CN110320259A - 一种适配体电化学传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种适配体电化学传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适配体电化学传感器的制备方法及应用，制备方法为：首先将丝网印刷碳电极（SPCE）进行活化，随后利用聚(3,4‑亚乙二氧基噻吩)‑聚(苯乙烯磺酸)（PEDOT:PSS）与超纯水体积比1:1的溶液将石墨烯分散，石墨烯分散液修饰于SPCE表面，在红外灯下干燥得到石墨烯修饰的SPCE（GR/SPCE）；随后采用电沉积法制备纳米金修饰的GR/SPCE（AuNPs/GR/SPCE），最后通过金硫键共价结合的方式将一端修饰有巯基的适配体修饰于电极表面，得到适配体修饰的AuNPs/GR/SPCE（Apt/AuNPs/GR/SPCE）。本发明是在一次性可抛丝网印刷碳电极表面修饰石墨烯、纳米金及双酚A适配体，构建基于石墨烯、纳米金信号放大的适配体电化学传感器，能快速、灵敏、高效、便利、低成本地对双酚A进行检测，有较好的实际应用价值。

Description

一种适配体电化学传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种适配体电化学传感器的制备方法及应用，具体涉及一种基于丝网印刷碳电极、石墨烯和纳米金的适配体电化学传感器的制备方法及应用，属于生物传感器和电化学检测技术领域。
背景技术
双酚A（Bisphenol A，BPA）是一种内分泌干扰素，对人类的生殖系统、心血管系统、免疫系统等产生巨大潜在危害。近几年的研究也表明双酚A可以诱导产生基因突变，如产生DNA加合物、异倍体和致突变性，进而导致不孕、流产和出生缺陷。目前用于检测BPA的主要方法有超高效液相色谱-四级杆串法、分子印迹磁性固相萃取/液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、分光光度法、免疫分析法等，大多数都是基于仪器的传统检测方法，其样品前处理复杂、设备昂贵、需要专业工作人员操作、费时等，越来越不能满足当今食品安全快速检测的需求，因此开发简便快捷、灵敏可靠快速且低成本的BPA检测方法对食品安全监控和环境监测具有重要的意义。
与传统基于仪器检测BPA的方法相比，电化学传感器具有操作简单、成本低廉、分析速度快、适用于现场检测等优势，但电化学传感器也有些不足之处，如长期使用稳定性差、特定目标物灵敏度低、特异性差、电极表面易钝化、自行制备的工作电极机械性能差等阻碍了电化学传感器的发展与应用。随着生物技术的发展和纳米材料的创新，基于核酸适配体和纳米材料的电化学传感器因其具有高灵敏度、高选择性、快速、适于现场检测等优势得到了广大研究工作者的关注，期望其能解决当前电化学传感器所遇到的以上问题，并成为双酚A现场快速检测的有效工具。
目前双酚A的检测方法大都是基于大型仪器的传统检测方法，具有仪器设备昂贵，维护费用高，需要专业技术人员操作等缺点，越来越不能满足当今食品安全快速检测的需求。本发明在一次性可抛丝网印刷碳电极表面修饰石墨烯、纳米金及双酚A适配体，构建基于石墨烯、纳米金信号放大的适配体电化学传感器，用于灵敏、高效电化学检测双酚A，同时该传感器还具有检测速度快，成本低，耗费样品体积量少等优点。
发明内容
本发明旨在提供一种基于丝网印刷碳电极、石墨烯和纳米金的适配体电化学传感器的制备方法，所得电化学传感器能用于双酚A的快速检测中。本发明在一次性可抛丝网印刷碳电极表面修饰石墨烯、纳米金及双酚A适配体，构建基于石墨烯、纳米金信号放大的适配体电化学传感器，用于灵敏、高效电化学检测双酚A，同时该传感器还具有检测速度快、成本低、耗费样品体积量少等优点。
本发明中使用的丝网印刷电极具有设计灵活、成本低、可批量制作、样品消耗量少的优点，与小型化的电化学设备相连接，适用于现场快速检测。本发明中用到的纳米材料有石墨烯和纳米金，其目的是改善电极表面状态，提高电化学传感器的灵敏度，纳米金同时还可以与后续的适配体进行共价修饰。石墨烯是一种由碳原子以sp²杂化轨道组成六角型呈蜂巢晶格的二维碳纳米材料，具有优异的电学、光学、力学、机械特性，大的比表面积，高电子迁移率等诸多优点。其大的比表面积和高电子迁移率有效地提高了电化学反应过程中电子交换的速率，可以显著改善电极表面的性能。纳米金指金的微小颗粒，其直径在1~100nm，是一种零维材料，粒径小、比表面积大、导电性好，修饰到电极表面后能够增强电极界面的表面积，不仅能够增强电极的反应性，同时易于实现进一步的功能化。
本发明提供了一种基于丝网印刷碳电极、石墨烯和纳米金的适配体电化学传感器的制备方法，首先将丝网印刷碳电极（SPCE）进行活化，随后利用聚(3,4-亚乙二氧基噻吩)-聚(苯乙烯磺酸)（PEDOT:PSS）与超纯水体积比1:1的溶液将石墨烯分散，石墨烯分散液修饰于SPCE表面，在红外灯下干燥制得石墨烯修饰的SPCE（GR/SPCE）；随后采用电沉积法制备纳米金修饰的GR/SPCE（Au NPs/GR/SPCE），最后通过金硫键共价结合的方式将一端修饰有巯基的适配体修饰于电极表面。
上述制备方法中，其传感界面的构建包括以下步骤：
（1）SPCE的活化：吸取0.1 mol/L硫酸溶液80-90 µL滴于电极表面，用循环伏安法（CV）法活化，扫描范围为-0.6~1.5 V，扫速为50-100 mV/s，扫描20-30圈。最后在10 mmol/L的铁氰化钾溶液中进行循环伏安测试，扫描范围为-0.4~0.8 V，扫速为100 mV/s，观察所得循环伏安曲线的峰电位差值（200 mV左右）。随后用无水乙醇和超纯水依次冲洗，最后氮气吹干，即得活化好的SPCE。
（2）GR/SPCE的制备：用PEDOT:PSS与超纯水1:1混合作为石墨烯的分散剂，配置石墨烯浓度为0.25-0.5 mg/mL的分散液。吸取5-8 µL上述于活化好的电极表面，然后在红外灯下干燥十五分钟至电极表面变干，随后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，即得GR/SPCE。
（3）Au NPs/GR/SPCE的制备：吸取80-90 µL的质量分数1%氯金酸溶液于步骤（2）得到的GR/SPCE表面，采用时间-电流法进行恒电位电沉积对电极进行纳米金的修饰，然后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，即得Au NPs/GR/SPCE；
（4）Apt/Au NPs/GR/SPCE的制备：将1.7 nmol适配体溶于25 mmol/L，pH=7.4的Tris-HCl缓冲液中，得500 nmol/L的适配体溶液，吸取5-8 µL上述适配体溶液于步骤（3）得到的Au NPs/GR/SPCE表面，放置4 ℃的条件下孵育60 min，随后用超纯水冲洗，氮气吹干，即得到Apt/Au NPs/GR/SPCE，该修饰电极即为测定双酚A的适配体电化学传感器。
上述制备方法中，使用的SPCE包含三电极体系，工作电极为碳电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为碳电极。
上述制备方法中， Au NPs/GR/SPCE的制备过程中采用的时间-电流法参数为：工作电压：-200 mV；工作时间：25 s。
上述制备方法中，Apt/Au NPs/GR/SPCE的制备过程中使用的适配体序列为：5，-SH-CCG GTG GGT GGT CAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGGTTC GCA CCA-3，。
本发明提供了一种上述制备方法制得的基于SPCE、石墨烯和纳米金的适配体电化学传感器。
本发明提供了上述基于SPCE、石墨烯和纳米金的适配体电化学传感器在用于双酚A检测中的应用。
电化学传感器检测时，由于适配体可以与双酚A特异性结合，能捕捉到待测溶液中的双酚A于电极表面，最后用差分脉冲伏安法（DPV）法进行检测。由于双酚A本身具有电化学活性，会在电极上产生电化学响应，响应信号的大小通过所得DPV曲线在双酚A特征电位对应的电流值的大小体现，其电流值的大小和双酚A的浓度成正比，建立标准曲线从而实现对双酚A的定量检测。
本发明所构建的适配体电化学传感器能快速、灵敏、高效、低成本地对双酚A进行检测，其线性检测范围为5 ng/mL~500 ng/mL。
本发明以滴涂法将石墨烯修饰到电极表面，利用石墨烯的大比表面积和高电子迁移率有效地提高了电化学反应过程中电子交换的速率，改善了电极表面的性能。随后用电沉积法将纳米金修饰到电极表面，利用纳米金的大比表面积和良好的生物兼容性，可将核酸适配体通过与纳米金形成金硫共价键稳固地负载在电极表面。由于适配体可以与双酚A特异性结合，能捕捉到待测溶液中的双酚A于电极表面，利用DPV进行检测。由于双酚A本身具有电化学活性，会在电极上产生电化学响应，响应信号的大小通过所得DPV曲线在双酚A特征电位对应的电流值的大小体现，其电流值的大小和双酚A的浓度成正比，建立标准曲线从而实现对双酚A的定量检测。
本发明的有益效果：
本发明是在一次性可抛丝网印刷碳电极表面修饰石墨烯、纳米金及双酚A适配体，构建基于石墨烯、纳米金信号放大的适配体电化学传感器，能快速、灵敏、高效、便利、低成本地对双酚A进行检测，有较好的实际应用价值。
附图说明
图1为本发明构建适配体电化学传感器的流程框图；
图2为不同修饰电极（a. SPCE, b. GR/SPCE, c. Au NPs/GR/SPCE, d. Apt/Au NPs/GR/SPCE）在10 mmoL/L铁氰化钾溶液中表征的循环伏安曲线图；
图3为适配体电化学传感器检测双酚A的标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不限制本发明的保护范围。
实施例1
基于SPCE、石墨烯和纳米金，用于BPA的检测的适配体电化学传感器的构建过程如图1所示：
（1）SPCE的活化：吸取0.1 mol/L硫酸溶液80 µL滴于电极表面，用循环伏安法（CV）法活化，扫描范围为-0.6~1.5 V，扫速为50 mV/s，扫描20圈。最后在10 mmol/L的铁氰化钾溶液中进行循环伏安测试，扫描范围为-0.4~0.8 V，扫速为100 mV/s，观察所得循环伏安曲线的峰电位差值（200 mV左右）。随后用无水乙醇和超纯水依次冲洗，最后氮气吹干，即得活化好的SPCE。
（2）GR/SPCE的制备：用PEDOT:PSS与超纯水1:1混合作为石墨烯的分散剂，配置石墨烯浓度为0.25 mg/mL的分散液。吸取5 µL上述于活化好的电极表面，然后在红外灯下干燥十五分钟至电极表面变干，随后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，即得GR/SPCE。
（3）Au NPs/GR/SPCE的制备：吸取80 µL的质量分数1%氯金酸溶液于步骤（2）得到的GR/SPCE表面，采用时间-电流法进行恒电位电沉积对电极进行纳米金的修饰，然后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，即得Au NPs/GR/SPCE；
（4）Apt/Au NPs/GR/SPCE的制备：将1.7 nmol适配体溶于25 mmol/L，pH=7.4的Tris-HCl缓冲液中，得500 nmol/L的适配体溶液，吸取5 µL上述适配体溶液于步骤（3）得到的AuNPs/GR/SPCE表面，放置4 ℃的条件下孵育60 min，随后用超纯水冲洗，氮气吹干，即得到Apt/Au NPs/GR/SPCE，该修饰电极即为测定双酚A的适配体电化学传感器。
实施例2
基于SPCE、石墨烯和纳米金，用于BPA的检测的适配体电化学传感器的构建：
（1）SPCE的活化：吸取0.1 mol/L硫酸溶液90 µL滴于电极表面，用循环伏安法（CV）法活化，扫描范围为-0.6~1.5 V，扫速为100 mV/s，扫描30圈。最后在10 mmol/L的铁氰化钾溶液中进行循环伏安测试，扫描范围为-0.4~0.8 V，扫速为100 mV/s，观察所得循环伏安曲线的峰电位差值（200 mV左右）。随后用无水乙醇和超纯水依次冲洗，最后氮气吹干，即得活化好的SPCE。
（2）GR/SPCE的制备：用PEDOT:PSS与超纯水1:1混合作为石墨烯的分散剂，配置石墨烯浓度为0.5 mg/mL的分散液。吸取8 µL上述于活化好的电极表面，然后在红外灯下干燥十五分钟至电极表面变干，随后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，即得GR/SPCE。
（3）Au NPs/GR/SPCE的制备：吸取90 µL的质量分数1%氯金酸溶液于步骤（2）得到的GR/SPCE表面，采用时间-电流法进行恒电位电沉积对电极进行纳米金的修饰，然后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，即得Au NPs/GR/SPCE；
（4）Apt/Au NPs/GR/SPCE的制备：将1.7 nmol适配体溶于25 mmol/L，pH=7.4的Tris-HCl缓冲液中，得500 nmol/L的适配体溶液，吸取8 µL上述适配体溶液于步骤（3）得到的AuNPs/GR/SPCE表面，放置4 ℃的条件下孵育60 min，随后用超纯水冲洗，氮气吹干，即得到Apt/Au NPs/GR/SPCE，该修饰电极即为测定双酚A的适配体电化学传感器。
实施例3
基于SPCE、石墨烯和纳米金，用于BPA的检测的适配体电化学传感器的构建：
（1）SPCE的活化：吸取0.1 mol/L硫酸溶液85 µL滴于电极表面，用循环伏安法（CV）法活化，扫描范围为-0.6~1.5 V，扫速为80 mV/s，扫描25圈。最后在10 mmol/L的铁氰化钾溶液中进行循环伏安测试，扫描范围为-0.4~0.8 V，扫速为100 mV/s，观察所得循环伏安曲线的峰电位差值（200 mV左右）。随后用无水乙醇和超纯水依次冲洗，最后氮气吹干，即得活化好的SPCE。
（2）GR/SPCE的制备：用PEDOT:PSS与超纯水1:1混合作为石墨烯的分散剂，配置石墨烯浓度为0.35 mg/mL的分散液。吸取7 µL上述于活化好的电极表面，然后在红外灯下干燥十五分钟至电极表面变干，随后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，即得GR/SPCE。
（3）Au NPs/GR/SPCE的制备：吸取85 µL的质量分数1%氯金酸溶液于步骤（2）得到的GR/SPCE表面，采用时间-电流法进行恒电位电沉积对电极进行纳米金的修饰，然后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，即得Au NPs/GR/SPCE；
（4）Apt/Au NPs/GR/SPCE的制备：将1.7 nmol适配体溶于25 mmol/L，pH=7.4的Tris-HCl缓冲液中，得500 nmol/L的适配体溶液，吸取7 µL上述适配体溶液于步骤（3）得到的AuNPs/GR/SPCE表面，放置4 ℃的条件下孵育60 min，随后用超纯水冲洗，氮气吹干，即得到Apt/Au NPs/GR/SPCE，该修饰电极即为测定双酚A的适配体电化学传感器。
实施例4
将实施例1得到的适配体电化学传感器用于电化学测试，分别将不同修饰电极（a.SPCE, b. GR/SPCE, c. Au NPs/GR/SPCE, d. Apt/Au NPs/GR/SPCE）在10 mmoL/L铁氰化钾溶液中进行循环伏安表征，扫描电位范围为-0.4~0.8 V，扫描速度为100 mV/s，循环伏安图见图2，从图2可见，随着层层修饰的完成，SPCE、GR/SPCE、Au NPs/GR/SPCE表征得到的循环伏安曲线的峰电流值逐渐增大，峰电位差逐渐减小，表明石墨烯和纳米金的修饰使电极表面的性能得到提高。固定上适配体后（曲线d）峰电流值减小，是由于单链DNA磷酸骨架上带负电荷，阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-的电子传递，导致氧化峰电流变小。
实施例5
所构建适配体电化学传感器标准曲线的建立：将80 µL不同浓度双酚A标准溶液滴加于Apt/Au NPs/GR/SPCE上，使溶液覆盖住工作电极、参比电极和对电极，放在室温60 min进行双酚A识别过程，使得适配体特异性识别和结合双酚A，随后用差分脉冲伏安法进行检测，得到检测双酚A的标准曲线，从图3可知，所构建的传感器的电化学响应值与双酚A浓度在5ng/mL~500 ng/mL范围内呈现良好的线性关系。

Claims (9)

1.一种适配体电化学传感器的制备方法，其特征在于：首先将SPCE进行活化，随后利用PEDOT:PSS与超纯水体积比1:1的溶液将石墨烯分散，石墨烯分散液修饰于SPCE表面，在红外灯下干燥得到石墨烯修饰的SPCE；随后采用电沉积法制备纳米金修饰的GR/SPCE，最后通过金硫键共价结合的方式将一端修饰有巯基的适配体修饰于电极表面。
2.根据权利要求1所述的适配体电化学传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）SPCE的活化：
吸取0.1 mol/L硫酸溶液80-90 µL滴于电极表面，用循环伏安法法活化，扫描范围为-0.6~1.5 V，扫速为50-100 mV/s，扫描20-30圈；最后在10 mmol/L的铁氰化钾溶液中进行循环伏安测试，扫描范围为-0.4~0.8 V，扫速为100 mV/s，观察所得循环伏安曲线的峰电位差值；随后用无水乙醇和超纯水依次冲洗，最后氮气吹干，即得活化好的SPCE；
（2）石墨烯修饰的SPCE的制备：
用PEDOT:PSS与超纯水1:1混合作为石墨烯的分散剂，配制石墨烯浓度为0.25-0.5 mg/mL的分散液；吸取5-8 µL上述石墨烯分散液于活化好的SPCE电极表面，然后在红外灯下干燥15分钟至电极表面变干，随后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，即得GR/SPCE；
（3）纳米金修饰的GR/SPCE的制备：
吸取80-90 µL的质量分数1%氯金酸溶液于步骤（2）得到的GR/SPCE表面，采用时间-电流法进行恒电位电沉积对电极进行纳米金的修饰，然后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干，即得Au NPs/GR/SPCE；
（4）适配体修饰的Au NPs/GR/SPCE的制备：
将1.7 nmol适配体溶于25 mmol/L，pH=7.4的Tris-HCl缓冲液中，得500 nmol/L的适配体溶液，吸取5-8 µL上述适配体溶液于步骤（3）得到的Au NPs/GR/SPCE表面，放置在4 ℃的条件下孵育60 min，随后用超纯水冲洗，氮气吹干，即得到Apt/Au NPs/GR/SPCE，该修饰电极即为适配体电化学传感器。
3.根据权利要求2所述的适配体电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述SPCE包含三电极体系，工作电极为碳电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为碳电极。
4.根据权利要求2所述的适配体电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤（3）制备过程中采用的时间-电流法工艺参数为：工作电压：-200 mV；工作时间：25 s。
5.根据权利要求2所述的适配体电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤（4）制备过程中使用的适配体序列为：5，-SH-CCG GTG GGT GGT CAG GTG GGA TAG CGT TCC GCGTAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3，。
6.一种权利要求1~5任一项所述的制备方法制得的基于丝网印刷碳电极、石墨烯和纳米金的适配体电化学传感器。
7.一种权利要求6所述的适配体电化学传感器在双酚A检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于： 电化学传感器检测时，用差分脉冲伏安法进行检测；其电流值的大小和双酚A的浓度成正比，建立标准曲线从而实现对双酚A的定量检测。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：双酚A的线性检测范围为5 ng/mL~500 ng/mL。
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