CN115389584A - 面向有机磷现场检测的便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种面向有机磷现场检测的便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器及其应用，便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器以丝网印刷碳电极为工作电极，其结构为SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion。本发明的便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器便携性好，易于小型化和微型化，具备集成的基础，可用于有机磷的检测，对水胺硫磷检测线性范围宽，检出限较低。
Description
技术领域
本发明涉及电化学生物传感器技术领域，尤其涉及一种面向有机磷现场检测的便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器及其应用。
背景技术
有机磷农药多属于磷酸酯或硫代磷酸酯类化合物，由于其高效的杀虫效果应用非常广泛，常用的一些有机磷农药如水胺硫磷、甲基对硫磷等，可通过食道、皮肤和呼吸道引起中毒，具有急性毒性和致癌作用。有机磷类化合物的不合理处置会造成对大气、土壤、水体的污染，农药残留量超标的农产品也可能会引发农药中毒危害人类健康，造成环境污染和人体健康风险。建立简单、灵敏、快速、经济的有机磷传感平台对于缓解人们对环境保护和食品安全的担忧具有重要意义，同时也可以作为神经性毒剂检测的手段。
当前有机磷的热门检测策略以电化学生物传感器为代表，相比于传统的仪器(气相色谱质谱法、高效液相色谱法、分光光度法、毛细管电泳法等)，其分析速度快、不需要复杂的处理、特殊的专业知识或昂贵的设备。
随着越来越多具有优异性能的纳米材料合成并引入电化学传感器，如金属纳米粒子、碳基纳米材料、各种复合材料等。利用它们大的比表面积、高的反应活性、强的吸附能力、良好生物相容性、导电性等优点稳定和改善生物传感界面、放大检测信号，将传感器的检测性能提高到了一个新的水平。
但目前该领域的研究仍然局限于传统的固体电极和大型电化学工作站，传感器制备过程复杂，便携性差，依赖于实验室环境，难以现场应用。
随着技术的发展，电化学生物传感系统的部件已开始微型化，出现了低功耗的便携式仪器和低成本、可大量生产、体积小的丝网印刷电极(SPCE)，这为本就响应速度快、灵敏度高的电化学生物传感器注入了新的活力，大大增强了其现场应用能力。目前基于丝网印刷电极(SPCE)的电化学传感器用于有机磷农药检测报道较少，采用SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion结构用于有机磷水胺硫磷检测的电化学生物传感器尚未见报道。
发明内容
本发明针对上述需要解决的技术问题，提供了一种面向有机磷现场检测的便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器及其应用。
为了实现上述目的，本发明提供了一种面向有机磷现场检测的便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器，所述便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器以丝网印刷碳电极为工作电极，在所述丝网印刷碳电极表面依次修饰石墨烯、纳米金和乙酰胆碱酯酶，用Nafion进行封装。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器在检测有机磷中的应用。
上述的应用，进一步的，所述应用的方法为：
S1、将便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器在含有1mM氯化硫代乙酰胆碱的PBS溶液中进行电化学DPV测试得到初始响应信号I0；
S2、将所述便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器取出，浸入待测样品溶液中；
S3、取出，放入含有1mM ATCl的PBS溶液中进行电化学DPV测试得到抑制后的响应曲线I1；
S4、按照抑制率计算公式如下求出抑制率：
其中，I0为传感器催化底物的初始响应电流值，I1为传感器被ICP处理抑制后催化底物的响应电流值；
S5、根据线性拟合方程计算出样品中水胺硫磷的浓度抑制率与ICP浓度的对数之间的线性回归方程，计算出待测溶液中水胺硫磷浓度。
上述的应用，进一步的，所述S5中拟合后的所述线性回归方程为：
I＝0.276+0.116lgCICP。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明的电化学生物传感器SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion，其结构尚属首创。
2、本发明的电化学生物传感器SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion便携性好，易于小型化和微型化，具备集成的基础。
3、本发明的电化学生物传感器SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion，对水胺硫磷(ICP)检测线性范围宽，检出限较低，其线性检测范围为0.1-2000μg/L，最低检测限为0.012μg/L。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1电化学生物传感器SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion的制备过程原理示意图。
图2为本发明实施例1的SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion传感器检测水胺硫磷的检测结果，(A)为SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion传感器被不同浓度ICP抑制10min后在含有1mMATCl的PBS溶液(pH＝7.5)中的DPV曲线；(B)为DPV峰值电流抑制率与ICP浓度对数的校准曲线。
图3为本发明实施例1的SPCE/GR/AChE/Nafion传感器检测水胺硫磷的检测结果，(A)为SPCE/GR/AChE/Nafion传感器被不同浓度ICP抑制10min后在含有1mM ATCl的PBS溶液(pH＝7.5)中的DPV曲线；(B)为DPV峰值电流抑制率与ICP浓度对数的校准曲线。
图4为本发明实施例1的SPCE/AChE/Nafion传感器检测水胺硫磷的检测结果，(A)为SPCE/AChE/Nafion传感器被不同浓度ICP抑制10min后在含有1mM ATCl的PBS溶液(pH＝7.5)中的DPV曲线；(B)为DPV峰值电流抑制率与ICP浓度对数的校准曲线。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种本发明的用于检测水胺硫磷的电化学酶生物传感器，在丝网印刷碳电极(SPCE)上，负载石墨烯(GR)和纳米金(AuNPs)，增强灵敏度，然后将乙酰胆碱酯酶(AChE)做为生物敏感物质负载上去，使用Nafion封装。其结构为SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion。其制备方法和检测过程参见图1。
其制备方法为：
(1)丝网印刷碳电极(SPCE)首先使用使用PBS缓冲液(pH＝7.5)进行预处理来活化，然后用氮气吹干。
(2)SPCE工作电极表面滴涂10μL 0.05-0.35mg/ml的GR分散液，室温下干燥。
(3)然后滴涂10μL浓度为50-200μg/ml的AuNPs分散液，室温下干燥。
(4)然后滴涂7.5μL(0.2-1.4U)的AChE缓冲液，在4℃冰箱中干燥。
(5)最后滴涂5μL 1％的Nafion溶液封装电极表面，置于4℃冰箱中干燥。
一种本实施例1的电化学酶生物传感器在检测水胺硫磷中的应用，其应用方法为：通过电化学差分脉冲伏安法(DPV)、循环伏安法(CV)等电化学测试方法分析表征电极的电化学性能以及对底物氯化硫代乙酰胆碱(ATCl)浓度的响应电流，采用酶抑制法实现了对水胺硫磷(ICP)的高效灵敏检测。
具体检测步骤为：
(1)电化学酶生物传感器用去离子水清洗后，放入含有1mM ATCl的PBS溶液中进行电化学DPV测试得到抑制后的响应曲线I0。
(2)将电化学酶生物传感器取出用去离子水清洗干净后，浸入样品溶液15min。
(3)将水胺硫磷农药母液稀释成梯度浓度的标准溶液(0.5～100ng/mL)，将实施例1的电化学酶生物传感器在含有1mM氯化硫代乙酰胆碱(ATCl)的PBS溶液液(pH＝7.5)中进行电化学DPV测试(电位范围为0.3～1.1V，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期为0.02s，调制幅度为0.05V，静置时间为2s)得到初始响应信号I1。
(4)按照抑制率计算公式如下求出抑制率(Inhibition)：
其中，I0为传感器催化底物的初始响应电流值，I1为传感器被ICP处理抑制后催化底物的响应电流值。
(5)根据线性拟合方程计算出样品中水胺硫磷的浓度抑制率与ICP浓度的对数之间成线性关系。
图2为SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion传感器被不同浓度ICP抑制10min后在含有1mMATCl的PBS溶液(pH＝7.5)中的检测结果，图中A为DPV曲线(ICP浓度a-g：0.1、0.2、2、10、100、500、2000μg/L)；(B)DPV峰值电流抑制率与ICP浓度对数的校准曲线。
从图中可以看出，拟合后的方程为：
I＝0.276+0.116lgCICP(R2＝0.992)，
其线性检测范围为0.1～2000μg/L，检出限为0.012μg/L(S/N＝3)。
测试原理：采用竞争法进行有机磷检测。乙酰胆碱酯酶与样品中的水胺硫磷结合，剩余的乙酰胆碱酯酶催化氯化硫代乙酰胆碱ATCl得到电流信号，峰值电流与剩余的乙酰胆碱酯酶有正向对应关系。根据不同水胺硫磷浓度对信号的抑制程度实现对水胺硫磷的定量检测。
对比例1：
一种本发明的用于检测水胺硫磷的电化学酶生物传感器，在丝网印刷碳电极(SPCE)上，负载石墨烯(GR)，增强灵敏度，然后将乙酰胆碱酯酶(AChE)做为生物敏感物质负载上去，使用Nafion封装。其结构为SPCE/GR/AChE/Nafion。
其制备方法为：
(1)丝网印刷碳电极(SPCE)首先使用使用PBS缓冲液(pH＝7.5)进行预处理来活化，然后用氮气吹干。
(2)SPCE工作电极表面滴涂10μL 0.05-0.35mg/ml的GR分散液，室温下干燥。
(3)然后滴涂7.5μL(0.2～1.4U)的AChE缓冲液，在4℃冰箱中干燥。
(4)最后滴涂5μL 1％的Nafion溶液封装电极表面，置于4℃冰箱中干燥。
一种本实施例1的电化学酶生物传感器在检测水胺硫磷中的应用，其应用方法与实施例1一致。
图3为SPCE/GR/AChE/Nafion传感器被不同浓度ICP抑制10min后在含有1mM ATCl的PBS溶液(pH＝7.5)中的检测结果，图中为ADPV曲线(ICP浓度a-g：0.5、2、10、50、100、500、2000μg/L)；B为DPV峰值电流抑制率与ICP浓度对数的校准曲线。
从图中可以看出：经不同浓度ICP孵育后的DPV响应变化得出的抑制率和ICP浓度对数值之间的校正曲线的线性方程为I＝0.228+0.121lgCICP(R2＝0.990)，其线性检测范围为0.5-2000μg/L，检出限为0.041μg/L(S/N＝3)。
对比例2：
一种本发明的用于检测水胺硫磷的电化学酶生物传感器，在丝网印刷碳电极(SPCE)上，将乙酰胆碱酯酶(AChE)做为生物敏感物质负载上去，使用Nafion封装。其结构为SPCE/AChE/Nafion。
其制备方法为：
(1)丝网印刷碳电极(SPCE)首先使用使用PBS缓冲液(pH＝7.5)进行预处理来活化，然后用氮气吹干。
(2)然后滴涂7.5μL(0.2～1.4U)的AChE缓冲液，在4℃冰箱中干燥。
(3)最后滴涂5μL 1％的Nafion溶液封装电极表面，置于4℃冰箱中干燥。
一种本实施例1的电化学酶生物传感器在检测水胺硫磷中的应用，其应用方法与实施例1一致。
图4为SPCE/AChE/Nafion传感器被不同浓度ICP抑制10min后在含有1mM ATCl的PBS溶液(pH＝7.5)中的检测结果，图中A为DPV曲线(ICP浓度a-g：1、5、20、50、100、250、500μg/L)；B为DPV峰值电流抑制率与ICP浓度对数的校准曲线。
从图中可以看出：经不同浓度ICP孵育后的DPV响应变化得出的抑制率和ICP浓度对数值之间的校正曲线的线性方程为I＝0.042+0.151lgCICP(R2＝0.995)，其线性检测范围为1-500μg/L，检出限为0.77μg/L(S/N＝3)。
综上实施例1、对比例1和对比例2的结果，可知：
SPCE/AChE/Nafion传感器校正曲线线性方程为I＝0.042+0.151lgCICP(R2＝0.995)，检出限为0.77μg/L(S/N＝3)。
SPCE/GR/AChE/Nafion传感器的校正曲线的线性方程为I＝0.228+0.121lgCICP(R2＝0.990)，检出限为0.041μg/L(S/N＝3)。
SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion传感器的校正曲线的线性方程为I＝0.276+0.116lgCICP(R2＝0.992)，检出限为0.012μg/L(S/N＝3)。
结果表明，经过GR和AuNPs共同改性后的SPCE构建的传感器SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion检测性能得到明显提升,对水胺硫磷(ICP)抑制的响应更灵敏，具有更宽的线性范围和更低的检测限。
实施例2：
一种实施例1的电化学酶生物传感器在检测环境中水胺硫磷的应用，具体应用方法为：
选取了黄瓜、自来水作为实际样本检验的对象，加入已知浓度的ICP进行平均回收率试验，以此评估实施例1中SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion生物传感器的实际应用能力。表1为回收研究结果。
表1：SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion传感器在黄瓜和自来水样品中的ICP回收率结果表
从表1的结果可知：实施例1的SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion传感器回收率在92.51％-110.41％之间，在检测实际样品中的OPs时表现出较好的准确性，具有巨大的实际应用潜力。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (4)
1.一种面向有机磷现场检测的便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器，其特征在于，所述便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器以丝网印刷碳电极为工作电极，其结构为SPCE/GR/AuNPs/AChE/Nafion。
2.一种权利要求1所述的便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器在检测有机磷中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：
S1、将便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器在含有1mM氯化硫代乙酰胆碱的PBS溶液中进行电化学DPV测试得到初始响应信号I0；
S2、将所述便携式电化学乙酰胆碱酯酶传感器取出，浸入待测样品溶液中；
S3、取出，放入含有1mM ATCl的PBS溶液中进行电化学DPV测试得到抑制后的响应曲线I1；
S4、按照抑制率计算公式如下求出抑制率：
其中，I0为传感器催化底物的初始响应电流值，I1为传感器被ICP处理抑制后催化底物的响应电流值；
S5、根据线性拟合方程计算出样品中水胺硫磷的浓度抑制率与ICP浓度的对数之间的线性回归方程，计算出待测溶液中水胺硫磷浓度。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述S5中拟合后的所述线性回归方程为：
I＝0.276+0.116lgCICP。
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