CN107271502A - 一种光致电化学传感器及测定dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种光致电化学传感器及测定DNA的方法。在金电极上修饰nanoWS2，得WS2/GE；当捕获DNA滴加到WS2/GE上后，得ssDNA/WS2/GE，即光致电化学传感器；然后将ssDNA/WS2/GE插入到含目标DNA的溶液中孵化，室温下进行杂交反应后；将电极插入含有氨基酸的磷酸盐缓冲溶液中检测光致电化学信号；利用DNA杂交前后电极的光致电化学信号变化实现对目标DNA的高灵敏度检测。方法具有简单、灵敏度高的优势。

Description

一种光致电化学传感器及测定DNA的方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种光致电化学传感器及测定DNA 的方法。
背景技术
近几十年，食品、环境、安全等问题不断出现，科研工作者发现，人类许多遗传疾病与DNA分子中碱基变异有关，DNA作为遗传信息的载体，具有储存和传递信息的重要功能。因此利用DNA分子间的碱基互补配对原理发展起来的各种DNA传感器技术，在卫生防疫、医学诊断、药物研究、环境科学及生物工程等领域发挥着越来越重要的作用。目前，现有的大多检测DNA的方法都需要标记物的参与，这样使实验变得繁琐复杂。因此开发一种新型的免标记的灵敏检测DNA的方法迫在眉睫。鉴于现有技术的不足，本发明基于 nanoWS2纳米材料设计了一种光致电化学DNA传感器，建立了一种光致电化学传感器及测定DNA的方法。方法具有灵敏度高、选择性好、操作简单的特点。
发明内容
本发明旨在发明一种方法简单、灵敏度高的测定DNA的方法。
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种光致电化学传感器及测定DNA的方法。
实现本发明目的技术方案是：
一种光致电化学传感器及测定DNA的方法。其原理是在经α-Al2O3抛光粉抛光的金电极上，滴加nanoWS2纳米材料，形成nanoWS2修饰金电极，即 WS2/GE；当捕获DNA滴加到WS2/GE上后，通过捕获DNA与nanoWS2作用将捕获DNA吸附到电极表面，得ssDNA/WS2/GE，即光致电化学传感器；然后将ssDNA/WS2/GE插入到含目标DNA的溶液中孵化，室温下进行杂交反应，目标DNA与捕获DNA形成双链DNA，杂交后所形成的双链DNA与nanoWS2表面间的作用力变弱，所形成的双链DNA从电极表面脱落；将电极插入含有氨基酸的磷酸盐缓冲溶液中检测光致电化学信号；利用DNA杂交前后电极的光致电化学信号变化实现对目标DNA的高灵敏度检测。
本发明是通过以下措施来实现的：一种光致电化学传感器及测定DNA的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)光致电化学传感器制备；
(2)光致电化学DNA检测；
优选的，所述的光致电化学传感器制备包括以下步骤：
a.电极预处理：金电极经α-Al2O3抛光粉抛光后，用三次蒸馏水冲洗干净，在乙醇、三次蒸馏水中分别超声清洗3-5min，用高纯氮气吹干备用。
b.NanoWS2的预处理：nanoWS2通过超声处理后再使用，其操作过程为，称取10mgnanoWS2分散于0.1mL～10.0mL三次蒸馏水中，超声1min～20min，得到均匀分散液，制备好的nanoWS2分散液放置在4℃冰箱中备用。
c.NanoWS2修饰电极的制备：取10μL～80μL nanoWS2分散液滴加在经抛光处理后的金电极表面上，在室温条件下自然干燥并过夜，即可得到nanoWS2修饰金电极，标记为WS2/GE，制备好的nanoWS2修饰金电极放置在4℃冰箱中备用。
d.传感器制备：将10μL～50μL含有1.0×10-9mol/L的捕获DNA的PBS 缓冲溶液(pH7.4)滴加在WS2/GE上，室温条件下反应0.5～6h，通过捕获 DNA与nanoWS2作用将捕获DNA吸附到电极表面，反应结束后，用三次蒸馏水冲洗电极，除去未固定的捕获DNA，实现捕获DNA在WS2/GE上的固载，即得光致电化学传感器。标记为ssDNA/WS2/GE。
优选的，所述的光致电化学DNA检测包括以下步骤：
a.将ssDNA/WS2/GE插入10μL～100.0μL含目标DNA的溶液中孵化，室温下杂交反应0.2h～2h，目标DNA与捕获DNA形成dsDNA。杂交后所形成的 dsDNA与nanoWS2表面间的作用力变弱，从电极表面脱落，将所得电极依次用 0.2％的SDS溶液、三次蒸馏水清洗以除去dsDNA，标记为dsDNA/WS2/GE。
b.开启电化学工作站，5s～100s后打开LED灯，每2s～20s开关一次LED 灯，偏压设置为-0.2V到0.5V(vs-SCE)，将GE、WS2/GE、ssDNA/WS2/GE 以及dsDNA/WS2/GE电极插入含有氨基酸的磷酸盐缓冲溶液中，采用光致电化学方法作为检测手段，根据光致电化学信号的大小实现对目标DNA的检测。
所述的捕获DNA:5'-ATG GGC GGCATG AAC-3'；目标DNA:5'-GTT CAT GCC GCCCAT-3'。
所述的目标DNA为肺癌特异性DNA。
优选的，光致电化学检测检测液中氨基酸的为甲硫氨酸时，光致电化学信号最大，得到最低的DNA检出限。
附图说明
图1光致电化学传感器的构建与DNA检测过程示意图。
图2不同工作电极的光致电化学信号。A图为光致电化学信号曲线图，a, GE；b,WS2/GE；c,dsDNA/WS2/GE；d,ssSDNA/WS2/GE；B图为光致电化学信号柱状图。
图3目标DNA浓度与光致电化学信号关系。A图为光致电化学信号曲线图； B图为光致电化学信号与浓度线性关系。从a到g依次为WS2/GE空白信号，当 tDNA浓度为1×10-14,1×10-15,1×10-16,1×10-17,1×10-18,0moL/L时传感器的响应信号。
图4不同氨基酸光致电化学信号。
具体实施方式
下面的实例将进一步说明本发明的操作方法，但不构成对发明的进一步限制。
实例1：一种光致电化学传感器及测定DNA的方法
1.实验部分
1.1仪器与试剂
1.1.1仪器设备
将光源系统与电化学工作站CHI-830D联用(上海辰华仪器有限公司)作为 PEC检测系统；采用三电极系统进行电化学测试，参比电极是232型饱和甘汞电极(SCE)，辅助电极是213型铂丝电极(上海雷磁仪器厂)，高速离心机
(Anke-TGL-16C飞翁牌，上海市安亭科学仪器厂)。
1.1.2试剂
NanoWS2购买于Sigma；甲硫氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)、苏氨酸 (Thr)、丝氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸 (Ala)、半胱氨酸(Cys)、胱氨酸(Cysteine)购买于上海生物工程有限公司；三(2-羧乙基)膦(TCEP)、十二烷基硫酸钠(SDS)购买于国药集团化学试剂有限公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)购买于天津迪博化工股份有限公司；乙二胺四乙酸(EDTA)购买于上海生物工程有限公司。实验中所使用的试剂均为分析纯，水为三次蒸馏水。
0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)由0.2mol/L十二水合磷酸氢二钠和0.2 mol/L二水合磷酸二氢钠按比例配制，其中含有0.1mol/L氯化钾。
所用到的DNA由上海生工生物工程有限公司合成，序列为：捕获DNA (cDNA):5'-ATG GGC GGCATG AAC-3'；目标DNA(tDNA):5'-GTT CAT GCC GCC CAT-3'
1.2光致电化学传感器制备
a.金电极的预准备：金电极(GE)经粒径为1.0μm、0.3μm、0.05μm的α-Al2O3抛光粉抛光后，用三次蒸馏水冲洗干净，经乙醇，三次蒸馏水分别超声清洗3-5min，高纯氮气吹干备用。
b.NanoWS2的预处理：nanoWS2通过超声处理后再使用，其操作过程为，分别称取10mg nanoWS2分散于4mL三次蒸馏水中，超声20min，得到均匀分散液。制备好的nanoWS2分散液放置在4℃冰箱备用。
c.NanoWS2修饰金电极制备：取50.0μL nanoWS2分散液滴加在经抛光处理的金电极表面上，在室温条件下自然干燥并过夜，即可得到nanoWS2修饰金电极，标记为WS2/GE。制备好的nanoWS2修饰金电极放置在4℃冰箱备用。
d.传感器制备：将20.0μL含有1.0×10-9mol/L的cDNA的PBS缓冲溶液 (pH 7.4)滴加在WS2/GE上，室温条件下反应3.5h，通过cDNA与nanoWS2吸附作用将cDNA吸附到电极表面，反应结束后，用三次蒸馏水冲洗电极，除去未固定的cDNA，实现cDNA在WS2/GE上的固载，即得光致电化学传感器，标记为ssDNA/WS2/GE。
1.3光致电化学检测
a.将ssDNA/WS2/GE插入50.0μL一系列1.0×10-19mol/L、1.0×10-18 mol/L、1.0×10-17mol/L、1.0×10-16mol/L、1.0×10-15mol/L、1.0×10-14mol/L、 1.0×10-13mol/L不同浓度tDNA的溶液中孵化，室温下杂交反应1h，tDNA与 cDNA形成dsDNA；杂交后所形成的dsDNA与nanoWS2表面间的作用力变弱，从电极表面脱落，反应结束后，依次用0.2％的SDS溶液、三次蒸馏水清洗电极除去dsDNA；
b.开启电化学工作站，50S后打开LED灯，每10s开关一次LED灯，偏压设置为-0.2V～0.5V(vs-SCE)，将GE、WS2/GE、ssDNA/WS2/GE以及 dsDNA/WS2/GE工作电极插入含有1mM一种氨基酸的PBS溶液中，采用光致电化学方法作为检测手段，实现对目标DNA的检测。
实例2：光致电化学检测检测液中氨基酸的选择
将目标DNA的样品溶液按实例1步骤1.3方法进行实验，将GE、WS2/GE、 ssDNA/WS2/GE以及dsDNA/WS2/GE工作电极插入含有1mM Met的PBS溶液中，采集光致电化学信号。
按上述方法将Met替换成Lys、Thr、Ser、Arg、Leu、Val、Ile、Pro、Phe、 Glu、Ala、Cys、Cysteine采集光致电化学信号。比较不同光致电化学检测检测液中氨基酸的种类时光致电化学信号大小，结果如图4所示，表明Met存在时，有最大的光致电化学信号。
实例3：传感器分析特性
将目标DNA配制成一系列1.0×10-18mol/L、1.0×10-17mol/L、1.0×10-16 mol/L、1.0×10-15mol/L、1.0×10-14mol/L的溶液按实例1步骤1.3方法进行实验，氨基酸选用Met，根据光致电化学信号得标准曲线。本发明研究了不同浓度tDNA与光致电化学信号强度之间的关系，得到了检测目标物tDNA的标准曲线，线性范围及线性方程。
当tDNA的浓度在1×10-18mol/L到1×10-14mol/L之间时，随着tDNA的浓度的变化，其光致电化学信号与浓度的对数成良好的线性关系，ΔI/μА＝ 0.4400log(C/M)+7.9960，ΔI＝I–I0，I是ssNDA/WS2/GE工作电极的光致电化学信号，I0是dsDNA/WS2/GE工作电极的光致电化学信号。其中相关系数R2＝ 0.9990，检测限为2.0×10-19mol/L。工作电极制备的重现性通过用11根不同的 ssDNA/WS2/GEs对浓度为2.0×10-17mol/L tDNA进行评估。11次测量结果的相对标准偏差(RSD)为3.6％，这表明本发明的光致电化学传感器具有较好的重现性。氨基酸选用Met时，DNA的检出限最低。
所述的cDNA:5'-ATG GGC GGCATG AAC-3'；tDNA:5'-GTT CAT GCC GCC CAT-3'
实例4：样品分析
将含目标DNA的样品溶液按实例1步骤1.3方法进行实验，根据光致电化学信号和实例3所得标准曲线可以获取目标DNA含量。
根据发明的方法对血液中目标DNA含量进行了测定，并采用标准加入法对方法进行了评价，测定结果如表1所示，样品测定回收率为98.2-102.0％，本发明的方法在DNA检测中具有精密度高的特点。
表1.样品分析测定结果
编号 含量a,b 加入量 总量 回收率
1 1.09 1.00 2.11 102.0％
2 5.28 5.00 10.19 98.2％
3 10.20 10.00 20.24 100.4％
a 7次测量结果
b单位：10-16M 。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛科技大学
<120> 一种光致电化学传感器及测定DNA的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ATGGGCGGCA TGAAC 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工系列
<400> 2
GTTCATGCCG CC CAT 15

Claims (4)

1.一种光致电化学传感器及测定DNA的方法，在经α-Al2O3抛光粉抛光的金电极上，滴加nanoWS2纳米材料，形成nanoWS2修饰金电极，即WS2/GE；当捕获DNA滴加到WS2/GE上后，通过捕获DNA与nanoWS2作用将捕获DNA吸附到电极表面，得ssDNA/WS2/GE，即光致电化学传感器；然后将ssDNA/WS2/GE插入到含目标DNA的溶液中孵化，室温下进行杂交反应，目标DNA与捕获DNA形成双链DNA，杂交后所形成的双链DNA与nanoWS2表面间的作用力变弱，所形成的双链DNA从电极表面脱落；将电极插入含有氨基酸的磷酸盐缓冲溶液中检测光致电化学信号；利用DNA杂交前后电极的光致电化学信号变化实现对目标DNA的高灵敏度检测，其特征是包括以下步骤：
(1)光致电化学传感器制备；
(2)光致电化学DNA检测；
优选的，所述的光致电化学传感器制备包括以下步骤：
a.电极预处理：金电极经α-Al2O3抛光粉抛光后，用三次蒸馏水冲洗干净，在乙醇、三次蒸馏水中分别超声清洗3-5min，用高纯氮气吹干备用；
b.NanoWS2的预处理：nanoWS2通过超声处理后再使用，其操作过程为，称取10mgnanoWS2分散于0.1mL～10.0mL三次蒸馏水中，超声1min～20min，得到均匀分散液，制备好的nanoWS2分散液放置在4℃冰箱中备用；
c.NanoWS2修饰电极的制备：取10μL～80μL nanoWS2分散液滴加在经抛光处理后的金电极表面上，在室温条件下自然干燥并过夜，即可得到nanoWS2修饰金电极，标记为WS2/GE，制备好的nanoWS2修饰金电极放置在4℃冰箱中备用；
d.传感器制备：将10μL～50μL含有1.0×10-9mol/L的捕获DNA的PBS缓冲溶液(pH7.4)滴加在WS2/GE上，室温条件下反应0.5～6h，通过捕获DNA与nanoWS2作用将捕获DNA吸附到电极表面，反应结束后，用三次蒸馏水冲洗电极，除去未固定的捕获DNA，实现捕获DNA在WS2/GE上的固载，即得光致电化学传感器，标记为ssDNA/WS2/GE，
优选的，所述的光致电化学DNA检测包括以下步骤：
a.将ssDNA/WS2/GE插入10μL～100.0μL含目标DNA的溶液中孵化，室温下杂交反应0.2h～2h，目标DNA与捕获DNA形成dsDNA，杂交后所形成的dsDNA与nanoWS2表面间的作用力变弱，从电极表面脱落，将所得电极依次用0.2％的SDS溶液、三次蒸馏水清洗以除去dsDNA，标记为dsDNA/WS2/GE，
b.开启电化学工作站，5s～100s后打开LED灯，每2s～20s开关一次LED灯，偏压设置为-0.2V到0.5V(vs-SCE)，将GE、WS2/GE、ssDNA/WS2/GE以及dsDNA/WS2/GE电极插入含有氨基酸的磷酸盐缓冲溶液中，采用光致电化学方法作为检测手段，根据光致电化学信号的大小实现对目标DNA的检测。
2.一种光致电化学传感器及测定DNA的方法，其特征在于所述的DNA序列如下：
所述的捕获DNA:5'-ATG GGC GGCATG AAC-3'；目标DNA:5'-GTT CAT GCC GCC CAT-3'。
3.一种光致电化学传感器及测定DNA的方法，其特征在于所述的目标DNA为肺癌特异性DNA。
4.一种光致电化学传感器及测定DNA的方法，优选的，光致电化学检测检测液中氨基酸的为甲硫氨酸时，光致电化学信号最大，得到最低的DNA检出限。
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