CN107541516B - 一组特异识别三种海洋毒素的核酸适配体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一组能同时识别软骨藻酸和河豚毒素的单链DNA核酸适配体DA‑01和TTX‑27，一条能特异性识别软骨藻酸的单链DNA核酸适配体DA‑06，一条能特异性识别河豚毒素的单链DNA核酸适配体TTX‑07，一条能特异性识别石房蛤毒素的单链DNA核酸适配体STX‑41。本发明采用磁性还原氧化石墨烯(MRGO)辅助分离的指数富集配体系统进化(SELEX)技术，利用磁性还原氧化石墨烯能吸附游离的单链DNA但不能吸附与靶标分子结合的单链DNA的特性，同时利用其磁分离富集特性，将对靶标毒素具有亲和性的和无亲和性的单链DNA分离，经过16轮反复的孵育、分离、扩增、制备单链的体外筛选，对所得ssDNA进行一级结构同源性和二级结构相似性分析，然后测定其亲和性和特异性，最终获得一组高亲和性和特异性的核酸适配体。该组适配体在水产品中软骨藻酸、河豚毒素、石房蛤毒素的分析检测和分离富集脱除净化方面具有广泛的应用前景。

Description

一组特异识别三种海洋毒素的核酸适配体

技术领域

本发明属于食品安全生物技术领域，涉及利用磁性还原氧化石墨烯辅助分离的指数富集配体系统进化技术筛选一组能同时识别软骨藻酸和河豚毒素的单链DNA核酸适配体及能特异性识别软骨藻酸、河豚毒素、石房蛤毒素的单链DNA核酸适配体各一条。

背景技术

海洋毒素主要来自有毒藻类，经食物链传递给水生动物并在其体内积累。近年来，随着海洋赤潮和湖泊蓝藻爆发的加剧，人们因食用含毒水产品造成的食物中毒事件逐渐增多。海洋毒素种类繁多，根据其溶解性不同可以分为亲水性和亲脂性两大类。石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)、软骨藻酸(Domoic acid,DA)和河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是最主要的三类亲水性海洋毒素。STX和TTX都是钠离子通道抑制剂，能通过选择性地结合电压门控钠离子通道表面受体阻止钠离子的传输，进而阻断神经冲动的传导，从而引起神经麻痹、呼吸困难等症状，甚至造成死亡。软骨藻酸是一种类氨基酸的兴奋性神经毒素，与中枢神经系统中的丙酸受体、谷氨酸受体、天冬氨酸受体都具有很强的亲和力，通过激活这些受体引起Ca²⁺、Na⁺在神经细胞中的过量积累并产生活性氧，进而对神经系统造成损害，表现出失忆、方向感迷失、癫痫、昏迷等症状。这些毒素不仅会对人们的健康和安全造成危害，也会影响水产品行业，破坏生态环境。因此，快速、准确地检测水产品或水体中的毒素显得尤为重要。

小鼠生物测试法是应用最广泛的海洋毒素检测方法，也是很多国家的法定检测方法，可以通过症状观察和致死率计算进行直观的毒性分析。然而，这种方法分析周期较长，重复性很差，且无法区分不同的毒素并对其精确定量，其最大的缺陷还在于实验伦理问题。鉴于此，欧盟、日本、中国等都开始采用依赖于仪器的化学分析法代替小鼠生物法作为毒素的标准检测方法。化学分析法主要采用气相色谱、液相色谱、毛细管电泳结合荧光法、质谱法等对各类毒素进行分辨和定量。这类方法一直是人们研究的热点，已衍生出了众多新型的方法，精确度非常高，且可进行多组分同时检测和高通量分析。但是，化学分析法也具有仪器设备昂贵，需要专业操作分析人员，样品前处理复杂等缺点，并且也不适应目前越来越重要的现场快速检测。免疫检测法是基于抗原-抗体的特异性识别，结合比色、荧光、化学发光、电化学、石英晶体微天平、表面等离子共振等技术构建的新型快速检测技术。免疫法操作简便，基于酶联免疫吸附法已开发出了众多商品化的试剂盒，而胶体金试纸条更是适用于现场检测。但是，抗体的制备复杂、耗时，特别是对于小分子的海洋毒素，其免疫原性较低甚至无免疫原性，而其毒性却对实验动物和细胞有害。制备得到的抗体不易长期保存，交叉反应也是其难以避免的缺点。

核酸适配体(Aptamer)是从人工合成的寡核苷酸文库中筛选得到的，与靶标分子具有高亲和力和特异性的单链DNA或RNA。作为一种新型的识别分子，适配体不仅具有和抗体相似的高亲和力和特异性，还具有很多比抗体更优越的特性。适配体是通过体外筛选技术得到的，这就避免了抗体制备中使用实验动物的伦理问题，也避免了靶标免疫原性和毒性的影响，使其靶标范围极其广泛，从金属离子、生物毒素、核苷酸等小分子物质，到蛋白质、酶、抗体等生物大分子，甚至病毒、细菌等生物体都能成为其靶标。筛选得到的适配体可由生物公司合成，方便、快速、成本低、批次间差异小，也便于进行各种标记或化学修饰，其化学和热稳定性也高于抗体，可长期储存。由于适配体的这些优点，它被广泛应用于疾病诊断和治疗、食品安全检测、分离提取等方面。

适配体筛选的技术被称为配体指数富集系统进化技术(systematic evolutionof ligands by exponential enrichment，SELEX)。自1990年，Gold研究组和Szostak研究组开创这一技术以来，针对不同类型的靶标已开发出了多种SELEX技术。针对海洋毒素这类小分子物质，主要通过固定法，即将毒素分子固定在磁珠或琼脂糖珠子上进行筛选。利用这一方法，已经获得了微囊藻毒素、石房蛤毒素、大田软海绵酸、河豚毒素等海洋毒素的适配体。然而，固定法存在空间位阻效应，采用的连接分子会改变毒素的天然构象，珠子对寡核苷酸也有非特异性吸附，这些都会影响筛选的效率和所得适配体的性能。2012年，韩国高丽大学的Gu研究组开发了一种氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)辅助分离的非固定SELEX，筛选到了一种脂肪因子“Nampt”的适配体。利用这种GO-SELEX方法略作改进后，我们成功筛选到了大田软海绵酸的适配体。2014年，Gu研究组又采用多重GO-SELEX同时筛选得到了针对三种农药的适配体。本发明利用合成的磁性还原氧化石墨烯(Magnetic reduced grapheneoxide,MRGO)，结合磁分离和多重筛选技术，运用非固定SELEX技术同时筛选得到了STX、DA、TTX的单链DNA适配体。这些适配体在水产品或水环境中三种海洋毒素的分析检测和分离富集脱除净化中具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一组能特异性识别软骨藻酸的单链DNA核酸适配体，一组能特异性识别河豚毒素的单链DNA核酸适配体和一组能特异性识别石房蛤毒素的单链DNA核酸适配体，为开发针对这三种海洋毒素的新型分析检测和分离富集脱除净化方法奠定良好基础。

本发明的另一目的是提供一种同时针对多种小分子物质的核酸适配体的筛选方法，可以高效地获得与多种小分子物质特异性结合且具有高亲和力的核酸适配体。

为实现上述目的，本发明首先采用一锅法合成了磁性还原氧化石墨烯(Magneticreduced graphene oxide,MRGO)，并对其进行了表征。然后，利用MRGO的通过π-π堆积作用非特异性吸附单链DNA(single strand DNA，ssDNA)和磁分离富集的特性，在SELEX的分离步骤中有效分离了与靶标结合的ssDNA和未结合的游离ssDNA。通过针对三种混合靶标的十二轮筛选和随后针对单一靶标的各四轮筛选后，对获得的三个ssDNA富集文库进行克隆测序，并采用荧光法分析代表序列的亲和力和特异性。最终，获得了分别对DA、TTX和STX具有高亲和力和特异性的核酸适配体各一条，以及与DA和TTX都具有亲和力的核酸适配体两条。

本发明的优点是：

1)核酸适配体具有可与抗体相媲美的亲和力和特异性，但其制备不依赖实验动物或细胞，可人工合成，因而成本低、生产周期短、不同批次间的重复性较好，其稳定性也较高，可长期保存，也便于化学修饰。

2)传统的筛选小分子靶标的SELEX技术，需将靶标固定在琼脂糖珠、磁性颗粒或酶标板等固相表面，这可能造成其天然构象的改变或识别位点的空间阻隔，影响筛选效果。本发明采用的MRGO辅助分离的SELEX技术，无需固定小分子靶标，可筛选得到天然状态小分子毒素的适配体，同时在磁分离过程中无需使用离心机等仪器设备，简化了操作流程。

附图说明

图1是磁性还原氧化石墨烯辅助分离的SELEX技术的原理图。

图2是适配体序列DA-01、DA-06、TTX-07、TTX-27、STX-41的模拟二级结构图和自由能。

图3是适配体DA-01、DA-06、TTX-07、TTX-27、STX-41的饱和结合曲线图。

图4是适配体DA-01、DA-06、TTX-07、TTX-27、STX-41的特异性试验结果。

具体实施方式

1、MRGO的制备和表征

采用一锅法，以葡萄糖为还原剂，在碱性条件下同时还原氧化石墨烯(GrapheneOxide，GO)和FeCl₃·6H₂O合成MRGO。采用透射电镜、紫外可见光谱、傅里叶转换红外光谱和磁化强度表征制备的MRGO，结果显示MRGO成功合成且磁性良好。采用荧光法测定MRGO对80nt ssDNA的吸附效果，结果显示当MRGO/ssDNA质量比为300时，MRGO能完全吸附游离的ssDNA。

2、三种海洋毒素适配体的筛选

2.1初始随机ssDNA文库和引物的合成

由美国Integrated DNA Technologies公司合成长度为80nt的随机ssDNA文库，包含两端各20nt的引物区和中间40nt的随机区，序列为：5’-ATAGGAGTCA CGACGACCAG-N₄₀-TATGTGCGTC TACCTCTTGA-3’(N₄₀代表40个随机核苷酸)，。

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。上游引物序列为：5’-ATAGGAGTCACGACGACCAG-3’，下游引物序列为：5’-P-TCAAGAGGTA GACGCACATA-3’

用1×TE缓冲液(pH 7.4)将随机ssDNA文库和引物都配制成100μM的贮存液，保存于-20℃备用。

2.2三种海洋毒素适配体的筛选

共进行16轮孵育结合、分离、PCR扩增、PCR产物纯化、制备单链、ssDNA纯化的反复筛选，其中，前12轮是同时针对DA、TTX、STX三种毒素靶标的混合筛选，然后分别针对一种毒素靶标各进行4轮单一筛选。实验原理如图1所示，每一轮的具体操作如下所述。

①取初始ssDNA文库或上一轮筛选得到的次级文库与适量Binding buffer混合，95℃水浴10min，冰浴10min。

②按靶标毒素与ssDNA文库的摩尔比为10:1加入靶标DA、TTX、STX(前12轮同时加入三种靶标混合筛选，后4轮加入一种靶标分别筛选)，混合均匀，37℃振荡孵育。

③按MRGO/ssDNA质量比为300加入MRGO，混合均匀，37℃振荡孵育1h，此时，与靶标毒素结合的ssDNA仍保留在上清液中，而未结合的游离ssDNA序列被MRGO吸附。

④磁分离，收集上清液，得到能与靶标毒素结合的ssDNA文库。

⑤以磁分离的上清液为模板进行PCR扩增。50μL PCR扩增体系包括：灭菌超纯水39.5μL，10×PCR buffer 5μL，5mM each的dNTP 1μL，10μM的上下游引物各1μL，模板2μL和5U/μL的Taq核酸聚合酶0.5μL。热循环反应参数为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环大约20次(每一轮筛选中对PCR循环次数进行优化)；最后72℃延伸5min。用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果。

⑥用上海捷瑞生物工程有限公司的PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。用nanodrop 2000超微量分光光度计测定纯化的PCR产物的核酸浓度。

⑦利用Lambda核酸外切酶(New England BioLabs)特异性识别并消化5’磷酸化的反义链制备ssDNA。400μL酶切反应体系包括：10×Lambda核酸外切酶buffer 40μL，纯化的PCR产物358μL，5U/μL的Lambda核酸外切酶2μL。酶切条件为：37℃水浴1h，然后75℃水浴10min灭活酶终止反应。用含7M尿素的8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切结果。

⑧用核酸共沉剂Dr.GenTLE Precipitation Carrier(Takara BiomedicalTechnology(Beijing)Co.,Ltd)沉淀纯化酶切产物，制备次级ssDNA文库。在200μL酶切产物中依次加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)，4μL的核酸共沉剂和2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀，12000r/min 4℃离心15min，弃上清，留下白色沉淀，再加入70％乙醇，12000r/min4℃离心5min，弃上清并干燥沉淀，用适量Binding buffer将其溶解。用nanodrop 2000超微量分光光度计测定纯化的ssDNA次级文库的核酸浓度。

为了增强筛选压力，提高筛选得到的适配体的亲和性，随筛选轮数的增加，加入ssDNA文库的量和孵育时间都逐渐减少。如表1所示，加入ssDNA文库的量由1000pmol递减至10pmol，加入毒素的量相应地由10μmol递减至0.1μmol，孵育时间则由3h递减至0.25h。

为了提高筛选得到的适配体的特异性，从第七轮开始每隔一轮用靶标毒素的结构类似物或可能的共存物进行一轮反筛，以去除能与这些物质结合的ssDNA。前12轮所用的反筛物质包括：STX的结构类似物膝沟藻毒素(Gonyautoxin,GTX)GTX-1&-4、GTX-2&-3、GTX-5，DA的结构类似物红藻氨酸(Kainic acid,KA)和最主要的腹泻性贝类毒素大田软海绵酸(Okadaic acid,OA)。随后针对一种毒素的4轮单独筛选中，反筛物质除了上述的五种毒素外，还包括另外两种靶标毒素。反筛操作如下所述。

①取上一轮筛选得到的次级文库与适量Binding buffer混合，95℃水浴10min，冰浴10min。

②加入反筛毒素GTX-1&-4、GTX-2&-3、GTX-5、KA、OA(反筛毒素与ssDNA文库的摩尔比也为10:1)，混合均匀，37℃振荡孵育2h。

③按MRGO/ssDNA质量比为300加入MRGO，混合均匀，37℃振荡孵育1h，在此过程中，与反筛毒素结合的ssDNA留在上清中，而未结合的ssDNA被MRGO吸附。

④磁分离，去上清液。用Binding buffer反复清洗沉淀的MRGO数次，然后用Binding buffer重悬MRGO。

⑤按靶标毒素与ssDNA文库的摩尔比为10:1加入靶标DA、TTX、STX(前12轮同时加入三种靶标混合筛选，后4轮加入一种靶标分别筛选)，混合均匀，37℃振荡孵育，靶标毒素可诱导与其有亲和性的ssDNA从MRGO表面解吸附。

⑥磁分离，取上清液，按上文中提到的方法依次进行PCR扩增，试剂盒纯化PCR产物，酶切制备单链，乙醇沉淀纯化ssDNA，核酸定量。

表1 SELEX筛序过程中每一轮的筛选条件

2.3克隆测序和序列分析

将最后一轮筛选孵育得到的ssDNA富集文库用无修饰的引物进行PCR扩增并纯化，然后送上海派森诺生物科技股份有限公司进行克隆测序。最终，DA获得45条ssDNA序列，TTX获得46条ssDNA序列，STX获得45条ssDNA序列。用DNAMAN V6对获得的序列的一级结构进行比对，根据同源性分析，将序列分成几组。然后用Mfold预测这些序列的二级结构和自由能(ΔG)。从每组中选择1～2条二级结构具有代表性的，且自由能较低的序列(见图2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成5’末端标记FAM荧光基团的ssDNA序列进行亲和力和特异性分析。

2.4亲和力分析

采用荧光法分析每条序列对靶标的亲和力。在300μL体系中，将2μM的靶标毒素分别与梯度浓度(5、25、50、75、100、150、200nM)的ssDNA混合，37℃避光孵育1h。然后，按相同MRGO/ssDNA质量比分别加入相应质量的MRGO，继续避光孵育30min，吸附未与靶标毒素结合的适配体，磁分离取上清液。同时，针对各浓度的ssDNA分别设置不加靶标毒素的对照以排除MRGO对ssDNA不完全吸附造成的影响。实验组和对照组均做3次重复实验。各取200μL上清液，加入黑色透明底酶标板孔(Corning Inc.)中，用Biotek Synergy H1测定荧光强度。采用GraphPad Prism 5软件，以ssDNA浓度为横坐标，实验组和对照组的荧光差值(ΔF)为纵坐标进行非线性拟合，绘制饱和结合曲线图(见图3)，并计算各ssDNA的解离常数K_d值(见表2)。从中选择K_d值较小，即与靶标毒素亲和力较强的ssDNA继续进行特异性分析。

表2 挑选出的ssDNA序列的解离常数K_d值

2.5特异性分析

根据亲和力分析的结果，选择与DA具有较高亲和力的DA-01、DA-04、DA-06、DA-42，与TTX具有较高亲和力的TTX-07、TTX-27、TTX-42、TTX-45，与STX具有较高亲和力的STX-14、STX-32、STX-38、STX-41，采用荧光法进行特异性分析。在300μL体系中，每条ssDNA(150nM)分别与DA、TTX、STX、GTX-1&-4、GTX-2&-3、GTX-5、KA、OA(各2μM)混合，37℃避光孵育1h。然后，加入MRGO，继续避光孵育30min，吸附未与靶标毒素结合的适配体，磁分离取上清液。同时，设置不加毒素的对照以排除MRGO对ssDNA的不完全吸附。实验组和对照组均做3次重复实验。各取200μL上清液，加入黑色透明底酶标板孔中，用Biotek Synergy H1测定荧光强度，计算相对荧光比例(Relative fluorescence ratio)，比较ssDNA与不同毒素的结合能力。相对荧光比例＝ΔF_toxin/ΔF_target，其中ΔF_target和ΔF_toxin分别表示靶标毒素和其他毒素的相对荧光强度；相对荧光强度＝F-F₀，其中F和F₀分别表示实验组和对照组的荧光强度。结果如图4所示，DA-06与DA，TTX-07与TTX，STX-41与STX的结合能力都明显强于它们与其他毒素的结合能力，表现出显著的特异性。而DA-01、TTX-27对DA和TTX这两种毒素都具有明显高于其他毒素的结合能力。采用2.4中的荧光法分析DA-01对TTX和TTX-27对DA的亲和力，结果如图3和表2所示，DA-01对TTX的解离常数为192.6±77.94nM，TTX-27对DA的解离常数为160.6±49.28nM，表明DA-01和TTX、TTX-27和DA之间都具有亲和性。

最终，我们通过MRGO辅助分离的SELEX技术筛选得到了一组能同时识别软骨藻酸和河豚毒素的ssDNA核酸适配体DA-01和TTX-27，一条能特异性识别软骨藻酸的ssDNA核酸适配体DA-06，一条能特异性识别河豚毒素的ssDNA核酸适配体TTX-07和一条能特异性识别石房蛤毒素的ssDNA核酸适配体STX-41。

本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一组特异识别三种海洋毒素的核酸适配体

<141> 2017-09-21

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> DA-01

<400> 1

ataggagtca cgacgaccag ttatatttaa tctcactttc tatgatcgtg gtatattagg 60

tatgtgcgtc tacctcttga 80

<210> 2

<211> 80

<212> DNA

<213> TTX-27

<400> 2

ataggagtca cgacgaccag ctccatttat tctaaatttc atagactagt taataataac 60

tatgtgcgtc tacctcttga 80

<210> 3

<211> 80

<212> DNA

<213> DA-06

<400> 3

ataggagtca cgacgaccag aaaaataatt taaattttct acccaatgct tttcgcataa 60

tatgtgcgtc tacctcttga 80

<210> 4

<211> 75

<212> DNA

<213> TTX-07

<400> 4

ataggagtca cgacgaccag tcaaattttc gtctactcaa tctttctgtc ttatctatgt 60

gcgtctacct cttga 75

<210> 5

<211> 80

<212> DNA

<213> STX-41

<400> 5

ataggagtca cgacgaccag ctttttacaa aattctcttt ttacctatat tatgaacaga 60

tatgtgcgtc tacctcttga 80

Claims (4)

1.一组特异性识别三种海洋毒素的核酸适配体，其特征在于能同时识别软骨藻酸和河豚毒素的单链DNA核酸适配体DA-01和TTX-27，其序列为序列表中的序列1和2，一条能特异性识别软骨藻酸的单链DNA核酸适配体DA-06，其序列为序列表中的序列3，一条能特异性识别河豚毒素的单链DNA核酸适配体TTX-07，其序列为序列表中的序列4，一条能特异性识别石房蛤毒素的单链DNA核酸适配体STX-41，其序列为序列表中的序列5。

2.根据权利要求1所述的适配体，其特征在于，所述序列为人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。

3.根据权利要求1所述的适配体，该适配体为在权利要求1所述适配体序列的5’端或3’端连接或标记其他功能基团或分子，并与权利要求1所述适配体具有相同功能的适配体，所述其他功能基团或分子选自：生物素、氨基、巯基、荧光素、地高辛、放射性同位素、酶标记或纳米发光材料。

4.权利要求1-3任一项所述的适配体，应用于毒素的分析检测，分离富集和脱除净化。

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