CN105675676A - 用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学dna传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学DNA传感器及其制备方法和应用，其中电化学DNA传感器包括在三电极体系中用作工作电极的玻碳电极，玻碳电极反应端表面修饰有包括自掺杂聚苯胺纳米纤维、有序介孔碳和金纳米粒的组成的复合膜，复合膜表面自组装有DNA捕获探针，DNA捕获探针的核苷酸序列为SEQ？ID？NO.1的DNA序列。其制备方法，包括修饰自掺杂聚苯胺纳米纤维和有序介孔碳、电沉积金纳米粒子、组装DNA捕获探针等步骤。本发明的用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学DNA传感器，能够检测两种目标物质、稳定性高、使用寿命长、抗干扰能力强、检测范围宽、检测极限低，可用于检测汞离子或半胱氨酸。

Description

用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学DNA传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，尤其涉及一种用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学DNA传感器及其制备方法和应用。

背景技术

汞作为重金属污染物之一，具有高毒性并对人体健康和生态系统有着严重危害性。汞在环境中的存在形式有很多种，其中汞离子(Hg²⁺)作为一种最常见和最稳定的存在形式，广泛地分布在各类水体中。世界健康组织(WHO)曾规定饮用水中汞离子总含量不能超过0.001mg/L。由此可见，发明一种绿色环保、成本低廉且可以快速灵敏地检测水体中的汞离子浓度的传感器是极其必要的。

半胱氨酸(Cys)是一种含硫的自然氨基酸，在生物有机体内扮演着重要的角色，其与生物体内蛋白质的合成有着密不可分的联系。近些年来，Cys被发现可作为一种潜在的神经毒素标志物，以及各种疑难杂症如心脏病和AIDS的生理调节剂。因此对生物样品内的Cys进行定量检测也显得极其重要。

目前，关于检测汞离子和Cys的方法有很多，其中传统的检测技术包括原子吸收/发射光谱法(AAS/AES)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、冷蒸汽原子荧光光谱法(CVAFS)、高效液相色谱法(HPLC)以及毛细管电泳法等，这些方法虽然有较高的精确度和灵敏性，但往往样品制备复杂且耗时长，要求专业的操作人员且机器笨重、成本高。近些年来，伏安法、荧光法等一系列新的方法被研究用来检测汞离子和Cys，而电化学方法由于其独特的优势如方便携带、灵敏度高等已被广泛研究并应用于检测重金属离子或有机物分子。

现今，随着电化学技术及生物传感技术的日益成熟，各式各样的电化学生物传感器已经被研发并用于检测各种目标物质，其中电化学DNA传感器便是目前研究比较广泛的一种传感器之一。这些传感器中的大部分有着良好的线性范围和低的检测极限，然而它们中大多数只针对一种目标对象，不能用来检测多种物质。为了提高传感器的利用效率，发明一种可以检测多种目标物质的传感器也是极其必要的。此外，在构建电化学生物传感器的过程中，工作电极作为其中重要的一部分，如何提高它的稳定性和电子传导能力也是研究的热点和重点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够检测两种目标物质、稳定性高、使用寿命长、抗干扰能力强、检测范围宽、检测极限低的用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学DNA传感器，并相应提供一种简单安全，成本低，制作快速的电化学DNA传感器的制备方法，在此基础上，还提供一种上述电化学DNA传感器的应用，该应用能够以低的检测极限及较强的抗干扰性分别实现对汞离子和半胱氨酸的检测。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种电化学DNA传感器，包括在三电极体系中用作工作电极的玻碳电极，所述玻碳电极反应端表面修饰有包括自掺杂聚苯胺纳米纤维、有序介孔碳和金纳米粒子的组成的复合膜，所述复合膜表面自组装有DNA捕获探针，所述DNA捕获探针的核苷酸序列为SEQIDNO.1的DNA序列。进一步优选的，所述自掺杂聚苯胺纳米纤维、有序介孔碳和金纳米粒子从内至外依次排列于所述玻碳电极反应端表面形成复合膜。进一步优选的，所述DNA捕获探针可通过T-Hg²⁺-T结构错配形成发夹结构。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的电化学DNA传感器的制备方法，包括以下步骤：

S1、修饰自掺杂聚苯胺纳米纤维：在玻碳电极反应端表面滴加自掺杂聚苯胺纳米纤维悬浮液，得到自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极；

S2、修饰有序介孔碳：在所述步骤S1得到的自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面滴加有序介孔碳悬浮液，得到有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极；

S3、电沉积金纳米粒子：在所述步骤S2得到的有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面电沉积金纳米粒子，得到金纳米粒子/有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极；

S4、自组装DNA捕获探针：在所述步骤S3得到的金纳米粒子/有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面滴加DNA捕获探针进行反应，使所述DNA捕获探针通过金硫共价键固定在所述玻碳电极反应端表面，完成所述电化学DNA传感器的制备。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S1中的自掺杂聚苯胺纳米纤维采用一步化学氧化法合成。进一步优选的，所述化学氧化法的具体步骤为：将溴化十六烷基三甲铵(CTAB)，苯胺(AN)，2-氨基苯磺酸(ABS)溶解于盐酸溶液中，然后加入过硫酸铵(APS)溶液，在5℃下反应24h得到自掺杂聚苯胺纳米纤维。进一步优选的，所述CTAB、AN、ABS的质量比为0.22∶0.46∶0.86。所述过硫酸铵的浓度为0.06M。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S2中的所述有序介孔碳采用以下方法制备得到：

S2-1.合成硅基分子筛SBA-15：将嵌段共聚物P123和正硅酸乙酯混合后在140℃～150℃下水浴，然后焙烧得到硅基分子筛SBA-15；

S2-2.合成有序介孔碳：所述硅基分子筛SBA-15与水、蔗糖、浓硫酸混合得到混合物，将所述混合物置于100℃～160℃温度下干燥直至混合物变为黑色，然后将黑色的混合物置于惰性气体保护下进行高温热解得到热解产物，将所述热解产物经过洗涤、干燥等步骤得到所述有序介孔碳。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S3中，采用计时电流法将所述金纳米离子沉积在所述有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面，所述计时电流法的沉积电位为0.2V，沉积时间为60s～150s。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S4具体为：在所述步骤S3得到的金纳米粒子/有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面滴加DNA捕获探针，在4℃下反应12h；然后转入6-巯基乙醇(MCH)溶液中培养0.5h～1h，完成所述电化学DNA传感器的制备。进一步优选的，所述DNA捕获探针的浓度为1μM～5μM。所述6-巯基乙醇的浓度为1mM。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的电化学DNA传感器或采用所述制备方法制得的电化学DNA传感器在检测汞离子中的应用。

上述的应用，优选的，所述检测汞离子的应用方法包括以下步骤：

(1)将所述电化学DNA传感器的玻碳电极反应端浸泡在含汞离子的待测溶液中反应，使所述电化学传感器上的DNA捕获探针与待测溶液中的汞离子形成T-Hg²⁺-T错配；

(2)将所述电化学DNA传感器转入含信号指示剂AQDS的溶液中，使所述AQDS插入DNA双链中；

(3)以经过所述步骤(2)处理过后的玻碳电极作为工作电极，置于含NaCl的PBS缓冲液中，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，采用差分脉冲伏安法测试；根据汞离子浓度与峰电流变化关系构建检测线性回归方程，根据线性回归方程计算待测溶液中的汞离子浓度。

上述的应用，优选的，所述步骤(1)中，所述反应时间为1h～2h。

上述的应用，优选的，所述步骤(2)中，所述反应时间为6h～8h。

上述的应用，优选的，所述步骤(3)中，所述缓冲溶液是在0.05MPB缓冲溶液中加入NaCl得到的PBS缓冲溶液，缓冲溶液中含0.2M～0.5MNaCl，缓冲溶液的PH值为7.0。进一步优选的，缓冲溶液中含0.3MNaCl。

上述的应用，优选的，所述汞离子浓度与峰电流变化关系的检测线性回归方程为：

y₁＝-9.147x₁+164.597(1)

式中，y₁表示峰电流与背景峰电流的差值，即ΔIp，单位为μA；x₁为待测溶液中汞离子浓度负对数值，即-log[Hg²⁺]，汞离子浓度的单位为M；式(1)的相关系数R²＝0.9934，汞离子检测线性范围为1×10^-6M～1×10^-14M，检测下限为6.152×10^-16M。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的电化学DNA传感器或采用所述制备方法制得的电化学DNA传感器在检测半胱氨酸中的应用。

上述的应用，优选的，所述检测半胱氨酸的应用方法包括以下步骤：

(1)将所述电化学DNA传感器的玻碳电极反应端浸泡在含汞离子的溶液中反应，使所述电化学传感器上的DNA捕获探针与溶液中的汞离子形成T-Hg²⁺-T错配；

(2)将所述电化学DNA传感器转入含信号指示剂AQDS的溶液中，使所述AQDS插入DNA双链中；

(3)将所述电化学DNA传感器转入含半胱氨酸的待测溶液中；

(4)以经过所述步骤(3)处理后的玻碳电极作为工作电极，置于含NaCl的PBS缓冲液中，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，采用差分脉冲伏安法测试；根据半胱氨酸浓度与峰电流变化关系构建检测线性回归方程，根据线性回归方程计算待测溶液中的半胱氨酸浓度。

上述的应用，优选的，当所述汞离子浓度为100nM时，所述半胱氨酸浓度与峰电流变化关系的检测线性回归方程为：

y₂＝10.017x₂–36.047(2)

式中，y₂表示峰电流，即I_p，单位为μA；x₂为溶液中半胱氨酸浓度负对数值，即-log[Cys]，半胱氨酸浓度的单位为M；式(2)的相关系数R²＝0.9895，半胱氨酸检测线性范围为1×10^-7M～1×10^-11M，检测下限为1×10^-13M。

上述的应用，优选的，所述步骤(3)中，所述反应时间为30min～40min。

上述的应用，优选的，所述步骤(4)中，所述缓冲溶液是在0.05MPB缓冲溶液中加入NaCl得到的PBS缓冲溶液，缓冲溶液中含0.2M～0.5MNaCl，缓冲溶液的PH值为7.0。进一步优选的，缓冲溶液中含0.3MNaCl。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明提供的用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学DNA传感器，玻碳电极反应端表面修饰有自掺杂聚苯胺纳米纤维、有序介孔碳和金纳米粒子组成的复合膜，复合膜表面自组装有DNA捕获探针，如果待测水体中存在汞离子，DNA捕获探针会特异性地与汞离子通过T-Hg²⁺-T结构折叠形成发夹状的双链结构，而信号指示剂AQDS会嵌入DNA双链结构中；电化学信号随着Hg²⁺浓度的增加而增强，从而达到检测Hg²⁺的目的。此外，半胱氨酸是一种含硫氨基酸，半胱氨酸中含有巯基(-SH)，其可与Hg²⁺结合形成复合物R-S-Hg²⁺-S-R，从而导致T-Hg²⁺-T破坏，使捕获DNA探针从因Hg²⁺诱发形成的发夹结构恢复成单链状态，从而导致插入发夹结构中的指示剂AQDS脱落释放到溶液中，致使信号减小。检测半胱氨酸的前提是DNA必须在Hg²⁺的诱发下形成了双链的发夹结构，因为AQDS只能插入双链DNA中，所以发夹结构决定着指示剂AQDS在DNA上的附着量。因此上述的电化学DNA传感器具有较强的抗干扰能力。

2、本发明提供的用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学DNA传感器，具有宽的检测范围和低的检测极限。这得益于自掺杂聚苯胺纳米纤维、有序介孔碳以及金纳米粒子的协同放大作用，使得工作电极有更好的电子传递能力，很大程度上提高了该电化学DNA传感器的敏感度。此外，所选的信号指示剂是一种阴离子指示剂，减少了DNA分子对指示剂的静电吸附作用，从而降低了信噪比。

3、本发明提供的用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学DNA传感器，具有好的稳定性和长的使用寿命。这得益于自掺杂聚苯胺纳米纤维是一种富含氨基和亚氨基的网状结构，其可以很稳定地固定在玻碳电极反应端表面，且可以使棒状有序介孔碳均匀分散在其表面；此外，电沉积在有序介孔碳表面的金纳米粒子为DNA捕获探针的固定提供了很好的平台，这样DNA捕获探针可以通过金硫键稳定地附着在玻碳电极的反应端表面，从而提高了该传感器的稳定性和使用寿命。

4、本发明提供的用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学DNA传感器的制备方法，制作工艺简单、成本低廉，操作便捷、无污染且应用范围广，可以实现对汞离子和半胱氨酸的特异性检测。

5、本发明提供的电化学DNA传感器可用于检测汞离子和半胱氨酸两种目标物质，应用范围涉及水体和生物体，提高了生物传感器的利用率；同时除检测Hg²⁺能够获得了较好的检测范围外，半胱氨酸的检测范围和检测极限也得到了很大的提高。

附图说明

图1为本发明实施例1的电化学DNA传感器检测Hg²⁺时测得的差分脉冲伏安谱。

图2为本发明实施例1的电化学DNA传感器检测半胱氨酸时测得的差分脉冲伏安谱。

图3为不同修饰电极在含0.1MKCl的5.0mM铁氰溶液([Fe(CN)₆]^3-/4-)中测得的循环伏安图。

图4为本发明电化学DNA传感器的自掺杂聚苯胺纳米纤维(SPAN)的透射电镜图。

图5为本发明电化学DNA传感器的有序介孔碳(OMC)的扫描电镜图。

图6为本发明实施例3中Hg²⁺浓度与峰电流变化关系的检测线性回归图。

图7为本发明实施例4中，在所用Hg²⁺浓度为100nM时，半胱氨酸浓度与峰电流变化关系的检测线性回归图。

图8为本发明实施例6中对Hg²⁺的选择性测试。

图9为本发明实施例6中对半胱氨酸的选择性测试。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例中所采用的原料和仪器均为市售。

实施例1

一种用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学DNA传感器，包括在三电极体系中用作工作电极的玻碳电极，玻碳电极反应端表面修饰有复合膜，复合膜是从内到外依次排列的自掺杂聚苯胺纳米纤维、有序介孔碳和金纳米粒子组成的，复合膜表面自组装有DNA捕获探针，DNA捕获探针可通过T-Hg²⁺-T结构错配形成发夹结构。

DNA捕获探针为SEQIDNO.1的核苷酸序列，具体为：

5’-SH-(CH₂)₆-TTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTT-3’

当将上述电化学DNA传感器置于含汞离子的待测溶液中时，DNA捕获探针的3’端“TTGTTTGTT”会与5’端“TTCTTTCTT”折叠形成发夹状的双链结构，而信号指示剂AQDS会嵌入DNA的双链结构中，在pH为7.0的PBS缓冲液中(PBS缓冲液采用在0.05MPB缓冲溶液中加入0.3MNaCl得到。)测试差分脉冲伏安谱(DPV)，根据汞离子浓度与峰电流变化关系构建检测线性回归方程，根据线性回归方程可以得到待测溶液中的汞离子浓度。

参见图1，其为上述电化学DNA传感器分别检测含0M、1fM、1pM、1nM、1μM汞离子溶液时测得的差分脉冲伏安谱，很明显可以看出峰电流随着汞离子浓度的增加而增大。

当待测溶液中含半胱氨酸时，半胱氨酸(Cys)可以竞争性地把T-Hg²⁺-T结构中的汞离子脱离出来而与之形成稳定的Hg²⁺-Cys复合物，因而使DNA形成的发夹结构重新恢复成自由单链状态，嵌入DNA双链发夹结构中的指示剂AQDS被释放出来，从而使测得的DPV峰电流减小。在pH为7.0的PBS缓冲液中(PBS缓冲液采用在0.05MPB缓冲溶液中加入0.3MNaCl得到。)中测试差分脉冲伏安谱(DPV)，根据半胱氨酸浓度与峰电流变化关系构建检测线性回归方程，根据线性回归方程可以得到待测溶液中的半胱氨酸浓度。

参见图2，其为该电化学DNA传感器在100nM汞离子和AQDS中处理后分别检测含0M、1pM、1nM、1μMCys溶液时测得的差分脉冲伏安谱，很明显可以看出峰电流随着Cys浓度的增加而减小。

由此可见，实施例1中的电化学DNA传感器可以用来检测Hg²⁺和Cys，并根据差分脉冲伏安谱的峰电流在相应应用情况下判断汞离子和Cys的浓度。

实施例2

一种上述用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学DNA传感器的制备方法，包括以下步骤：

S1、修饰自掺杂聚苯胺纳米纤维(SPAN)：在处理干净的玻碳电极反应端表面滴加6μLSPAN悬浮液得到SPAN修饰的玻碳电极，即SPAN/GCE。图3示出了SPAN/GCE在含0.1MKCl的5.0mM铁氰溶液([Fe(CN)₆]^3-/4-)中测得的循环伏安图(请确认)。

所述SPAN采用一步化学氧化法合成，具体步骤为：

将0.22g溴化十六烷基三甲铵(CTAB)、0.46g苯胺(AN)、0.86g2-氨基苯磺酸(ABS)溶解于80mL0.15M的盐酸溶液中，然后加入40mL0.06M过硫酸铵(APS)溶液，将其置于5℃下反应24h，最后将生成的深绿色沉淀物过滤，用去离子水和乙醇洗涤，制得自掺杂聚苯胺纳米纤维，室温下干燥后待用。

参照图4中SPAN的透射电镜(TEM)图，从图中可知SPAN通过节点互相交错形成网状或环状结构，直径约为50nm～60nm。

S2、修饰有序介孔碳(OMC)：在步骤S1得到的自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面滴加5μLOMC悬浮液得到有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极，即OMC/SPAN/GCE。图3示出了OMC/SPAN/GCE在含0.1MKCl的5.0mM铁氰溶液([Fe(CN)₆]^3-/4-)中测得的循环伏安图。

所述OMC是采用包括以下步骤的方法合成：

S2-1、合成硅基分子筛SBA-15：将嵌段共聚物P123置于盐酸中溶解得到嵌段共聚物P123溶液，然后在嵌段共聚物P123溶液中逐滴加入正硅酸乙酯，搅拌后在30℃下水浴加热20h(30℃～35℃均可实施)，再转移至反应釜中，在140℃条件下水浴加热24h得到混合液(140℃～150℃均可实施)，将混合液抽滤提取沉淀，用去离子水洗涤至中性，风干，再放入电阻炉中焙烧，升温速度为1℃/min，上升至550℃保持4h，得到硅基分子筛SBA-15。

S2-2、合成OMC：取1g步骤S2-1制得的硅基分子筛SBA-15与5mL水、1.25g的蔗糖、0.14g的浓硫酸混合得到混合物，将混合物置于鼓风干燥箱中，100℃干燥6h，然后将温度提高至160℃并保持6h后，混合物的颜色变为黑色，将黑色的混合物置于具有氮气保护氛围的石英管式炉中，进行高温热解(高温热解的方式为：以2K/min的速率将温度升至1173.15K并保持2h)得到热解产物，将热解产物用NaOH溶液洗涤两次以去除热解产物中的二氧化硅分子筛模板(洗涤方式为：将热解产物在3M的NaOH溶液中以80℃加热10min)，最后将洗涤后的热解产物用去离子水洗涤至中性，在100℃下干燥4h得到OMC。

参照图5OMC的扫面电镜图(SEM)，从图中可知OMC呈棒状，长度大约为500nm～1μm。

S3、电沉积金纳米粒子(AuNPs)：将前述OMC/SPAN/GCE反应端表面浸泡在含0.5mM高氯酸的1wt％氯金酸(HAuCl₄)溶液中，采用计时电流法电沉积AuNPs，沉积电位为0.2V，沉积时间为120s。沉积完后用超纯水冲洗，干燥得到AuNPs/OMC/SPAN/GCE。图3示出了AuNPs/OMC/SPAN/GCE在含0.1MKCl的5.0mM铁氰溶液([Fe(CN)₆]^3-/4-)中测得的循环伏安图。

S4.自组装DNA捕获探针：在前述AuNPs/OMC/SPAN/GCE反应端表面滴加2μMDNA捕获探针(1μM～5μM均可实施)，在4℃下反应12h，用TBS缓冲液(含0.5MNaCl的Tris-HCl缓冲液，pH为7.0)冲洗后再转入1mM6-巯基乙醇溶液中培养0.5h(0.5～1h均可实施)，得到均衡的DNA分子单层，最后用TBS缓冲液冲洗得到组装有DNA捕获探针的AuNPs/OMC/SPAN/GCE，即DNA/AuNPs/OMC/SPAN/GCE。图3示出了DNA/AuNPs/OMC/SPAN/GCE在含0.1MKCl的5.0mM铁氰溶液([Fe(CN)₆]^3-/4-)中测得的循环伏安图。

实施例3

一种实施例1的电化学DNA传感器在检测汞离子中的应用，包括以下步骤：

(1)将组装有DNA捕获探针的金纳米粒子/有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端分别浸泡在含不同浓度的汞离子溶液中1h(汞离子浓度分别为1×10^{- 6}M、1×10^-7M、1×10^-8M、1×10^-9M、1×10^-10M、1×10^-11M、1×10^-12M、1×10^-13M、1×10^-14M)，取出玻碳电极后用TBS缓冲溶液冲洗，然后在含信号指示剂AQDS的溶液中浸泡处理6h，取出冲洗干燥后待用。

(2)将步骤(1)处理过后的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，在pH为7.0的PBS缓冲液中(PBS缓冲液采用在0.05MPB缓冲溶液中加入0.3MNaCl得到。)，测试差分脉冲伏安谱(DPV)；

(3)根据汞离子浓度与峰电流变化关系构建检测线性回归方程，根据线性回归方程计算待测溶液中的汞离子浓度。

参照图6，汞离子浓度与峰电流变化关系的检测线性回归图，从图中可知检测线性回归方程为：

y₁＝-9.147x₁+164.597(1)

式中，y₁表示峰电流与背景峰电流的差值，即ΔIp，单位为μA；x₁为待测溶液中汞离子浓度负对数值，即-log[Hg²⁺]，汞离子浓度的单位为M；式(1)的相关系数R²＝0.9934，汞离子检测线性范围为1×10^-6M～1×10^-14M，检测下限为6.152×10^-16M(检测下限按照3倍空白样的标准偏差计算)。

实施例4

一种实施例1的电化学DNA传感器在检测半胱氨酸中的应用，包括以下步骤：

(1)将组装有DNA捕获探针的金纳米粒子/有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端浸泡在含100nM汞离子溶液中1h，用TBS缓冲液冲洗后在含信号指示剂AQDS的溶液中浸泡处理6h，再用TBS缓冲溶液冲洗，然后将上述玻碳电极分别浸泡在含不同浓度的半胱氨酸溶液中30min(半胱氨酸浓度分别为1×10^-7M、1×10^-8M、1×10^-9M、1×10^{- 10}M、1×10^-11M)，取出冲洗干燥后待用。

(2)将步骤(1)处理过后的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，在pH为7.0的PBS缓冲液中(PBS缓冲液采用在0.05MPB缓冲溶液中加入0.3MNaCl得到)，测试差分脉冲伏安谱(DPV)。

(3)根据半胱氨酸浓度与峰电流变化关系构建检测线性回归方程，根据线性回归方程计算待测溶液中的半胱氨酸浓度。

参照图7，半胱氨酸浓度与峰电流变化关系的检测线性回归图，从图中可知检测线性回归方程为：

y₂＝10.017x₂–36.047(2)

式中，y₂表示峰电流，即I_p，单位为μA；x₂为溶液中半胱氨酸浓度负对数值，即-log[Cys]，半胱氨酸浓度的单位为M；式(2)的相关系数R²＝0.9895，半胱氨酸检测线性范围为1×10^-7M～1×10^-11M，检测下限为1×10^-13M。

实施例5：对电化学DNA传感器的检测精确度进行检查

为了进一步验证实施例1的电化学DNA传感器在实际应用中的检测效果，现采用标准添加法，将该电化学DNA传感器用于实际样品中的目标物检测(测定方法参照实施例3和实施例4)，进行回收率实验。

具体的实验步骤：将湘江水和自来水分别经过滤等预处理后，用Tris-HCl缓冲溶液调节pH至7.0；另外，将人体尿样稀释，用乙腈沉淀预处理去除其中可能存在的半胱氨酸，将其分成两份并分别调节pH至7.0。在上述样品中标准添加已知浓度的目标物质，各样品中目标物质的标准添加浓度参照表1，最后将实施例1的电化学DNA传感器分别按照实施例3和实施例4的方法检测待测溶液中的Hg²⁺和半胱氨酸浓度，测定结果列于表1中。

表1：待测溶液的回收率验证结果

从表1中可以看出，本发明的电化学DNA传感器在可测定的浓度范围内，测定结果理想，相比传统的检测技术，本发明的检测方法操作简单快速。

实施例6：对电化学DNA传感器的选择性进行检查

为了进一步验证实施例1的电化学DNA传感器具有较好的抗干扰能力，现用实施例1中的传感器分别对含有浓度均为1.0×10^-6M的K⁺、Pb²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Co²⁺、Cr^{3 +}、Al³⁺溶液和含浓度均为1.0×10^-7M的丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(lle)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、酪氨酸(Tyr)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)及谷氨酸(Glu)进行测试(测定方法参照实施例3和实施例4)，测试结果如附图8和附图9所示，由此可见实施例1中的电化学DNA传感器除了对Hg²⁺和Cys有较好的响应外，对其它重金属离子或氨基酸均有较好的抗干扰能力。

以上实施例仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于检测汞离子或半胱氨酸的电化学DNA传感器，包括在三电极体系中用作工作电极的玻碳电极，其特征在于，所述玻碳电极反应端表面修饰有包括自掺杂聚苯胺纳米纤维、有序介孔碳和金纳米粒的组成的复合膜，所述复合膜表面自组装有DNA捕获探针，所述DNA捕获探针的核苷酸序列为SEQIDNO.1的DNA序列。

2.一种如权利要求1所述的电化学DNA传感器的制备方法，包括以下步骤：

S1、修饰自掺杂聚苯胺纳米纤维：在玻碳电极反应端表面滴加自掺杂聚苯胺纳米纤维悬浮液，得到自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极；

S2、修饰有序介孔碳：在所述步骤S1得到的自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面滴加有序介孔碳悬浮液，得到有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极；

S3、电沉积金纳米粒子：在所述步骤S2得到的有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面电沉积金纳米粒子，得到金纳米粒子/有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极；

S4、自组装DNA捕获探针：在所述步骤S3得到的金纳米粒子/有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面滴加DNA捕获探针进行反应，使所述DNA捕获探针通过金硫共价键固定在所述玻碳电极反应端表面，完成所述电化学DNA传感器的制备。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，采用计时电流法将所述金纳米离子沉积在所述有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面，所述计时电流法的沉积电位为0.2V，沉积时间为60s～150s。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4具体为：在所述步骤S3得到的金纳米粒子/有序介孔碳/自掺杂聚苯胺纳米纤维修饰的玻碳电极反应端表面滴加DNA捕获探针，在4℃下反应12h；然后转入6-巯基乙醇溶液中培养0.5h～1h，完成所述电化学DNA传感器的制备。

5.一种权利要求1所述的电化学DNA传感器或采用权利要求2至4任一项所述制备方法制得的电化学DNA传感器在检测汞离子中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测汞离子的应用方法包括以下步骤：

(1)将所述电化学DNA传感器的玻碳电极反应端浸泡在含汞离子的待测溶液中反应，使所述电化学传感器上的DNA捕获探针与待测溶液中的汞离子形成T-Hg²⁺-T错配；

(2)将所述电化学DNA传感器转入含信号指示剂AQDS的溶液中，使所述AQDS插入DNA双链中；

(3)以经过所述步骤(2)处理过后的玻碳电极作为工作电极，置于含NaCl的PBS缓冲液中，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，采用差分脉冲伏安法测试；根据汞离子浓度与峰电流变化关系构建检测线性回归方程，根据线性回归方程计算待测溶液中的汞离子浓度。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述汞离子浓度与峰电流变化关系的检测线性回归方程为：

y₁＝-9.147x₁+164.597(1)

式中，y₁表示峰电流与背景峰电流的差值，即ΔIp，单位为μA；x₁为待测溶液中汞离子浓度负对数值，即-log[Hg²⁺]，汞离子浓度的单位为M；式(1)的相关系数R²＝0.9934，汞离子检测线性范围为1×10^-6M～1×10^-14M，检测下限为6.152×10^-16M。

8.一种权利要求1所述的电化学DNA传感器或采用权利要求2至4任一项所述制备方法制得的电化学DNA传感器在检测半胱氨酸中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测半胱氨酸的应用方法包括以下步骤：

(1)将所述电化学DNA传感器的玻碳电极反应端浸泡在含汞离子的溶液中反应，使所述电化学传感器上的DNA捕获探针与溶液中的汞离子形成T-Hg²⁺-T错配；

(2)将所述电化学DNA传感器转入含信号指示剂AQDS的溶液中，使所述AQDS插入DNA双链中；

(3)将所述电化学DNA传感器转入含半胱氨酸的待测溶液中；

(4)以经过所述步骤(3)处理后的玻碳电极作为工作电极，置于含NaCl的PBS缓冲液中，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，采用差分脉冲伏安法测试；根据半胱氨酸浓度与峰电流变化关系构建检测线性回归方程，根据线性回归方程计算待测溶液中的半胱氨酸浓度。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，当所述汞离子浓度为100nM时，所述半胱氨酸浓度与峰电流变化关系的检测线性回归方程为：

y₂＝10.017x₂–36.047(2)

式中，y₂表示峰电流，即I_p，单位为μA；x₂为溶液中半胱氨酸浓度负对数值，即-log[Cys]，半胱氨酸浓度的单位为M；式(2)的相关系数R²＝0.9895，半胱氨酸检测线性范围为1×10^-7M～1×10^-11M，检测下限为1×10^-13M。