CN106841349A - 一种用于汞离子检测的适配体传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于汞离子检测的适配体传感器及其制备方法和应用。所述的传感器包括基底玻碳电极，基底玻碳电极表面沉积有纳米金颗粒，纳米金颗粒表面修饰己二硫醇，纳米金‑适配体结合物通过Au‑S键的自组装作用修饰到电极表面的纳米金颗粒上。由于采用了双层纳米金修饰，具有较强的放大效应，因此检测汞离子的灵敏度超高，可达1.1pg/mL，线性范围为5～2000pg/mL；同时由于所采用适配体具有很强的特异性，因此抗干扰能力强，200倍浓度的Ag+、Ba2+、Cd2+、K+、Na+、Pb2+、Cu2+等离子均无干扰。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测和分析化学技术领域，涉及一种用于汞离子检测的适配体传感器及其制备方法和应用。
背景技术
汞是一种剧毒的全球性环境污染物，严重危害环境和人类健康。汞污染大多数来源于固体废物焚烧和化石燃料的燃烧，能在大气中长期稳定存在，从而严重污染了一些水源和土壤。而且，无机汞能在海洋环境中的一些微生物作用下转化为毒性更大的甲基汞，并在食物链的各个环节中积累，最终通过食物链进入人体，会沉积在脑、肝和其它器官中，产生慢性中毒，损害肾、脑、胃和肠道，甚至引起死亡。因此，对环境、食品中痕量汞的检测十分重要，简单快速、高灵敏、高选择性的检测汞的方法备受关注。目前汞离子的主流检测方法主要有原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)、电感耦合等离子质谱法(ICP-MS)、电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)等。虽然这些方法的准确度较高，但往往需要大型的仪器设备，且成本比较高，处理过程繁琐耗时，不能满足实际监测中高效低成本的需要。
适配体是一种能特异识别检测对象的短链核酸，因具有结构固定、易批量生产、无需动物免疫、特异性强等优点，近年来在金属、小分子污染物、肿瘤标志物、病毒等的检测领域引起了极大关注。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于汞离子检测的适配体传感器。
本发明的另一目的是提供一种上述适配体传感器的制备方法。
本发明的再一目的是提供一种上述适配体传感器在汞离子超灵敏检测中的应用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种用于汞离子检测的超灵敏适配体传感器，包括基底玻碳电极，所述基底玻碳电极表面沉积有纳米金颗粒，纳米金颗粒表面修饰己二硫醇，纳米金-适配体结合物通过Au-S键的自组装作用修饰到电极表面的纳米金颗粒上。
所述纳米金-适配体结合物采用以下方法制备：
将适配体溶于氯化三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸混合缓冲溶液，再加入三(2-羧乙基)膦激活适配体的巯基，然后加入到制备好的纳米金溶液中，反应结束后分多次缓慢加入NaCl溶液，室温静置48小时后高速离心，弃去上清液将下层溶于制备好的纳米金溶液，制得所述纳米金-适配体结合物。
所述适配体为5-巯基修饰适配体，其核苷酸序列为：
5-SH-(CH2)6-TTCTTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTTGTT-3。
该核苷酸序列记载于Talanta 113(2013)26–30。
所述适配体传感器采用以下方法制备：
(1)将清洁干净的基底玻碳电极浸入氯金酸溶液中，采用恒电位法将氯金酸电化学还原为纳米金颗粒从而沉积于玻碳电极表面；
(2)将沉积纳米金颗粒的玻碳电极置于摩尔浓度为1mmol/L的己二硫醇溶液中，通过自组装的方法在纳米金颗粒表面修饰己二硫醇；
(3)在经步骤(2)处理过的电极表面滴涂纳米金-适配体结合物，通过Au-S键的自组装作用将纳米金-适配体修饰到电极表面的纳米金颗粒上，制得纳米金/己二硫醇/纳米金/适配体修饰的适配体传感器。
基于上述的适配体传感器在汞离子超灵敏检测中的应用，包括以下步骤：
(Ⅰ)标准溶液的配制：配制含有汞离子且pH为1.0的硝酸溶液，作为标准溶液；
(Ⅱ)工作曲线的建立：将前述适配体传感器浸入步骤(Ⅰ)所述标准溶液中进行孵育，用Tris-HCl缓冲液冲洗干净后置于含有K3[Fe(CN)6]的KCl溶液中进行电化学阻抗谱扫描，作出Nyquist图并计算出其电极表面的电荷转移电阻Rct；将适配体传感器在汞离子浓度为0的标准溶液中孵育所得的Rct值记为R0，将适配体传感器在含有汞离子的标准溶液中孵育所得的Rct值记为Rx，Rct的变化值ΔRct等于Rx与R0的差值；将所述ΔRct与汞离子标准溶液的浓度对数值lgC绘制成ΔRct-lgC工作曲线，采用线性回归法得到ΔRct-lgC线性回归方程；
(Ⅲ)汞离子的检测：配制含有汞离子的待测样品，按照与步骤(Ⅱ)相同的方法对适配体传感器进行孵育和电化学阻抗谱扫描，计算得到Rct的变化值ΔRct，根据ΔRct-lgC线性回归方程，计算得到待测样品中汞离子的浓度C。
将本发明提供的适配体传感器用于汞离子的检测，具有超高的灵敏度，其检测限可达1.1pg/mL，线性范围为5～2000pg/mL。
本发明具有如下的有益效果：本发明的适配体传感器由于采用了双层纳米金修饰，具有较强的放大效应，因此检测汞离子的灵敏度超高，可达1.1pg/mL；同时由于所采用适配体具有很强的特异性，因此抗干扰能力强，200倍浓度的Ag+、Ba2+、Cd2+、K+、Na+、Pb2+、Cu2+等离子均无干扰。
附图说明
图1为适配体传感器对汞离子标准溶液进行检测的EIS曲线图。
图2为电荷转移电阻的变化值ΔRct与汞离子浓度对数值lgC的工作曲线图。
图3为抗干扰实验结果示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1纳米金-适配体结合物的制备
1)将10ml已制备好的纳米金溶液置于10ml的离心管中，在转速为12000转/分下离心15分钟后弃去上层清液，下层清液溶于10ml的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中，置于4℃冰箱中备用；
2)将适配体溶于TE缓冲溶液(0.1mmol/L)，向其中加入2μl的TCEP溶液(10mmol/L)，室温反应2小时；
3)将巯基已活化的适配体溶液加入到1ml步骤1)所述的纳米金溶液中，室温下反应16小时，分多次向其中缓慢滴加NaCl溶液直至NaCl最终浓度为0.1mol/L，加入过程中要注意防止纳米金聚沉；
4)将步骤3)中所述的溶液在室温下反应48小时，转速12000转/分离心30分钟，弃去上清液，将残余物溶于1ml步骤1)所述的纳米金溶液，置于4℃冰箱中备用。
实施例2对汞离子标准样品的检测
1)适配体传感器的制备：
将直径为3mm的玻碳电极用0.3μm的氧化铝粉末在抛光绒布上打磨，用蒸馏水冲洗干净后，依次在无水乙醇-蒸馏水(V/V＝1/1)、蒸馏水中超声30s。将上述电极插入3mmol/L的氯金酸溶液中进行恒电位电化学沉积(电压为-0.2V，沉积时间60s)，用去离子水冲洗干净后浸入浓度为1mmol/L的己二硫醇溶液中，置于37℃下反应1小时。将上述电极用去离子水冲洗干净后在其表面滴涂20μl实施例1中所述的纳米金-适配体溶液，置于4℃冰箱中孵育24小时，即可得到纳米金/己二硫醇/纳米金/适配体修饰的适配体传感器；
2)汞离子标准样品的检测
将步骤1)中所述的适配体传感器浸入含有一系列不同浓度(包括浓度为零)的汞离子标准溶液中，在37℃孵育30分钟，用Tris-HCl缓冲液冲洗干净后置于含有2mmol/L的K3[Fe(CN)6]的KCl溶液(0.1mol/L)中进行电化学阻抗谱(EIS)扫描，作出Nyquist图并计算出其电极表面的电荷转移电阻(Rct)。EIS曲线图如图1所示，图中曲线从下到上浓度依次为0pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL和2000pg/mL。将汞离子浓度为零时所得的Rct值记为R0，含有一定汞离子标准物质时所得的Rct值记为Rx，Rct的变化值ΔRct等于Rx与R0的差值；将所述ΔRct与汞离子标准物质的浓度对数值lgC(pg/mL)绘制成ΔRct-lgC工作曲线。工作曲线图如图2所示，采用线性回归法得到其ΔRct-lgC线性回归方程为ΔRct(Ω)＝-31.33+634.93lgC(pg/mL)，汞离子的浓度在5～2000pg/mL范围内ΔRct与lgC成正比，线性相关系数为0.9945。以空白标样测定值标准偏差的3倍(3σ)作为样品检测限，重复10次实验得出，以上述方法检测汞离子的样品检测限为1.1pg/mL。将待测样品在上述条件下进行孵育和扫描并计算出其电荷转移电阻Rct；根据Rct的变化值ΔRct和ΔRct-lgC线性回归方程，可计算出待测样品中汞离子的浓度C。
实施例3湖水中加标汞离子的测定
量取2.0ml湖水样品，湖水取自南师大校园内湖，加入不同体积的汞离子标准溶液配制成一系列含有不同浓度汞离子且总体积均为10.0ml的待测样。将实施例2步骤1)所述的适配体传感器浸入到上述待测样中，在37℃孵育30分钟，用Tris-HCl缓冲液冲洗干净后置于含有2mmol/L的K3[Fe(CN)6]的KCl溶液(0.1mol/L)中进行电化学阻抗谱(EIS)扫描，以与实施例2中步骤2)相同的方法得到的电荷转移电阻变化值ΔRct及ΔRct-lgC工作曲线，计算出汞离子的浓度C，检测回收率结果如表1。
表1为适配体传感器检测加标湖水中的汞离子浓度的回收率
| 汞离子添加量(ng/mL) | 汞离子测定量(ng/mL) | 回收率(％) |
| 0.1 | 0.0812，0.0969，0.0877 | 81.2，96.9，87.7 |
| 0.4 | 0.434，0.337，0.361 | 108.5，84.2，90.3 |
| 1.2 | 1.24，1.11，1.31 | 103.3，92.5，109.2 |
实施例4抗干扰能力实验
配制一系列浓度较高的其他离子的标准溶液，如Ag+、Ba2+、Cd2+、K+、Na+、Pb2+、Cu2+等离子，其浓度均为1000ng/mL。将实施例2步骤1)所述的适配体传感器分别浸入到上述干扰离子的标准溶液中，采用与实施例2中步骤2)相同的方法得到的电荷转移电阻变化值ΔRct与汞离子检测样(浓度为5ng/mL)所得的ΔRct作比较，抗干扰实验结果如图3所示，发现这些离子基本无干扰(浓度200倍)。
Claims (5)
1.一种用于汞离子检测的适配体传感器，包括基底玻碳电极，其特征在于，所述基底玻碳电极表面沉积有纳米金颗粒，纳米金颗粒表面修饰己二硫醇，纳米金-适配体结合物通过Au-S键的自组装作用修饰到电极表面的纳米金颗粒上。
2.根据权利要求1所述的一种用于汞离子检测的适配体传感器，其特征在于，所述纳米金-适配体结合物采用以下方法制备：将适配体溶于氯化三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸混合缓冲溶液，再加入三(2-羧乙基)膦激活适配体的巯基，然后加入到制备好的纳米金溶液中，反应结束后分多次缓慢加入NaCl溶液，室温静置48小时后高速离心，弃去上清液将下层溶液溶于制备好的纳米金溶液，制得所述纳米金-适配体结合物。
3.根据权利要求2所述的一种用于汞离子检测的适配体传感器，其特征在于，所述适配体为5-巯基修饰适配体，其核苷酸序列为：
5-SH-(CH2)6-TTCTTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTTGTT-3。
4.权利要求1所述的用于汞离子检测的适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将清洁干净的基底玻碳电极浸入氯金酸溶液中，采用恒电位法将氯金酸电化学还原为纳米金颗粒从而沉积于玻碳电极表面；
(2)将沉积纳米金颗粒的玻碳电极置于摩尔浓度为1mmol/L的己二硫醇溶液中，通过自组装的方法在纳米金颗粒表面修饰己二硫醇；
(3)在经步骤(2)处理过的电极表面滴涂纳米金-适配体结合物，通过Au-S键的自组装作用将纳米金-适配体修饰到电极表面的纳米金颗粒上，制得纳米金/己二硫醇/纳米金/适配体修饰的适配体传感器。
5.基于权利要求1所述的适配体传感器在汞离子超灵敏检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(Ⅰ)标准溶液的配制：配制含有汞离子且pH为1.0的硝酸溶液，作为标准溶液；
(Ⅱ)工作曲线的建立：将权利要求1所述的适配体传感器浸入步骤(Ⅰ)所述标准溶液中进行孵育，用Tris-HCl缓冲液冲洗干净后置于含有K3[Fe(CN)6]的KCl溶液中进行电化学阻抗谱扫描，作出Nyquist图并计算出其电极表面的电荷转移电阻Rct；将适配体传感器在汞离子浓度为0的标准溶液中孵育所得的Rct值记为R0，将适配体传感器在含有汞离子的标准溶液中孵育所得的Rct值记为Rx，Rct的变化值ΔRct等于Rx与R0的差值；将所述ΔRct与汞离子标准溶液的浓度对数值lgC绘制成ΔRct-lgC工作曲线，采用线性回归法得到ΔRct-lgC线性回归方程；
(Ⅲ)汞离子的检测：配制含有汞离子的待测样品，按照与步骤(Ⅱ)相同的方法对适配体传感器进行孵育和电化学阻抗谱扫描，计算得到Rct的变化值ΔRct，根据ΔRct-lgC线性回归方程，计算得到待测样品中汞离子的浓度C。
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