，预测最有可能结合的茎环位置进行截短优化。二级结构通过UNAFold(http://www.unafold.org/)进行预测，结果如图3所示。
由图3可以看出，通过对全长的核酸适配体SEQ ID No.1进行了二级结构的预测，发现序列中间具有可能结合的发夹结构。由于本发明所采用的文库左右两端是固定的，因此对中间的随机序列部分进行了截短优化得到核酸适配体SEQ ID No.2，从全长80个碱基截短到43个碱基序列。
4、候选ss DNA的亲和力鉴定
将5′-FAM标记ssDNA序列溶液进行加热后迅速降温的折叠处理，随后不同浓度ssDNA序列分别与固定浓度(1μmol/L)的氟苯尼考孵育2h，反应总体积为200μL，同时设置不加入氟苯尼考作为阴性对照，结束反应后，加入与ssDNA呈比列的GO(GO:ssDNA＝20:1)，继续避光孵育60min，测定上清液的荧光值(Ex＝492nm，Em＝522nm)。利用GraphPad Prism 6软件非线性拟合确定每条序列的解离常数Kd值。核酸适配体SEQ ID No.1及核酸适配体SEQID No.2的非线性拟合曲线如图4所示，序列SEQ ID No.1～2及其Kd值如表2所示，说明经过截短优化后的ssDNA核酸适配体与氟苯尼考的结合能力明显提高。
表2.SEQ ID No.1和SEQ ID No.2序列及其Kd值
由表2和图4结果可知，全长序列SEQ ID No.1的亲和力Kd值为34.65±10.07nM，而截短优化后的序列SEQ ID No.2的亲和力Kd值为4.76±3.09。去掉冗余序列使得结合亲和力提高了约8倍。
5、截短后核酸适配体SEQ ID No.2对氟苯尼考和氟苯尼考胺的结合力分析
利用同样的方法评价核酸适配体SEQ ID No.2对氟苯尼考胺的结合力。100nM的核酸适配体探针候选序列分别与1μmol/L氟苯尼考、氟苯尼考胺在37℃下避光孵育2h，并用结合缓冲液作为阴性对照。随后，加入与ssDNA呈比列的GO(GO:ssDNA＝20:1)，继续避光孵育60min，测定上清液的荧光值(Ex＝492nm，Em＝522nm)。通过荧光值来评估核酸适配体SEQID No.2对氟苯尼考及氟苯尼考胺的结合力分析。每个样品平行测定3次，并避光操作。结果见图5，图中FF表示氟苯尼考，FFA表示氟苯尼考胺。
由图5可见，截短后的核酸适配体序列能同时结合氟苯尼考和氟苯尼考胺。
6、截短后核酸适配体SEQ ID No.2对氟苯尼考和氟苯尼考胺的特异性分析
通过柠檬酸钠还原法制备了粒径约为20nm左右的胶体金，将40μl 1μM核酸适配体与50μl胶体金避光反应30min，再向体系中加入100ppb的氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺，500ppb的氯霉素、甲砜霉素，37℃避光反应1h，通过酶标仪测定吸光度值(A650/A520)，结果如图6所示。
由图6可以看出，靶标氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的检出信号对比结构类似物氯霉素、甲砜霉素及空白对照组的信号显著高，表明该截短后核酸适配体的特异性良好。
与相关技术中筛选核酸适配体采用靶标固定技术相比，通过文库固定的方法筛选到了氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体，有效的克服了传统方法的空间位阻效应以及靶标固定引起的构象的改变缺陷，可在体外筛选，筛选周期短、稳定性强、合成方便且易于标记各种修饰基团，操作简便、筛选过程成本低，可长期保存使用。
实施例2、利用截短后获得的短链核酸适配体SEQ ID No.2建立检测氟苯尼考的方法
通过柠檬酸钠还原法制备了粒径约为20nm左右的胶体金，将40μl 1μM核酸适配体与50μl胶体金避光反应30min，再向体系中加入一系列浓度(0.00128ng/mL、0.032ng/mL、0.8ng/mL、4ng/mL、100ng/mL、500ng/mL)的氟苯尼考，37℃避光反应1h，通过酶标仪测定吸光度值(A650/A520)。以A650/A520值为纵坐标，氟苯尼考浓度为横坐标，从而实现对氟苯尼考的灵敏检测，结果如图7所示。该方法在氟苯尼考浓度为0.00128～500ng/mL内线性范围良好，能检测到氟苯尼考的最低检测限为0.00128ng/mL，线性回归方程为y＝0.0098ln(x)+0.7197，R2＝0.9904。
本公开中利用文库筛选得到的ssDNA核酸适配体具有较好的亲和力及特异性，且本公开实施例的ssDNA核酸适配体结构稳定，在进行基团标记及修饰后，仍具有较好的亲和力和特异性，可应用于氟苯尼考和/或氟苯尼考胺检测试剂盒中。
对比例
合成序列为5'-GCCCACAGTGTTGCGGGAATGATTATCCGCCGAGGGGTGG-3'(SEQ ID No.3)的对照核酸适配体，以及序列为5'-GCTGTGTGACTCCTGCAAGGTCCATTCAAGTCGTAGGTTTGCCTTCAGCCTCAACGCTTACGCAGCTGTATCTTGTCTCC-3'(SEQ ID No.4)的对照核酸适配体。
利用实施例1中同样的方法测定序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的对照核酸适配体的亲和力，序列为SEQ ID No.3的对照核酸适配体的Kd值为11.811±4.03nmol/L，序列为SEQ ID No.4的对照核酸适配体的Kd值为52.78±11.47nmol/L；而实施例1中序列为SEQID No.2的核酸适配体的Kd值为4.76±3.09nmol/L，则实施例1中序列为SEQ ID No.2的核酸适配体的亲和力远远优于序列为SEQ ID No.3的对照核酸适配体以及序列为SEQ IDNo.4的对照核酸适配体的亲和力，并且序列长度也较短，成本大大降低。
本公开提供的可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体，相比于蛋白抗体具有更高的亲和特异性，且无免疫原性、能够化学合成、分子量小且性质稳定、能够特异性结合氟苯尼考及氟苯尼考胺，该核酸适配体以氟苯尼考及氟苯尼考胺为靶标，可实现氟苯尼考及氟苯尼考胺定性和定量的快速检测，成本低、特异性高且适用范围广，还可以基于该核酸适配体构建各种用于检测氟苯尼考和/或氟苯尼考胺的生物传感器。通过文库固定的方法筛选到了该氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体，有效的克服了传统方法的空间位阻效应以及靶标固定引起的构象的改变缺陷，可在体外筛选，筛选周期短、稳定性强、合成方便且易于标记各种修饰基团，操作简便、筛选过程成本低，可长期保存使用。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本公开实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本公开实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本公开实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北农业大学
<120> 可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体及其应用
<130> FI211795
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctgtgtgac tcctgcaaac ggccagtggg tggggcgggt ggcggccggt tgtttctatg 60
cgcagctgta tcttgtctcc 80
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acggccagtg ggtggggcgg gtggcggccg gttgtttcta tgc 43
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcccacagtg ttgcgggaat gattatccgc cgaggggtgg 40
<210> 4
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gctgtgtgac tcctgcaagg tccattcaag tcgtaggttt gccttcagcc tcaacgctta 60
cgcagctgta tcttgtctcc 80
Claims (8)
1.一种可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1~2中任一项所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物。
4. 根据权利要求3所述的核酸适配体，其特征在于，所述标记物为荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、si RNA和酶中的一种或多种。
5.如权利要求1~2中任一项所述的可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体在制备氟苯尼考和/或氟苯尼考胺检测试剂盒或氟苯尼考和/或氟苯尼考胺分子探针中的应用。
6.一种应用权利要求1~2中任一项所述的可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体的氟苯尼考和/或氟苯尼考胺的检测方法，其特征在于，所述方法包括：将核酸适配体与胶体金避光反应30~35min，然后向反应后的体系中加入待测样品，混匀，于37~40℃避光反应60~70min后测定溶液的吸光度值。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述核酸适配体的浓度为1μM，所述胶体金的粒径为20nm，所述核酸适配体和所述胶体金的体积比为4:5。
8.一种用于检测氟苯尼考和/或氟苯尼考胺的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1~2中任一项所述的可特异性识别氟苯尼考及氟苯尼考胺的核酸适配体。
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| Screening of Single-Stranded DNA Aptamer Specific for Florfenicol and Application in Detection of Food Safety;Minghui Shi 等;Biosensors (Basel);第12卷(第9期);第701篇 * |
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