CN114910533B - 一种基于纳米阵列的适配体电化学传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于纳米阵列的适配体电化学传感器，是以镀金聚丙烯腈(Au@PAN)纳米阵列为电极，通过Au‑S键将适配体共价结合在电极表面，获得的修饰电极即为工作电极，采用三电极体系，构成用于选择性识别待检测物的适配体电化学传感器。本发明将有序纳米结构与适配体电化学传感器相结合，利用适配体的特异性选择、电化学传感器的响应快速以及纳米结构的信号增强功能，实现对待检测物的快速、灵敏、选择性检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种特异识别待检测物的传感器，属于生物化学传感器领域。
背景技术
电化学生物传感器，是将电化学技术和生物技术相结合的一种分析方法，以固定电极为基础，将生物敏感分子修饰在电极表面，利用生物分子之间的特异识别能力，进行特异性识别，并将其产生的化学信号转换为电信号，从而实现其对目标物的检测。该方法具有灵敏、快速、操作简便等优点，在食品、环境等领域具有广泛的应用前景，但是其在使用时需要额外添加特定的选择性物质或者纳米材料来提高其选择性和灵敏度，大大限制了其在检测方面的应用。
有序纳米衬底材料与纳米颗粒一样具有高比表面积、小尺寸效应、量子尺寸效应等特点，增强传感器灵敏性的同时还可以避免常规纳米颗粒易泄漏的问题，在电化学传感器领域具有良好的应用前景。
核酸适配体因其与目标分子间的高亲和力和特异性，且具有高选择性、化学稳定性好、成本低、易于合成和修饰等优点，可克服使用抗体带来的排异性及酶易失活、稳定性差等缺点，被广泛应用于生物小分子的分析检测中。而一端修饰亚甲基蓝的核酸适配体还兼具有一定的电催化性能，可协同催化放大电流信号。
若将适配体的特异性识别与纳米结构电化学传感器的信号放大效应相结合，制备出可以兼具二者优点的传感器，将会具有广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于纳米阵列的适配体电化学传感器及其制备方法，所要解决的技术问题在于将核酸适配体与电化学传感方法相结合，制备出具有高灵敏度、高选择性的电化学传感器。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
本发明基于纳米阵列的适配体电化学传感器，包括工作电极、参比电极和对电极。所述工作电极为修饰有适配体的有序纳米阵列金电极；所述参比电极为饱和甘汞电极；所述对电极为铂丝电极。
所述修饰有适配体的有序纳米阵列金电极是通过Au-S键将5'端修饰有-SH、3'端修饰有MB的适配体(MB-Apt)修饰在有序纳米阵列金电极的表面，并用一端修饰有-SH的短链DNA(T5)填充剩余的过多结合位点后获得的。
三电极体系所用支持电解质为铁氰化钾/亚铁氰化钾(浓度比1：1)的溶液。
所述适配体序列为：
SH-TTTTTTTGAGGGTCGCATCCCGTGGAAACAGGTTCATTG-MB；
所述短链DNA序列为：HS-TTTTT。
上述MB-Apt、T5均购于上海生工生物工程股份有限公司。
本发明基于纳米阵列的适配体电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：有序纳米阵列电极的制备
1a、光刻硅模板的清洗
使用低温等离子体处理仪对硅模板进行清洗，清洗的条件为：功率40W、处理时间120s。
1b、聚丙烯腈(PAN)溶液的配制
首先，将聚丙烯腈粉末(PAN，Mw:150,000)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，其中PAN的质量分数占比为8％，然后60℃水浴搅拌30分钟，室温下静置备用。
1c、有序纳米电极的制备
取适量步骤1b制备的聚丙烯腈溶液滴铺在硅模板表面至完全覆盖模板，在电热鼓风干燥箱中60℃烘30分钟揭下粘贴在玻璃板上，通过离子溅射仪在聚丙烯腈纳米阵列膜的表面溅射一层金纳米颗粒(40mA/cm2，4min)，即得有序纳米阵列电极Au@PAN，室温下保存备用。
步骤2：基于纳米阵列的适配体电化学传感器的制备
以步骤1c获得的有序纳米阵列电极为原始电极，在最优条件下，通过Au-S键将核酸适配体(MB-Apt)共价结合在电极表面(适配体吸附时间为4h，适配体修饰浓度为0.5μmol/L)，再将短链DNA(T5)修饰在电极表面(T5分子的修饰浓度为10μmol/L，修饰时间为1h)，即为工作电极，进而获得用于检测目标物的适配体传感器。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
1、本发明基于纳米阵列的适配体电化学传感器，将适配体传感器与纳米结构相结合，利用适配体传感器的特异选择性与纳米结构信号放大功能，能对微量的待检测物进行选择性识别，且灵敏性高；
2、本发明利用的适配体，具有高选择性、化学稳定性好、成本低、易于合成和修饰等优点，可克服使用抗体带来的排异性及酶易失活、稳定性差等缺点；
3、本发明以[Fe(CN)6]3-/4-为指示分子，所用的适配体在5'端修饰有-SH、3'端修饰有MB，利用MB的电催化性能，可协同放大传感器的响应信号；本发明利用的短链DNA不仅可以对适配体起到一定的支撑作用，还可占据多余的空位结合点；
4、本发明利用有序纳米阵列为衬底，可以避免传统传感器使用纳米颗粒带来的制备过程繁琐、易泄漏等问题，本发明提出的有序周期性纳米结构可大大提高电化学传感器的灵敏性。
附图说明
图1为传感器制备过程和检测原理图。
图2为不同电极的电流变化和转移电阻变化曲线图；其中(a)为不同电极的循环伏安曲线，(b)为不同电极的交流阻抗谱曲线。
图3为不同电极的微观形貌图，其中a)-c)为Au@PAN纳米阵列电极，d)-f)为MB-Apt/Au@PAN纳米阵列电极，g)-i)为STX/T5/MB-Apt/Au@PAN纳米阵列电极的电子扫描显微镜图。
图4为适配体修饰时间对传感器电流变化与电阻变化的影响；其中(a)为适配体传感器对STX相对电流响应信号的变化，(b)为适配体传感器对STX相对电阻响应信号的变化。
图5为适配体修饰浓度对传感器电流变化与电阻变化的影响，其中(a)为适配体传感器对STX相对电流响应信号的变化，(b)为适配体传感器对STX相对电阻响应信号的变化。
图6为适配体与短链DNA浓度比对传感器电流变化与电阻变化的影响，其中(a)为适配体传感器对STX相对电流响应信号的变化，(b)为适配体传感器对STX相对电阻响应信号的变化。
图7为适配体捕获目标分子STX的时间对传感器检测STX性能的影响，其中(a)为适配体传感器对STX相对电流响应信号的变化，(b)为适配体传感器对STX相对电阻响应信号的变化。
图8为石房蛤适配体修饰的传感器对不同浓度的石房蛤毒素(1pmol/L，10pmol/L,100pmol/L，1nmol/L，3nmol/L，5nmol/L，7nmol/L，10nmol/L，30nmol/L，100nmol/L)的差分脉冲伏安法检测结果图；；其中(a)为适配体捕获不同浓度STX时获得的差分脉冲伏安曲线，(b)为差分脉冲伏安图峰值变化(ΔI)与STX浓度关系。
图9为石房蛤适配体修饰的传感器对不同浓度的石房蛤毒素(1pmol/L，10pmol/L,100pmol/L，1nmol/L，3nmol/L，5nmol/L，7nmol/L，10nmol/L，30nmol/L，100nmol/L)的交流阻抗谱法检测结果图；其中(a)为适配体捕获不同浓度STX时获得的交流阻抗谱曲线，(b)为交流阻抗谱图电阻变化(ΔR)与STX浓度关系。
图10为石房蛤适配体修饰的传感器对不同毒素和金属离子的选择性识别的检测结果图。
具体实施方式
本实施例是以有序纳米阵列电子束光刻硅模板制备有序纳米衬底，通过离子溅射仪在聚丙烯腈纳米阵列衬底表面进行镀金处理，得到的镀金聚丙烯腈(记为Au@PAN)纳米阵列电极，通过Au-S键将石房蛤适配体(MB-Apt)修饰在电极表面，进一步将短链DNA(T5)在电极表面，T5的修饰不仅可以支撑一定量的坍塌在电极表面的MB-Apt分子，还占据了多余的结合位点。最终，获得以此修饰电极为工作电极制备的传感器，实现快速、灵敏、选择性检测石房蛤毒素，传感器的制备流程及检测原理如图1所示。
为判断是否成功制备出石房蛤适配体与短链DNA修饰的纳米阵列电极，以及其对石房蛤毒素的特异性识别，将各种情况下的纳米阵列电极放在含0.1mol/LKCl的1mmol/LK3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1:1)溶液中，通过三电极体系测试其电流变化及转移电阻变化，见图2。从图2(a)中可以看出，在裸Au电极表面观察到一对清晰的可逆氧化还原峰，当MB-Apt修饰在Au@PAN纳米阵列电极表面时，一定程度阻碍了电子转移，氧化还原峰电流减弱。进一步修饰T5分子在电极表面后，氧化还原峰强度急剧减少，峰电位发生明显偏移，表明T5分子不仅占据了一定量的结合位点，阻碍[Fe(CN)6]3-/4-向电极表面转移，同时支撑了倒塌的适配体。一旦引入STX分子，适配体传感器的峰值电流会有所上升。这说明适体成功捕获STX并折叠成特定的构象结构。MB靠近电极表面，MB的电催化性，有效促进了[Fe(CN)6]3-/4-向电极表面转移。
从图2(b)可以看出，裸电极的转移电阻约为5.6Ω，说明电极表面电荷转移几乎没有阻力。在电极表面修饰MB-Apt后，MB-Apt/Au@PAN纳米阵列电极电阻增加到167.6Ω，表明MB-Apt的修饰阻碍了电极表面的电子转移，而进一步修饰T5分子后，电极T5/MB-Apt/Au@PAN纳米阵列电极电阻提升为365.9Ω，电阻值明显增大，说明T5分子占据了一定量的结合位点，阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-向电极表面转移，同时支撑了倒塌的适配体。而STX的引入使得修饰电极STX/T5/MB-Apt/Au@PAN纳米阵列的电阻值降低至49.6Ω，目标物STX与电极之间的电子转移能力增强，这一结果与循环伏安数据一致。根据CV和EIS的结果，可以看出成功构建了基于纳米阵列的电化学适配体传感器，该传感器可用于STX的灵敏检测。
图3所示为通过扫描电子显微镜(SEM)对不同电极的表面形貌进行了分析。未经修饰的裸Au@PAN纳米阵列电极表面可观察到有序整齐的纳米柱阵列，纳米柱表面光滑(见图3a)-c))。当电极表面修饰了一定量的MB-Apt后，电极表面和纳米柱上清晰可见一定厚度的附着物(图3d)-f))。当引入STX分子后，STX/T5/MB-Apt/Au@PAN纳米阵列电极表面及纳米柱上出现明显附着物，且电极表面不如引入STX之前平整，说明MB-Apt成功捕获STX并折叠成特定的构象结构，证明成功制备了能够捕获目标分子STX的修饰电极。
为了使基于纳米阵列的适配体传感器分析STX的性能达到最佳，我们采用差分脉冲伏安法和交流阻抗谱法对STX适配体(MB-Apt)的修饰时间、MB-Apt的修饰浓度、MB-Apt与短链T5的浓度比及STX的孵化时间进行了研究。
图4所示为适配体修饰时间对传感器检测性能的影响。图4(a)为适配体传感器对STX相对电流响应信号的变化，当MB-Apt修饰时间在2～4小时，适配体传感器对STX的相对电流响应信号(ΔI)逐渐增大，而在4～8小时内适配体传感器的相对电流响应信号(ΔI)逐步降低，表明适配体修饰过多，反而阻碍电极表面的电子转移。由此可见，当适配体的修饰时间为4小时时，电极表面MB-Apt的修饰量已经达到饱和。图4(b)显示了MB-Apt修饰不同时间，适配体传感器检测STX的转移电阻变化。如图所示，适配体的修饰时间在2～4小时时，适配体传感器对STX的相对电阻变化(ΔR)逐渐增大，而当适配体的修饰时间继续增加时，相对电阻信号减小，这可能是因为适配体修饰过多，阻碍了电极表面的电子转移。这与图4(a)结果一致。因此，选用4小时作为MB-Apt的最佳修饰时间。
图5所示为适配体修饰浓度对传感器检测性能的影响。图5(a)适配体传感器对STX相对电流响应信号的变化，当适配体浓度在0.1～0.5μmol/L范围内，适配体传感器的相对电流响应信号(ΔI)逐渐增大，并在适配体浓度为0.5μmol/L时电流信号达到最强，这表明随着适配体浓度的增加，可特异结合STX的适配体逐渐增多，靠近电极表面的MB数量增加，促进了[Fe(CN)6]3-/4-在电极表面的转移，传感器的电流变化量增大。然而，当MB-Apt浓度过高时，MB-Apt对STX的特异识别反会受到抑制。图5(b)所示为MB-Apt修饰浓度不同时，适配体传感器检测STX时电极表面转移电阻的变化。如图所示，MB-Apt浓度在0.1～0.5μmol/L范围时，适配体传感器的转移电阻变化(ΔR)是逐渐增大的，并在适配体浓度为0.5μmol/L时电阻变化量达到最大，继续增加适配体的浓度时，电阻变化量反而减小，这一结果与图5(b)数据相同。因此，选择适配体浓度为0.5μmol/L来进行接下来的研究。
图6所示为适配体与短链DNA(T5)浓度比对传感器检测性能的影响。从图6(a)可以看出，当MB-Apt与T5浓度比在1:20时，适配体传感器的相对电流响应信号(ΔI)达到最强，这可能是由于T5浓度过低，T5对MB-Apt的支撑度不足，而T5分子浓度过高则过多占据电极表面空位结合点，使得适配体传感器的灵敏度降低。图6(b)所示为MB-Apt与T5修饰浓度比对适配体传感器检测STX的转移电阻的影响。当MB-Apt与T5浓度比在1:20时，适配体传感器的转移电阻的变化(ΔR)达到最强，T5分子浓度过低或过高都会对适配体传感器检测STX的灵敏度造成影响，这一结果与DPV数据相符。因此，选用MB-Apt与T5分子最佳浓度比为1:20，即0.5μmol/LMB-Apt，10μmol/LT5。
图7为适配体捕获目标分子STX的时间对传感器检测STX性能的影响。图7(a)为传感器对STX的相对电流响应信号变化曲线，如图所示，随着MB-Apt对STX捕获时间的増加，[Fe(CN)6]3-/4-的DPV电流变化量逐渐増大，并在30分钟达到最高值，之后电流变化信号随着STX的捕获时间增加而下降，这可能因为30分钟时适配体对STX的捕获已经达到饱和，随着STX捕获时间继续增加，反而会导致游离的STX聚集在电极表面，阻碍电极表面的电子转移。由此可推断出，30分钟即可保证STX和MB-Apt充分结合。在图7(b)的相对电阻信号变化中也显示出与电流变化数据相同的趋势。因此，本研究中选择30分钟作为MB-Apt捕获STX的时间。
用本实施例所得的适配体传感器对不同浓度的STX进行检测，结果见图8。从图8(a)可以看出，随着STX浓度的增加，适配体传感器的电流响应信号不断上升，这是由于MB-Apt有效捕捉STX后，适配体构象发生折叠，适配体远电极端修饰的MB靠近电极表面，有效催化了氧化还原反应的进行，促进了电极表面的电子转移。图8(b)为对应的电流变化(ΔI)与STX浓度的校准曲线，从图中可以看出，峰电流变化值(ΔI)与STX在1pmol/L～1nmol/L和1nmol/L～100nmol/L浓度范围内均呈对数线性关系。在1pmol/L～1nmol/L浓度范围内，线性方程为：ΔI(μA)＝6.6logC(nmol/L)+27.76；相关系数(R2)为0.9725。在1nmol/L～100nmol/L浓度范围内，线性方程为：ΔI(μA)＝38.21logC(nmol/L)+17.57；相关系数(R2)为0.9142。得出该传感器的检测限为1pmol/L，且在1nmol/L～100nmol/L浓度范围内检测STX的灵敏度更高。
从图9可以看出，随着STX浓度的增加，纳米阵列适配体传感器的转移电阻响应信号不断下降。如图9(a)所示，T5/MB-Apt/Au@PAN纳米阵列电极的电阻为365Ω，而传感器捕获浓度为1pmol/L的STX时，电阻值降为272Ω，捕获10pmol/L STX时，电极电阻进一步下降到136Ω，随着捕获STX量的增加，电极的电子转移电阻值不断减小。当捕获100nmol/LSTX后，电阻值仅为21Ω。图9(b)为图5a对应的电阻变化量(ΔR)与STX浓度的校准曲线。从图中可以看出，电阻变化值(ΔR)与STX在1pmol/L～1nmol/L和1nmol/L～100nmol/L浓度范围内均呈对数线性关系，在1pmol/L～1nmol/L线性范围内，线性方程分别为：ΔR(Ω)＝65.69logC(nmol/L)+323.28；相关系数(R2)为0.9125；在1nmol/L～100nmol/L范围内，ΔR(Ω)＝25.41logC(nmol/L)+276.63；相关系数(R2)为0.934。这一结果与图9(a)数据一致，表明该适配体传感器可用于STX的灵敏检测。
为了证实本研究中所用MB-Apt能够特异识别STX并与之结合，我们以与其结构较为相似且对其干扰最大的新石房哈毒素(neo-STX)和冈田酸(OA)为干扰毒素，及环境中常见的金属离子(K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe3+)作为干扰物，研究了基于Au@PAN纳米阵列的适配体传感器对STX检测的选择性。研究结果如图10所示。在STX浓度为30nmol/L的条件下，该传感器的电流响应最高，ΔI值为81.5μA。而添加30nmol/L的neo-STX(12.06μA)和OA(12.41μA)的ΔI值明显低于添加STX时的ΔI值。同时，添加100nmol/L的K+、Na+、Ca2+、Mg2+和Fe3+的电流响应都很低，ΔI小于7.5μA。由此可见，本研究中所构建的基于纳米阵列的适配体电化学传感器对STX具有高选择性。这是因为电流的变化是由适配体特异捕获STX，适体构象发生折叠引起的。
从上述实施例可以看出，本发明将适配体电化学传感器与纳米结构相结合，利用适配体电化学传感器的特异性选择与纳米结构的信号放大功能，对待检测物进行特异性识别，且灵敏度高。本发明的传感器可以实现灵敏快速的检测STX，为其他生物小分子的检测提供了参考。
Claims (4)
1.一种基于纳米阵列的适配体电化学传感器在检测石房蛤毒素中的应用，其特征在于：
所述基于纳米阵列的适配体电化学传感器包括工作电极、参比电极和对电极；
所述工作电极为修饰有适配体的有序纳米阵列金电极；所述参比电极为饱和甘汞电极；所述对电极为铂丝电极；
所述修饰有适配体的有序纳米阵列金电极是通过Au-S键将5'端修饰有-SH、3'端修饰有MB的适配体修饰在有序纳米阵列金电极的表面，并用一端修饰有-SH的短链DNA填充剩余的过多结合位点后获得的；
所述适配体为MB-Apt；所述短链DNA为T5。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述适配体电化学传感器是通过包括如下步骤的方法制备获得：
步骤1：有序纳米阵列电极的制备
1a、光刻硅模板的清洗
使用低温等离子体处理仪对硅模板进行清洗，清洗的条件为：功率40 W、处理时间120s；
1b、聚丙烯腈溶液的配制
首先，将聚丙烯腈粉末溶解在DMF中，60℃水浴搅拌30分钟，获得聚丙烯腈溶液，室温下静置备用；
1c、有序纳米电极的制备
取适量步骤1b制备的聚丙烯腈溶液滴铺在硅模板表面至完全覆盖模板，在电热鼓风干燥箱中60 ℃烘30分钟揭下粘贴在玻璃板上，通过离子溅射仪在聚丙烯腈纳米阵列膜的表面溅射一层金纳米颗粒，即得有序纳米阵列电极Au@PAN，室温下保存备用；
步骤2：基于纳米阵列的适配体电化学传感器的制备
以步骤1c获得的有序纳米阵列电极为原始电极，通过Au-S键将核酸适配体共价结合在电极表面，再将短链DNA修饰在电极表面，即为工作电极，进而获得用于检测目标物的适配体传感器；
步骤2中，适配体吸附时间为4 h，适配体修饰浓度为0.5μmol/L；
步骤2中，短链DNA的修饰浓度为10μmol/L，修饰时间为1h。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
步骤1b中，所述聚丙烯腈的Mw=150,000，所得聚丙烯腈溶液的质量浓度为8%。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
步骤1c中，通过离子溅射仪在聚丙烯腈纳米阵列膜的表面溅射一层金纳米颗粒的参数为40 mA/cm2、4 min。
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